糖肝康对糖尿病脂肪肝大鼠肝组织cAMP反应元件结合蛋白表达的影响

糖肝康对糖尿病脂肪肝大鼠肝组织cAMP反应元件结合蛋白
表达的影响
钱秋海;钱卫斌;蔡欣蕊;张静;彭伟
【摘要】目的：观察糖肝康对糖尿病脂肪肝大鼠肝组织cAMP反应元件结合蛋白(CREB)表达的影响,探讨其作用机制。

方法采用链脲佐菌素联合高脂饮食复制糖尿病脂肪肝大鼠模型。

造模成功后随机分为模型组、护肝宁组和糖肝康小、中、大剂量组,每组10只,另取10只正常大鼠作为空白组。

各给药组给予相应药物干预,12周后采用Western blot检测大鼠肝组织CREB的表达。

结果与空白组比较,模型组肝组织CREB表达明显增高(P＜0.01)；与模型组比较,各给药组肝组织CREB表达明显减少(P＜0.01),糖肝康中、大剂量组优于护肝宁组(P＜0.01)。

结论糖肝康可能通过降低CREB表达水平改善肝脏代谢,进而保护肝脏。

%Objective To observe the effect of Tanggankang on the expression of CREB in diabetic-fatty liver rats;To investigate the mechanism of Tanggankang. Methods STZ and feeding high fat forage induced diabetic rats were randomly divided into model group, Huganning group, Tanggankang high dose group, Tanggankang medium dose group, Tanggankang low dose group, 10 rats in each group, with 10 normal rats as control. After 12 weeks of drug intervention, rats were killed, the livers were removed, and the expression of CREB was detected by Western blot. Results Compared with normal group, the level of CREB of model group was significantly decreased
(P<0.01). Compared with model group, Tanggankang low, medium and high dose group significantly decreased the level of CREB (P<0.01).
Conclusion Tanggankang may play an active role in glucose and lipid metabolism by affecting the expression of CREB.
【期刊名称】《中国中医药信息杂志》
【年(卷),期】2015(000)002
【总页数】3页(P71-73)
【关键词】糖肝康;脂肪肝;糖尿病;cAMP反应元件结合蛋白;大鼠
【作者】钱秋海;钱卫斌;蔡欣蕊;张静;彭伟
【作者单位】山东中医药大学附属医院，山东济南 250011;鸟取大学医学部，日本鸟取 683-8503;山东中医药大学第一临床医学院，山东济南 250014;山东中医药大学第一临床医学院，山东济南 250014;山东中医药大学附属医院，山东济南250011
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
在2型糖尿病(T2DM)患者中,非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发病率为70%～90%,而21%～45%的NAFLD患者又伴有糖尿病[1]。

T2DM的主要致病基础为胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)造成的糖脂代谢紊乱,而肝脏又是糖脂代谢的重要靶器官,故T2DM患者易出现脂肪肝、肝纤维化、肝硬化[2]。

前期实验表明,糖肝康能明显改善肝脏结构、脂联素、Ghrelin等指标[3-4],为了进一步验证其作用机制,本研究观察糖肝康对糖尿病脂肪肝模型大鼠肝组织中cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)表达的影响,现报道如下。

1.1 动物与饲料
选取SPF级雄性Wistar大鼠80只,鼠龄6～7周,体质量(200±20)g,动物合格证号：SCXR(鲁)2011- 0003,山东中医药大学实验动物中心提供。

饲养条件：室温18～20 ℃,相对湿度69%,12 h交替照明。

基础饲料(蛋白质20%、碳水化合物53%、脂肪9%)由山东中医药大学实验动物中心提供。

高糖高脂饲料(清洁级),购自北京科澳协力饲料有限公司。

1.2 药物
糖肝康(黄芪、白术、茵陈、黄芩、柴胡、大黄等)由山东中医药大学附属医院药剂科加工而成。

实验时制成糖肝康浓缩煎剂,浓度分别为1、2、4 g/mL。

链脲佐菌素(STZ),Sigma公司,批号020106；护肝宁片,贵州信邦制药股份有限公司,批号20120303041。

1.3 主要试剂与仪器
4×Tris•Cl/SDS,pH 6.8；4×SDS电泳缓冲液；TEMED(N,N,N',N'-四甲基乙二胺)；30%丙烯酰胺/ 0.8%N,N'-亚甲丙烯酰胺；4×Tris•Cl/SDS,pH 8.8；10%过硫酸铵。

分离胶及积层胶溶液,水饱和异丁醇,蛋白质分子量标准混合物,电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件；0.75 mm封边垫片,0.75 mm样品梳子,50 µL微量进样器,恒流电源。

以上均由山东省医学科学院实验室提供。

2.1 造模
取Wistar大鼠70只,以普通动物饲料适应性喂养3 d后改高糖高脂饲料喂养,6周后,禁食l2 h,断尾取血并用美国强生血糖仪测空腹血糖。

按30 mg/kg体质量腹腔注射新鲜配制的2%STZ。

72 h后尾静脉取血测血糖,血糖＞16.7 mmol/L者确定为造模成功。

选取50只大鼠进入实验。

2.2 分组与给药
将60只大鼠随机分为空白组、模型组、护肝宁组和糖肝康小[10 g/(kg•d)]、中[20 g/(kg•d)]、大[40 g/(kg•d)]剂量组,每组10只。

糖肝康小、中、大剂量组分
别按成人剂量5、10、20倍给药,护肝宁组按成人剂量的10倍给药,每日4 g/kg
灌胃。

空白组每日10 mL/kg生理盐水灌胃。

连续12周。

2.3 标本采集
给药观察12周后,断尾取血检测各组动物空腹血糖(取血前禁食8 h)。

戊巴比妥
钠30 mg/kg腹腔注射麻醉,开腹取出肝脏,用生理盐水冲洗后,放入-80 ℃冰箱备用。

2.4 Western blot检测
2.4.1 蛋白定量称取约100 mg组织,利用液氮、研钵粉碎组织块,加入溶解RIPA 裂解液,混匀,使用前数分钟加入PMSF,使PMSF的终浓度为1 mmol/L。

按照每100 mg组织加入约1000 μL裂解液的比例加入裂解液,冰上用研钵匀浆,转入1.5 mL EP管,冰上孵育30 min,10000 r/min离心10 min,取上清液为组织裂解液,分
装-20 ℃保存,裂解得到的蛋白样品,用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

2.4.2 SDS-PAGE电泳配制10%分离胶(H2O 1.3 mL, 30%Acr-Bis 1.7 mL,1
mol/L Tris 1.9 mL,10%SDS 0.05 mL,10%AP 0.05 mL,TEMED 0.002 mL),加入TEMED后即可灌胶,37 ℃温箱内30 min,待胶凝固即可加入4%浓缩胶(H2O 1.4 mL,30%Acr-Bis 0.33 mL,1 mol/L Tris 0.25 mL,10%SDS 0.02 mL,10%AP 0.02 mL,TEMED 0.002 mL)；除resisgin蛋白外,均用10%分离胶,resisgin蛋白用15%分离胶(H2O 1.84 mL,30% Acr-Bis 4 mL,1 mol/L Tris 2 mL,10%SDS 0.1
mL,10%AP 0.1 mL,TEMED 0.004 mL)电泳。

加足够电泳液后上样,电压控制110 V,电泳时间1.5 h。

2.4.3 半干转法转膜上下层滤纸各8张,下层滤纸9.5 cm×6 cm,PVDF膜9
cm×5 cm,胶8 cm×4 cm,上层滤纸7 cm×3.5 cm,转膜前浸泡滤纸,铺于平板电极上,赶尽气泡,一次铺上经半干转缓冲液浸湿的PVDF膜,page胶,上层滤纸。

恒压
20 V转膜,转膜时间18 min。

2.4.4 免疫反应将膜移至含有封闭液(5%脱脂奶粉)的平皿中,室温脱色摇床上摇动
封闭1 h,将一抗用5%脱脂奶粉稀释至适当浓度,膜转移至一抗液中,孵育1 h后,用TBST与摇床上清洗3次,每次10 min,用5%脱脂奶粉稀释二抗至适当浓度,将膜转移至二抗液中,室温孵育1 h后,TBST清洗3次,每次10 min。

2.4.5 化学发光、显影及定影膜转移至X光片夹中,将ECL化学发光试剂A、B液按等体积混匀后滴加到膜上,移入暗室中,打开X光片夹,把X光片夹放在膜上,关上
X光片夹,曝光1.5 min,取出X光片,迅速浸入显影液中显影,待出现条带后终止显影；清水冲洗光片上显影液后将X光片放入定影液,定影3 min,冲洗残留的定影液,室温下晾干,将膜移至TBST中清洗3次。

2.4.6 定量分析采集图像,用Gel-Pro analyzer软件定量分析各条带光密度,计算
各泳道样品与内参的比值。

以正常组的平均相对光密度为100%比较各组条带的平均相对光密度值。

采用SPSS11.0统计软件进行分析。

计量数据以±s表示,采用Student's T检验或F检验。

P＜0.05表示差异有统计学意义。

与空白组比较,模型组肝组织CREB表达明显升高(P＜0.01)；与模型组比较,各给药组CREB表达明显减少(P＜0.01),糖肝康中、大剂量组明显优于护肝宁组(P＜0.01)。

见表1、图1。

T2DM合并NAFLD属中医“消渴”合并“胁痛”“肝着”“积聚”等范畴。

在继承前人经验的基础上,总结多年临床治疗经验,笔者认为T2DM合并NAFLD的主要病机是脾虚气弱、肝失条达、痰瘀毒互结,治疗上应以健脾益气治其本,调肝解郁调
其志、活血解毒治其标,并据此创制糖肝康方。

全方以扶正为主,兼以祛邪,对改善糖尿病合并脂肪肝大鼠的预后具有积极的作用。

CREB是真核生物细胞的核内蛋白质,是调节转录的核因子[5],也是连结多条细胞信号转导途径的关键分子,其水平和功能异常,可影响长期记忆形成所需蛋白质的合成,进而导致记忆功能受损[6]。

研究表明,CREB是肝脏代谢的重要调节因子,尤其是在糖、脂肪代谢方面[7],提示CREB可能对肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗的发生、发展具有重要作用。

此外,CREB 还是过氧化物酶增殖激活物受体辅助激活因子1α的上游调节因子,其正常的生理作用对维持机体血糖稳定具有重要意义,而其功能异常也可能是T2DM发生、发展的机制之一[8]。

且以CREB作为药物作用的潜在靶点,可抑制肝糖原输出[9]。

本实验结果显示,模型组大鼠肝脏中CREB较空白组大鼠表达异常,糖肝康可改善CREB在肝脏的表达,中、大剂量组效果优于护肝宁组。

提示糖肝康可能通过降低CREB表达水平改善肝脏代谢,进而保护肝脏。

[1] 许向红,金星,陈颖越.2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病与代谢综合征及胰岛素抵抗的关系研究[J].中华全科医学,2013,11(35)：3419- 3421.
[2] 吴悠,丛晓东,张云.糖尿病肝损伤相关机制及中药干预[J].中国民族民间医
药,2011,9(21)：16-17.
[3] 钱秋海,钱卫斌,郭春芳,等.糖肝康对糖尿病脂肪肝模型大鼠肝脏AdipoR2 mRNA表达的影响[J].中国药师,2012,15(11)：1533-1535.
[4] 钱秋海,李红专,钱卫斌,等.糖肝康对糖尿病脂肪肝大鼠肝脏Ghrelin表达的影响[J].中华全科医学,2013,11(2)：168-170.
[5] 叶丽平,马静方,杨春雨.CREB特异性siRNA对人卵巢癌CAOV3细胞增殖的影响[J].山东医药,2011,51(47)：40-41.
[6] 王怀颖,石少慧,史建红,等.银杏叶片对衰老大鼠大脑皮层环腺苷酸反应元件结合蛋白表达的影响[J].中华行为医学与脑科学杂志,2011, 20(10)：887-889.
[7] Herzig S, Hedrick S, Morantte L, et al. CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPAR-gamma[J]. Nature,2003,426：190-193.
[8] Koo SH, Flechner L, Qi L, et al. The CREB coactivator TORC2 is a key
regulator of fasting glucose metabolism[J]. Nature,2005, 437：1109-1111.
[9] 王晶,许智博,田慧,等.PKA信号通路参与调控肝细胞cAMP反应元件结合蛋白与PGC-1α的表达[J].生物医学工程与临床,2011,15(3)：277- 279.。