动物药僵蚕高温麸炒的科学合理性

动物药僵蚕高温麸炒的科学合理性
该研究旨在通过比较僵蚕麸炒前后总蛋白含量的差异及炒制后黄曲霉素限量的变化，探究动物药僵蚕高温炮制的科学合理性。

采用考马斯亮蓝法测定水溶性蛋白质含量；SDSPAGE法比较僵蚕生品及麸炒僵蚕的蛋白质差异性；柱前衍生高效液相色谱法对样品中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2进行限量检查。

结果显示生僵蚕的水溶性蛋白质质量分数为（47.065±0.249）mg·g-1，麸炒僵蚕的水溶性蛋白质质量分数为（29.756±1.961）mg·g-1；生僵蚕的蛋白质电泳条带和麸炒僵蚕的电泳条带皆约为6条。

在31.90，26.80，18.71，15.00 kDa左右分别有一个蛋白片段，生品丰度大于麸炒品；而在10.18，8.929 kDa处条带麸炒品明显深于生品，即麸炒品蛋白丰度大于生品，推测可能是部分蛋白质降解为小分子多肽所致。

生品中黄曲霉毒素G1，B1，G2，B2的质量分数分别为0.382，0.207，0.223，0.073 μg·kg-1，而麸炒僵蚕中未检出。

以上结果表明动物药僵蚕经过高温麸炒，蛋白质含量下降。

这与炮制缓和药性的目的相吻合，而且僵蚕在麸炒过程中，通过炮制辅料的作用，毒性成分黄曲霉毒素完全被吸附，未检出毒性成分，增加了药材的安全性。

麸炒僵蚕作为一种传统的炮制方法，具有科学合理性。

标签：僵蚕；蛋白含量；SDSPAGE；黄曲霉毒素；HPLC
僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linneaus的幼虫感染（或人工接种）白僵菌而致死的干燥体，具有息风止痉、化痰散结的功效。

僵蚕生品辛散之力较强，药力较猛，并具有一定的腥咸气味，临床用药时，为了矫臭矫味便于服用，多麸炒后入药。

作为以蛋白质为主要成分的动物药[1]，僵蚕极易发霉而致黄曲霉菌滋生[2]。

2010年版《中国药典》中该药材是目前唯一一个需要进行黄曲霉毒素限量检查的动物药。

黄曲霉毒素作为强毒性的真菌代谢产物[34]，是中药长期贮存过程的一大危害。

僵蚕麸炒入药的历史从宋代沿用至今，该传统炮制工艺的科学合理性何在？高温麸炒存在怎样的辅料与药物之间的相互作用？怎样实现中药炮制增效减毒的目的？为了探究麸炒炮制对僵蚕的影响，本文采用Bradford 法和SDSPAGE法分别对其蛋白质含量以及种类的差异进行比较分析，并采用柱前衍生HPLCFLD分别对生僵蚕和麸炒僵蚕进行黄曲霉毒素限量检查，以探究动物药僵蚕高温炮制的科学合理性。

1材料
僵蚕生品由重庆中医院提供。

经首都医科大学中医药学院中药鉴定教研室李佳教授鉴定系蚕蛾科昆虫家蚕 B. mori幼虫感染或人工接种白僵菌Beauverai bassiana （Bals.）Vuillnat而致死的干燥虫体。

Agilent 1200型高效液相色谱仪（Agilent 1260荧光检测器，美国Agilent公司）；UV2450型紫外分光光度计（日本岛津公司）；CP224C型电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；Sigma 114小型台式离心机（SIGMA公司）；VHD150S金属浴，WD945D脱色摇床（北京市六一仪器厂）；电泳槽（BIORAD公司）；PowerPac Basic电泳仪（BIORAD公司）；Odyssey LICOR双色红外激光成像系统（基因
有限公司）；免疫亲和柱（美国Beacon，批号2127C）；Eyela MG2200氮吹仪（东京理化）。

BSA标准蛋白液（批号p1511）；蛋白质marker（Thermo公司，批号26616）；黄曲霉毒素混合对照品溶液（美国SUPELCO公司，批号LB90145，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2质量浓度分别为1.055，0.327，1.082，0.309 mg·L-1）；考马斯亮蓝G250（Amresco）；苯、正己烷、乙腈、电泳缓冲液干粉，丙烯酰胺Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，乙二醇均为电泳纯，水为纯净水。

2方法
2.1制备麸炒僵蚕
先将锅烧热至200 ℃左右，均匀撒入定量麦麸，待起烟时调小火力，加入净僵蚕，急速翻炒至表面呈黄色时出锅，筛去麸皮，放凉。

每100 kg僵蚕，用麦麸10 kg。

2.2僵蚕生品及炮制品的可溶性蛋白含量测定
称取生僵蚕、麸炒僵蚕粉末20 mg，在相同条件下加入1 mL TrisHCl溶液溶解，冷浸过夜，取出12 000 r·min-1离心5 min后取上清液50 μL并用蒸馏水定容至1 mL，加考马斯亮蓝G250 5 mL，于595 nm下用紫外分光光度计测其吸光度后计算2种样品蛋白浓度，平行测定3次。

2.3僵蚕生品及炮制品蛋白SDSPAGE电泳分析
2.3.1蛋白样品的制备取2.2项下提取的僵蚕蛋白溶液，加入适量SDSPAGE 上样缓冲液，最后使每个样品上样的总蛋白含量约一致。

95 ℃金属浴加热5 min，作为蛋白电泳样品，备用。

2.3.2僵蚕生品及炮制品SDSPAGE电泳配制12%分离胶，5%浓缩胶，每孔加样18 μL，先以80 V恒压直至电泳至分离胶，再调为120 V恒定直至溴酚蓝到达凝胶底部，电泳结束。

取出凝胶，用考马斯亮蓝染液染色2 h，隔夜用脱色液（甲醇乙酸水1∶1∶8）缓慢摇动脱色，扫描。

2.4僵蚕生品及麸炒僵蚕中黄曲霉素的检测
2.4.1样品提取精密称取10.000 g僵蚕药材粉末，加入80%甲醇100 mL。

混合物高速搅拌15 min后静置、分层、定性滤纸过滤、收集滤液。

取7 mL滤液，加入43 mL磷酸盐缓冲溶液（0.92 mmol·L-1，pH 7.0）聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（吐温20）溶液得到黄曲霉毒素提取液。

2.4.2样品免疫亲和柱净化取50 mL黄曲霉毒素提取液上免疫亲和柱进行净化。

净化时对柱子加压，保持净化柱流速为2 mL·min-1。

用10 mL蒸馏水冲洗进样后的柱子后，除去柱中残余的水，然后柱子用甲醇洗脱，第1次用1 mL甲醇，常压保持5 min，然后加压洗
脱，最后再用2 mL甲醇洗脱。

2.4.3样品衍生化收集的洗脱液经氮气缓和吹干，残留物中加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸作为衍生化试剂，涡旋混合30 s，40 ℃水浴避光衍生15 min。

衍生液经氮气缓和吹干，残留物中加入200 μL乙腈水（2∶8）溶液，涡旋混合30 s，溶液经0.45 μm滤膜过滤，备用。

2.4.4样品HPLC分析精密吸取上述衍生化的供试品溶液20 μL进样分析，外标法计算含量。

色谱条件：Agilent SBC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）水（B），梯度洗脱（0～6 min，15%～17% A；6～8 min，17%～20% A；8～12 min，20%～25% A；12～19 min，25% A；19～25 min，25%～30% A；25～30 min，30% A；30～35 min，30%～15% A），流速1 mL·min-1，荧光检测器激发波长360 nm，发射波长440 nm，进样量20 μL。

3结果与分析
3.1蛋白含量测定
量取4 g·L-1的标准蛋白原液125 μL，用蒸馏水定容至5 mL，作为标准蛋白溶液备用。

分别吸取标准蛋白溶液0，0.1，0.2，0.4，0.7，0.9 mL，依次分别加入蒸馏水1，0.9，0.8，0.6，0.3，0.1 mL，得到质量浓度分别为0，0.01，0.02，0.04，0.07，0.09 g·L-1的蛋白标准溶液。

分别加入考马斯亮蓝5 mL，在595 nm下用紫外分光光度计测定吸光度。

以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归，得到蛋白质的线性回归方程为Y=6.142 5X+0.044 6，r=0.996 3。

以考马斯亮蓝法对僵蚕生品和麸炒僵蚕进行蛋白质含量测定，结果见表1。

3.2僵蚕生品及炮制品蛋白SDSPAGE电泳分析
僵蚕生品与麸炒僵蚕的蛋白SDSPAGE电泳图谱见图1。

可以看出生僵蚕和麸炒僵蚕蛋白质片段数量一致，皆有6个蛋白条带。

使用Gel pro analyzer软件分析所得凝胶，其结果分析见表2。

在31.90，26.80，18.71，15.00 kDa左右分别有一个蛋白片段，生品丰度大于麸炒品；而在10.18，8.929 kDa处条带麸炒品深于生品，这是蛋白质在高温作用下大分子蛋白降解为小分子多肽导致的结果。

3.3僵蚕生品及麸炒僵蚕中黄曲霉素的检测
3.3.1最低检出限取僵蚕粉末10 g，精密称定，依法制备供试品溶液并测定AFG1，AFB1，AFG2，AFB2的信噪比，根据信噪比S/N≥3为黄曲霉毒素的最低检出限，见表3。

3.3.2标准曲线的绘制精密量取黄曲霉毒素混合对照品0.5 mL，置10 mL量瓶中，用苯乙腈（98∶2）稀释至刻度，作为储备液。

精密量取储备液1 mL，置25 mL量瓶中，用苯乙腈（98∶2）稀释至刻度，即得黄曲霉毒素G1，B1，G2，B2对照品溶液，质量浓度分别为0.052 8，0.054 0，0.015 5，0.016 4 mg·L-1。

分别吸取黄曲霉毒素储备液20，50，100，200，500，1 000 μL制成质量浓度分别为AFG1：0.004 3，0.010 8，0.021 6，0.043 3，0.108 2，0.541 0 mg·L-1；AFG2：0.001 2，0.003 1，0.006 2，0.012 4，0.030 9，0.154 5 mg·L-1；AFB1：0.004 2，0.010 6，0.021 1，0.042 2，0.105 5，0.527 5 mg·L-1；AFB2：0.001 3，0.003 3，0.006 5，0.013 1，0.032 7，0.163 5 mg·L-1。

分别将20 μL不同浓度的黄曲霉毒素对照品溶液进样，获得的色谱图的各峰间的分离度均符合要求，见图2。

将获得的色谱峰面积对黄曲霉素的绝对量作回归得到标准曲线，见表4。

3.3.3日内精密度试验将衍生化后的对照品溶液每隔70 min进样1次，连续进样5次，每次进样20 μL。

以衍生化生成的化合物的峰面积进行计算RSD，结果AFG1，AFB1，AFG2，AFB2 RSD分别为1.6%，0.90%，1.3%，0.90%，表明精密度良好。

3.3.4重复性试验将对照品溶液衍生化后进样1次，进样20 μL。

重复该实验6次，以衍生化生成的化合物的峰面积值进行计算RSD，AFG1，AFB1，AFG2，AFB2 RSD分别为6.1%，5.1%，1.9%，1.9%，参照香港特区政府卫生署公布的中药材标准中的重复性要求（RSD<15%）及欧盟等相关技术要求，上述重复性试验结果良好。

3.3.5稳定性试验在0，4，12，24 h分别进行检测，每次进样20 μL。

以衍生化生成的化合物的峰面积值进行计算，黄曲霉毒素4组分峰面积的RSD分别为6.1%，3.5%，1.1%，5.9%。

表明供试品在24 h内基本稳定。

3.3.6加样回收率试验精密称取僵蚕生品粉末（过2号筛）10 g，共9份，平均分为3组，每组分别精密加入混合对照品贮备液0.3，0.6， 1.2 mL，按2.4项下方法制备低、中、高浓度的供试品溶液，分别进样测定，计算平均回收率，结果见表5。

参照《香港中药材标准》第6册对黄曲霉素检测的相关规定（回收率为50%～120%）和出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规范（SN/T0011995），规定当添加质量浓度小于 1 μg·kg-1时，回收率范围应为50%～120%；当质量浓度水平为1～10 μg·kg-1时，回收率范围应为60%～120%。

可见回收率试验结果良好。

3.3.7样品测定依2.4项下方法制备供试品溶液，对样品进行黄曲霉毒素含量测定。

生僵蚕中AFG1，AFB1，AFG2，AFB2的质量分数分别为（0.382±0.002），（0.207±0.086），（0.223±0.025），（0.073±4讨论
僵蚕经高温麸炒之后，蛋白质质量分数由（47.065±0.249）mg·g-1降为（29.756±1.961）mg·g-1。

研究表明，蛋白质在高温炮制过程中，其吸收的能量
超过了分子间作用力，导致蛋白质空间构象被破坏，维持和稳定空间构象的二硫键、氢键断裂，整个蛋白质的螺旋链被破坏打开，肽链转变成无规卷曲状态，无序结构增加，从而使蛋白质部分变性失活[5]。

明代陈嘉谟《本草蒙筌》记载“麸炒抑酷性”，僵蚕经麸炒之后，蛋白质含量降低，从而使药性得以缓和，与炮制原理相吻合。

2010年版《中国药典》一部规定僵蚕中黄曲霉毒素B1质量分数不得超过5 μg·kg-1，黄曲霉毒素G1，G1，B2，B1的总量不得超过10 μg·kg-1，按此标准，僵蚕生品和麸炒僵蚕的黄曲霉素含量均未超过限量。

麸炒品未检出，说明麸炒对于减少僵蚕中黄曲霉素的污染有一定意义。

分析其原因如下：麸炒为高温条件下辅料与药物的作用过程[6]，高温条件下，会有部分黄曲霉被杀灭，减少了黄曲霉素的生成；动物药体表面已蓄积的黄曲霉毒素极耐高温，即使在100 ℃下加热20 h也不会被破坏，只有在268 ℃以上的高温下才裂解[78]。

因此推测麸炒品中未检出黄曲霉素，可能是在炮制过程中，存在炮制辅料与药材之间的相互作用，麦麸吸附了动物药僵蚕表面的黄曲霉毒素。

炮制辅料吸附降毒主要通过以下几个途径实现：①麦麸中富含膳食纤维，膳食纤维可以吸附一些脂溶性物质[910]，黄曲霉素不溶于水，易溶于甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，属于脂溶性物质[11]，容易被吸附；②麦麸中的多糖、蛋白质，这些物质可以通过氢键、离子键和疏水作用实现吸附[12]；③麦麸表面为不同孔径的多孔结构，具有较大的比表面积，可以强化吸附作用。

麦麸中的膳食纤维具有抗氧化作用[13]。

经过麸炒之后，会有膳食纤维留在僵蚕表面。

抗氧化剂可以抑制黄曲霉的生长，影响黄曲霉毒素的生物合成[1415]，从而使麸炒僵蚕在贮藏过程中也不易被黄曲霉毒素污染。

麸炒僵蚕虽然是一种很传统的炮制方法，但其中仍有很多的科学内涵值得去深入的探讨。

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