血清谷-丙转氨酶(SGPT)测定(King氏法)(实验)

实验项目名称血清谷－丙转氨酶(SGPT)测定（King
氏法）
一、实验目的要求
1.通过实验加深对转氨作用的认识，了解酶活力测定的基本原理及掌握酶
活力的测定方法。

二、实验原理
1.生物机体内转氨基作用是α-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到α-酮
酸的酮基位置上，生成相应的酮酸与氨基酸的化学反应。

催化这反应的
酶称为转氨酶 (tranuminase), 其辅酶为磷酸毗哆醛。

转氨酶广泛存在
于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（glutamic
pyruvic transaminase,GPT)，谷草转氨酶(glutamic oxalacetic
transaminase, GOT) 活性较高。

在正常新陈代谢过程中，血清内维持一
定水平的转氨酶活性( 即正常值 ) 。

当肝、心、肾等组织发生病变时，
由于组织细胞肿胀, 坏死导致大量的酶释放至血流中，从而引起血清
谷丙转氨酶(GPT) 、谷草转氨酶(GOT) 活性显著升高。

因此测定这
些酶的活性对某些疾病的临床诊断具有重要的参考价值。

本实验用丙
氨酸和α-酮戊二酸为底物(基质液成分)经血清谷丙转氨酶作用生成谷
氨酸及丙酮酸。

丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2,4-二硝基苯腙，
此物在碱性条件下呈棕红色。

根据棕红色的深浅与同样处理的丙酮酸标
准液进行比较，即再计算出酶的活性。

其反应过程如下：
King 氏法谷丙转氨酶活性单位：每毫升血清在37℃与 pH7.4 的基质液作用 60 min，生成l μmol丙酮酸为一个单位。

临床检验取血清量为 0.l ml，报告数据以100 ml血清计算，因此实际测得结果乘1000 即可。

例如
0.l ml丙酮酸标准液中丙酮酸含量为0.2 μmol，即相当于GPT 200
U/100ml血清。

2.丙氨酸氨基转移酶（ALT），又称谷丙转氨酶（GPT）。

催化丙氨酸与α-酮
戊二酸之间的氨基移换反应，是氨基酸代谢中重要部分。

三、实验仪器与试剂
试剂：1.兔血浆
兔心脏抽血约50ml，加抗凝剂，4000rpm，10’，吸取上层血浆，待用。

2.基质液、磷酸缓冲液，丙酮酸，硝基苯肼，0.4mol/LNaOH
试管，移液枪，可见—紫外分光光度计，比色皿
四、实验步骤及结果
取四支试管，按下表加入试剂及样品：
结果计算：
每次测定酶活性时，同时用丙酮酸标准液(2 μmol/ml) 0.1 ml，平行操作，即按上表操作，不做标准曲线，测定A520nm，按下公式计算：
注：0.1mol丙酮酸标准液中丙酮酸含量为0.2μM，即相当于GPT 200U/100ml （0.2U/0.1mL）
所以所测得GPT(U)/100ml 血清= 0.539-0.486 *0.2* 100
0.698-1.428 0.1
这样算出来是负值，应该是实验过程中有失误导致第一组测的A250值过大，出现错误。

（对该失误的探讨会出现在下一部分）
所以我们借了另一组的数据来求得正确范围内的数据，分别是：
GPT(U)/100ml 血清= 0.519-0.461 *0.2* 100
0.686-0.451 0.1
=49.36(U)/100ml
五、分析与讨论
1.实验数据中测得第一组标准空白管的A250值明显偏高，以至于实验失败，
探究原因？实验过程中还有那些不规范操作？
经过对整体实验过程的复盘和检查过后，发现了以下问题
○1可能是在第二轮加硝基苯肼的时候，移液枪操作失误，在第一组加硝
基苯肼时吸取液体时将移液枪按死，导致吸取并加入了超过0.5ml的硝
基苯肼。

（主要）
○2可能是在对第一组进行比色时，手指不小心按到了比色皿光面，或者
有液体沾到光面，而未用擦镜纸擦净，导致结果偏高。

○3可能是在进行比色之前，用手握住了第一组管的下端，导致反应物在
体温催化下进一步反应，结果偏大。

其他问题：
实验过程中，由于有些着急，移液枪吸取液体松的太快，导致吸取后枪尖有空气（大概不到0.1ml），可能造成了吸取液体不够的情况，导致结果不准确。

2.为什么第一次水浴保温要求精准的60min？
○1酶的反应特性就是高效，较短时间就能产生大量产物，如果不保证所
有试管都是准确的60min而出现时间区别，可能导致反应进度明显不同，
无法测得同样进度下A250，从而导致酶活性测得不准确。

○2剩下一次水浴不用保证非常精准是因为第二次是用于丙酮酸和硝基
苯肼反应，没有酶催化，且之前的酶促反应已经进行的较为彻底，所以反
应时间对实验结果的影响较小，不用保持非常精准的反应时间。