高效液相色谱法测定血红蛋白氧载体中残留的戊二醛-精品

高效液相色谱法测定血红蛋白氧载体中残留的
戊二醛-精品
2020-12-12
【关键字】情况、思路、方法、条件、领域、系统、充分、平衡、良好、保持、建立、发现、研究、关键、稳定、热点、需要、体系、载体、标准、结构、水平、速度、关系、检验、分析、调节、满足、保证、优化
作者：严坤平景小丹韩静但宁陈超
【摘要】建立了一种测定血红蛋白氧载体中戊二醛残余含量的高效液相色谱方法。

用10 kDa超滤膜通过离心3000 r/min×20 min将游离戊二醛从待测样品中分离;在pH 1.0时，在含有70%乙腈的体系中用2，4二硝基苯肼在30 min内将戊二醛衍生成2,4二硝基苯腙(n(2,4二硝基苯肼)∶n(戊二醛)=60∶1)，以70%乙腈为流动相，避免了衍生产物生成沉淀。

用高效液相色谱法分离测定衍生物，可在20 min内完成分离，同时对衍生步骤进行了优化。

本方法具有较高的灵敏度和良好的线性关系，检出限为1.0 ng，在0.1～10 mg/L范围内其线性相关系数为0.9999，重复测定6次的相对标准偏差小于3.0%，回收率为95.26%。

【关键词】戊二醛, 高效液相色谱, 血红蛋白氧载体, 2,4二硝基苯肼
1 引言
血红蛋白氧载体(Hemoglobin based oxygen carriers，HBOCs)是血液替代品中热点研究领域之一[1,2]。

其常用的一种制备方法是以多醛基分子为交联剂，如戊二醛，开环棉籽糖等将血红蛋白交联制备而成[3，4]。

游离的戊二醛有一定的毒性，在临床使用前必须
除去。

检测醛类气相色谱[5～7]具有较高的分析速度，但是灵敏度相对较低[8]。

高效液相色谱被广泛应用于醛的测定[9～11]，在测定戊二醛时，显示出更高的灵敏度[8]。

在液相色谱法中，2,4二硝基苯肼(2,4dinitrophenylhydrazine, DNPH)柱前衍生法是测定醛基的强有力的工具之一。

文献报道大多是测定空气中戊二醛的污染，未见测定血红蛋白氧载体中戊二醛的报道。

《中国生物制品规程》中测定无细胞百日咳、白喉、破伤风联合疫苗中戊二醛的方法[12]不能直接用于血红蛋白氧载体中戊二醛的测定，需要对样品进行适当处理，且线性关系较差。

因此, 本实验对测定血红蛋白氧载体中残留戊二醛的方法进行了进一步的研究。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)，包括SCL10Avp控制器，SPD10Avp检测器，LC10Atvp双泵，DGU10A脱气系统，CTO10Asvp柱温箱，Class vp工作站;CBN 830恒温水浴(丹麦Heto公司)。

5804 R离心机(德国Eppendorf公司)，10 kDa超滤膜(美国Millipore公司)，Sigo TCIⅡ恒流泵(北京思路高公司)，KL UP Ⅱ20超纯水机(台湾艾柯公司)。

2,4二硝基苯肼(98%)、HClO4、25%戊二醛(w/w)购自Sigma公司，乙腈(色谱纯，Fisher公司)。

2.2 实验方法
2.2.1 标准溶液的配制称取2.3760 g DNPH，用20% HClO4溶解并定容至100 mL,配制成浓度为120 mmol/L的贮备液，用20% HClO4稀释至30 mmol/L作为工作液。

2.2.2 无基质血红蛋白(Stroma free hemoglobin, SFH)的制备 SFH的制备程序参见文献[13]的方法。

2.2.3 标准曲线将戊二醛分别稀释成0.1，0.5，1，2，4，6，8和10 mg/L，分别取0.5 mL于5 mL离心管中，加入1.4 mL乙腈，再加入0.1 mL 120 mmol/L DNPH，立即于混旋器上混合均匀，反应30 min后，用有机滤膜过滤后，上样20 μL进行分析。

2.2.4 血红蛋白的聚合过程中戊二醛的测定血红蛋白的聚合参考文献[14]的方法进行，取80 g/L SFH 50 mL，用恒流泵逐滴加入适量的戊二醛(n(SFH)∶n(戊二醛)=1∶10)，待滴加完毕，聚合反应4 h后，加入1.0 mol/L甘氨酸(终浓度0.1 mmol/L)进行终止，1 h 后，加入还原剂二甲胺基硼烷(DMAB)进行还原(n(戊二醛)∶n(DMAB)=1∶6)，反应1 h后，用Ringer′s液作为透析液透析24 h，每6 h换液一次，共换液4次。

4 ℃保存15 d，各取5.0 mL加入到2个超滤膜(10 kDa，Millipore)中[15]，在4 ℃以3000 r/min离心20 min，取下层液体0.5 mL, 按
2.3 色谱条件
Shim pack VP ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm，孔径12 nm, 日本Shimadzu公司);流动相：70%乙腈，流速 1.0 mL/min;检测波长：360 nm。

3 结果与讨论
3.1 目标产物的确定
戊二醛有2个醛基，与DNPH反应后生成的DNPH one有3种可能的异构体：顺顺、顺反、反反异构体。

图1为标准戊二醛衍生后的色谱图。

图1 在乙腈体系中衍生的2,4二硝基苯腙的色谱图
Fig.1 Chromatogram of 2,4dinitrophenylhydrazine(DNPH)ones. The mobile phase is 70% acetonitrile
峰(peak)1. 过量的DNPH( Excess DNPH reagent); 峰(peak)2,3. DNPH ones异构体(DNPH one isomer).有2个明显的目标峰(峰2与3)，应该为DNPH one的其中两种异构体，具体为哪一种异构体还有待于进一步鉴定，第3种异构体没有观测到的原因可能是由于异构体之间结构非常相似，第3种异构体保留时间和另外两种异构体的其中一种相同，也可能是第3种异构体的含量特别少，很难观测到。

在一定范围内用不同浓度的反应物进行分析，该峰2和峰3的峰面积都和戊二醛浓度之间有良好的线性关系，都可用于定量研究。

分析化学第37卷第10期严坤平等：高效液相色谱法测定血红蛋白氧载体中残留的戊二醛
3.2 色谱条件的优化
在酸性情况下，用过量的DNPH充分和醛基反应，此反应的产物2,4二硝基苯腙在水中的溶解度较小，而在乙腈中的溶解度较大，
图2 在50%乙腈体系中进行衍生的2，4二硝基苯腙样品过滤前(a)后(b)色谱图对比
色谱条件和图1相同(Other conditions are the same as described in Fig.1). 峰(peak)1. 过量的DNPH (Excess DNPH reagent);峰(peak)2，3. DNPH ones异构体(DNPH one isomer)。

直接在水中反应或在乙腈比例较小时会使生成的产物产生沉淀。

将6.0 mg/L戊二醛在50%乙腈水溶液中衍生，产物用70%乙腈进行分离，如图2a所示，可以看出2，4二硝基苯腙的色谱峰有明显的拖尾，而将产物过滤后上样(图2b)，则色谱峰无拖尾现象，这说明拖尾是由于沉淀在吸附在色谱柱上，随流动相中重新溶解后再被洗脱下来的缘故。

而若将6.0 mg/L戊二醛在70%乙腈水溶液中衍生，产物仍用70%乙腈进行分离，结果发现，产物过滤和不过滤谱图结果完全相同，都无拖尾现象。

实验证实，戊二醛浓度达到10.0 mg/L时，在70%乙腈水溶液中衍生不会产生沉淀。

本实验室采用文献[12]的方法测定血红蛋白氧载体中的戊二醛时，发现线性关系较差，这就是由于采用的乙腈浓度太低，在衍生较高浓度的戊二醛(>6.0 mg/L)时就会有沉淀产生，沉淀被过滤后导致定量分析不准确。

因此，衍生反应应该在乙腈比例较高的溶液中进行，而且尽可能和流动相比较接近，在70%乙腈溶液中进行衍生可满足10.0 mg/L以下戊二醛的衍生。

流动相中乙腈的比例越大，衍生物洗脱时间就越短，峰形更为尖锐，相应的灵敏度也越高，但是，洗脱时间太短，过量DNPH及杂质的洗脱峰会干扰衍生物的洗脱峰，综合考虑，以70%乙腈溶液为流动相较好。

3.3 衍生条件的优化
在优化衍生条件的实验中，全部采用1.0 mg/L戊二醛为分析物浓度，峰面积以最灵敏的峰3计算。

3.3.1 DNPH和戊二醛的摩尔比 DNPH和戊二醛反应生成希夫碱，该反应不能进行完全，因此通常采用过量的DNPH对戊二醛进行衍生，尽可能将戊二醛定量转化成相应的腙。

本实验在n(DNPH)∶n(戊二醛)为2∶1～120∶1的范围内研究了戊二醛的衍生反应。

实验表明，在70%乙腈，pH=1.0, 在20 ℃反应30 min的条件下，随着DNPH浓度的增大，衍生物的转化率也逐渐增大，当n(DNPH)∶n(戊二醛)≥60∶1时，转化率基本保持不变，此条件可以作为定量分析的条件。

本实验采用n(DNPH)∶n(戊二醛)=60∶1进行衍生。

3.3.2 pH值在乙腈中，HClO4比HCl的溶解性更好 [16]，因此，本实验采用HClO4调节反应体系的酸度。

为了操作和计算方便，近似认为[H+]≈[HClO4]。

本实验在上述条件下改变pH值，研究了pH 值对衍生反应的影响。

如图3所示，pH 1.0时，戊二醛的衍生反应转化率最高。

图3 pH对衍生效率的影响
Fig.3 Effects of pH of medium on conversion efficiency of glutaraldehyde to its DNPH ones n(DNPH)∶n(戊二醛，glutaraldehyde)=60∶13.2.3 反应温度分别在0， 10， 20和30 ℃的条件下研究了温度对衍生反应转化效率的影响，结果各温度下衍生物的峰面积分别为166702， 184363， 187247， 180590，除在0 ℃下面积略小外，其余温度下的面积均非常接近，说明在10～30 ℃的
范围内反应基本不受温度影响。

因此，本实验在室温下进行。

3.2.4 反应时间在80 min内研究了反应时间对转化效率的影响。

结果表明，随着反应时间的延长，转化效率逐渐增大，在反应20 min后，衍生反应达到平衡，衍生产物的浓度基本保持不变。

为保证本方法的耐用性，衍生时间选择30 min。

3.3 工作曲线、检测限和精密度
戊二醛浓度在0.1～10 mg/L范围内与单峰面积呈线性关系，其标准曲线为y=109306x-7405.1，相关系数(r) 为0.9999，而如果采用文献[12]的方法，r<0.99。

逐级稀释样品，进样20 μL，当信噪比为3时，戊二醛所对应的浓度为0.05 mg/L，即检出限为1.0 ng。

以1.0 mg/L戊二醛进行衍生，平行6份，每份样品各测定一次，每次进样20 μL，相对标准偏差(RSD)为3.0%。

3.4 标准加入的回收率
采用标准加入法测定回收率。

各取终产品5.0 mL，分别加入到两个10 kDa的超滤膜中，在4 ℃以3000 r/min离心10 min，合并下层超滤液后取0.5 mL，加入0.5 μg(10 μL 0.05 g/L)戊二醛，平行5份，按照 mL超滤液按照，平行5份作为空白对照，进行标准加入实验，计算得平均回收率为95.3%。

戊二醛作为交联剂直接加入终产品中再次会引起聚合反应，所以上述测定回收率的方法是在超滤液中加入戊二醛进行测定，为考虑超滤膜是否对戊二醛产生吸附，进行了下述两个实验，取0.10 mg/L 戊二醛，(1)同样品处理方法进行处理，然后进行色谱分析;(2)直接进
行衍生后进行色谱分析;两个实验各平行10份，对两者峰面积平均值在显著性水平为0.05的情况下进行差异显著性检验，结果两者无显著性差异，说明超滤膜对戊二醛基本无吸附，不会对回收率造成影响。

3.5 终产品中戊二醛的测定
戊二醛和血红蛋白的胺基反应后生成希夫碱结构，希夫碱经过还原后，生成稳定的CN单键，但是，希夫碱是否能被100%还原还不清楚，如果没有完全还原，由于生成希夫碱是可逆反应，在一段时间后，没有被还原的希夫碱会分解产生戊二醛，可以用本方法测定解离下来的戊二醛。

本方法应用于终产品中残余戊二醛的测定，戊二醛浓度低于检出限
【参考文献】
1 Moore E E, Johnson J L, Moore F A, Moore H B. Crit. Care. Clin., 2009, 25: 325～356
2 Chang T M. Crit. Care Clin., 2009, 25: 373～382
3 Tu H, Su Z. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 293: 958～961
4 Eike J H, Palmer A F. Biotechnol. Prog., 2004, 20: 1225～1232
5 Wei Xiao Bing(魏晓兵), Fan Guo Liang(范国梁), Song Wei(宋威), Song Chong Lin(宋崇林), Zhou Wei Yi(周维义), Zhang Zhong Rong(张仲荣). Chinsese J. Anal. Chem.(分析化学)，2005, 33(6): 781～784
6 Sowinski P, Wardencki W, Partyka M. Anal. Chim. Acta, 2005, 539: 17～22
7 Leeuwen S M V, Hendriksen L, Karst U. J. Chromatogr. A, 2004, 1058: 107～112
8 Menet M C, Gueylard D, Fievet M H, Thuillier A. J. Chromatogr. B, 1996, 692: 79～86
9 Kiss G, Varga B, Puchony Z V, Gelencser A, Krivacsy Z, Hlavay J. Talanta, 1999, 48: 755～762
10 Houdier S, Perrier S, Defrancq E, Legrand M. Anal. Chim. Acta, 2000, 412: 221～233
11 Guido L F, Carneiro J R, Santos J R, Almeida P J, Rodrigues J A, Barros A A. J. Chromatogr. A, 2004, 1032: 17～22
12 The State Biological Products Standardization Commission of the People′s Republic of China(中国生物制品标准化委员会). Chinese Requirements for Biological Products(Version of 2000)(中国生物制品规程). Beijing(北京): Chemical Industry Press(化学工业出版社)，2000： 78～79
13 Andrade C T, Barros L A M, Lima M C P, Azero E G. Int. J. Biol. Macromol., 2004, 34: 233～240
14 Elke J H, Palmer A F. Biotechnol. Prog., 2004, 20: 1225～1232
15 Stalikas C D and Konidari C N. Anal. Biochem.，2001，290：108～115
16 Coco F L, Ceccon L, Valentini C, Novenlli V. J. Chromatogr., 1992, 590: 235～240。