堆肥中高效纤维素分解菌的分离与纯化

堆肥中高效纤维素分解菌的分离与纯化
晋昕;褚艳琴;晋小军
【摘要】实验从堆肥、马粪、枯树叶、柏树根土、蘑菇渣等样品中,分离得到14
株能分解纤维素的菌株.对此进行了透明圈直径,酶相对活性,滤纸酶活力(FPA),羧甲基纤维素酶活力(CMC)和对蔬菜杆的分解效果测定比较,筛选出2株对蔬菜有较强分解能力的菌株,其中一株的主要指标为:柏-Ⅰ透明圈直径2cm,酶相对活性3,滤纸酶活力(FPA)1.136078 g·50 mL-1,羧甲基纤维素(CMC)酶活力0.666134 g·50 mL-1和对蔬菜秆的分解效果21％；另一株的主要指标柏-Ⅱ透明圈直径10 cm,酶相对活性15,滤纸酶活力(FPA)0.209878 g·50 mL-1,羧甲基纤维素(CMC)酶活力2.62807 g·50 mL-1,对蔬菜秆的分解效果22％.%14 bacterial strains that can break down cellulose were isolated from composting horse dung, dead leaves, root with soil of Cypress, broken bits of mushroomsetc, respectively. Transparent circle diameter, relative enzyme activity, filter paper enzyme activity (FPA) , carboxymethyl cellulose enzyme activity (CMC) and the effect on the decomposition of vegetable bar were determined and compared. Two strains have strong decomposition ability for vegetable. One strain was from Cypress-I , which had transparent circle diameter of 2 cm, enzymic relative activity of 3, enzyme activity for filter paper ( FPA ) of 1.136078 g 50 mL'1, enzyme activity for carboxymethyl cellulose of
0.666134 g 50 mL"', and the vegetable bar decomposition efficiency of 21%. The other strong decomposition strain was from Cypress-II , which had transparent circle diameter of 10cm, enzymic relative activity of 15, enzyme activity for filter paper ( FPA) of 0. 209878g 50 mL"1, enzyme
activity for carboxymethyl cellulose of 2.62807 g 50 mL"1 and the vegetable bar decomposition efficiency of 22% .
【期刊名称】《中国沼气》
【年(卷),期】2011(029)006
【总页数】5页(P7-11)
【关键词】堆肥;纤维素分解菌;酶活力
【作者】晋昕;褚艳琴;晋小军
【作者单位】甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学植物生产类实
验教学中心,兰州730070;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学植
物生产类实验教学中心,兰州730070;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学植物生产类实验教学中心,兰州730070
【正文语种】中文
【中图分类】S216.4
微生物是堆肥过程中最关键、最活跃的因素，因此，高效微生物菌剂的研制成为国内外学者研究的热点之一。

日本、美国等国家起步较早，其中以日本的EM （Effective Microorganisms）菌群为代表，它是日本琉球大学比嘉照夫教授于
20世纪80年代初期研制出来的一种新型复合微生物菌剂。

由光合细菌、放线菌、酵母菌、乳酸菌等10个属80多种微生物复合培养而成的多功能微生物群，我国
近几年从美国、日本等国引进菌种进行制肥，但进口的菌种价格十分昂贵，或是一些伪劣菌种，造成国家投资的损失。

因此，十分有必要开发具有自主知识产权的制
肥菌种技术。

国内在堆肥微生物菌剂的研制方面也做了一定的工作。

2007年，孙宏民、南亚［1］选用厨余废弃物，分拣后和微生物菌剂分别投入特制的处理仓中，通过加热和搅拌等手段，利用多种好氧性的高温微生物对其中的有机物进行分解，可根据采用的工艺和添加的菌剂不同将其制成肥料或饲料。

席北斗等［2］利用康氏木霉、白腐菌、变色栓菌与EM菌剂、解磷菌、解钾菌、固氮菌混合，筛选培
育堆肥高效复合微生物菌剂。

纤维素酶是一种多组分的酶，一般认为包括C1酶（对纤维素最初起作用的酶，它破坏纤维素链的结晶结构，起水化作用），Cx酶（作用于经C1酶活化的纤维素，分解β-1，4-糖苷键，主要包括内切β-1，4-葡聚糖酶和外切-β-1，4-葡聚糖酶）和β-葡萄糖苷酶（将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖）。

在分解纤维素时，上述3种纤维素酶中的任何一种都不能单独裂解晶体纤维素，
只有3种酶共同存在并协同作用时，才能完成水解过程［3］。

由于蔬菜茎杆中含有纤维素、半纤维素和木质素等较难分解的物质，使蔬菜废弃物在堆制中不能充分的腐解。

目前，纤维素废弃物主要是通过物理、化学、生物或者三者联合的处理方法，使这些物质可以用于生产燃料、有机肥、饲料添加物和化工原料等。

本研究针对蔬菜废弃物纤维素降解慢的难题，从自然界中采集堆肥、马粪、枯树叶、柏树根土、蘑菇渣等样品进行分离，筛选出分解能力较强的纤维素分解菌，并对其进行酶活力的测定和对天然粗纤维的分解能力的测定，筛选出高效分解纤维素混合菌，用于当地蔬菜废弃物堆肥中。

1 材料与方法
1.1 样品的采集与预处理
从自然界中采集堆肥、马粪、枯腐树叶、柏树根土、蘑菇渣等样品。

分别放入三角瓶中，加入适量的生理盐水，配成浓度为0.05的样品，振荡30 min，以备待用。

腐解用蔬菜样品为甘蓝和芹菜混合样。

1.2 培养基和试剂的配制
纤维素初步筛选培养基［4］：蛋白胨10 g，酵母膏10 g，羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10 g，NaCl 5 g，KH2 PO4 1 g，琼脂16 g，蒸馏水1000mL。

鉴别培养基［5］：（纤维素刚果红培养基） K2 HPO4 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.5115 g，纤维粉1.88 g，刚果红0.2 g，琼脂14.00 g，明胶2.00 g，土壤浸汁100mL，水900mL，pH值约为7.0。

复筛培养基［6］：（CMC试管斜面培养基）蛋白胨10 g，酵母膏10 g，CMC-NA10 g，NaCl 5 g，KH2 PO4 1 g，琼脂16.00 g，蒸馏水1000mL。

液体发酵培养基［7］：蛋白胨3.0 g，酵母膏0.5 g，KH2 PO4 4.0 g，
MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCL·2H2O 0.3 g，CMC-NA5.0 g，pH 7.2～7.3，蒸馏
水1000mL。

（注：所有培养基和培养皿均在121℃灭菌30 min）
试剂配制［8］如下：
（1）3，5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：称取182.0 g酒石酸钾钠，溶解于500mL蒸馏水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入 6.3 g 3，5-二硝
基水杨酸，21.0 g氢氧化钠，5.0 g苯酚，5.0 g无水硫酸钠，搅拌均匀至溶解，
冷却后用蒸馏水定容至1000mL，储存于棕色瓶中，室温保存，7～10 d后使用。

（2）柠檬酸缓冲液：配制0.1 mol·L－1的柠檬酸溶液（称取4.2 g柠檬酸，用少量蒸馏水溶解并定容至200mL）和0.1 mol·L－1的柠檬酸三钠溶液（称取5.88
g柠檬酸三钠，用少量蒸馏水溶解并定容至200mL）。

量取89.5mL 0.1 mol·L－
1的柠檬酸溶液和110.5mL 0.1 mol·L－1的柠檬酸三钠溶液混匀，即得pH 4.85
的0.1 mol·L－1柠檬酸缓冲液，4℃冰箱保存备用。

量取57mL 0.1 mol·L－1的
柠檬酸溶液和43mL 0.1mol·L－1的柠檬酸三钠溶液，再量取100mL蒸馏水混匀，配成 pH 4.4的0.05 mol·L－1柠檬酸缓液，4℃冰箱保存备用。

（3）乙酸－乙酸钠缓冲液：配制A液（量取6mL冰醋酸，用蒸馏水定容至
1000mL）和B液（称取8.2 g醋酸钠，用少量蒸馏水溶解并定容至1000mL）。

将A液和B液按4∶6混合，即配成pH 4.8的0.1 mol·L－1乙酸-乙酸钠缓冲液，低温冷藏备用。

（4）1 mg·mL－1葡萄糖标准溶液：准确称取1000 mg分析纯葡萄糖（预先干
燥至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至1000mL，4℃冰箱保存备用。

1.3 微生物的分离、筛选鉴定和纯化［9～11］
在超净工作台下，分别吸取已配好浓度为0.05的样品的上清液0.4mL，接种至
50mL的纤维素初步筛选培养基（在121℃下灭菌30 min），混匀倒平板，晾凉
后倒置，在30℃恒温培养箱中培养2～3 d，并随时观察记录，在进行单个菌株的点菌鉴别并纯化实验。

1.4 纤维素分解菌酶活力初测
1.4.1 透明圈的测定
将分离的堆肥、马粪、枯树叶、柏树根土、蘑菇渣的单个菌株及其混合菌分别点种于纤维素刚果红培养基上，30℃培养3 d，并测定透明圈的直径。

1.4.2 酶相对活性的测定
在菌株的观察过程中记录透明圈的直径大小（D）和菌落的直径大小（d）。

酶相对活性（A）=D/d
1.5 纤维素分解菌酶活力的进一步测定
1.5.1 酶活力的测定［12］
（1）粗酶液的制备。

将分离到的菌株分别接种到装有50mL液体培养基的三角瓶中，30℃，140 r·min－1振荡培养 6 d，将培养液于4℃，4000 r·min－1离心
15 min，取上清液作为粗酶液。

（2）标准曲线的绘制。

采用3，5－二硝基水杨酸比色定糖法测定酶解液中还原
糖的含量。

分别取1 mg·mL－1葡萄糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，
1.2，1.4，1.6mL，依次加入9支20mL的比色试管中，以蒸馏水补加到
2.0mL，再加入DNS试剂1.5mL，在沸水中煮沸5 min，流水冷却，用蒸馏水定容至
20mL摇匀，在波长490 nm处进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

图1 葡萄糖标准曲线
（3）滤纸（FPA）酶活力测定。

将新华Ⅰ号滤纸（1 cm×6 cm）卷成小卷，放进试管内，加入1.5mL乙酸－乙酸钠缓冲液（pH 4.8），再加入0.5mL酶液，轻轻摇匀，使滤纸完全浸泡在液体中，50℃保温1 h后按DNS法测定糖。

酶活力［（mg·mL－1）·h］=葡萄糖量/（1/4）
式中，葡萄糖量为从标准曲线上查得的葡萄糖值，mg；1/4为1mL待测液中原酶液的含量，mL。

（4）羧甲基纤维素酶（CMC）酶活力测定。

移取酶液0.5mL于试管中，加入含0.5％CMC-Na的柠檬酸缓冲液（0.05 mol·L－1，pH 4.4）1.5mL，在50℃水浴锅中作用30 min后，立即按DNS法测糖。

酶活力［（mg·mL－1）·30min］=
葡萄糖量/（1/4）
式中，葡萄糖量为从标准曲线上查得的葡萄糖值，mg；1/4为1mL待测液中原酶液的含量，mL。

1.5.2 菌液对蔬菜秆的分解效果测定
将蔬菜秆切至3 cm左右，将各菌株分别接种至以蔬菜秆为唯一碳源的液体培养基中，在转速为110 r·min－1的摇床30℃下培养4 d用滤纸过滤，80℃烘至恒重，计算降解后每克蔬菜秆残重。

1.5.3 不同菌株对蔬菜废弃物的腐解效果观察
将菜叶晾晒到含水量有60％时，按相同的量装入到培养瓶中，将选出的14种菌
液分别接入培养瓶中并封口。

将培养瓶放到通风处，观察记载腐解变化。

2 结果与分析
2.1 纤维素分解菌的分离与纯化
以羧甲基纤维素钠为唯一碳源进行初筛，在用1 mol·L－1的HCL染色，纤维素酶的释放造成双糖的水解，红色水解圈沉淀变为深蓝色，说明该菌种是纤维素分解菌。

得到38株具有分解纤维素能力的单菌株，将这些单菌接种到种子斜面培养基中，28℃培养4天后将其放人4℃的冰箱进行保存，以备分析用。

这些菌种在一个月后转入新的种子斜面培养基中进行保存，以防菌种退化。

2.2 纤维素分解菌酶活力初测
将分离纯化得到的38株纤维素分解菌点种在纤维素刚果红培养基上，28℃培养两天，测其透明圈的直径并计算其相对酶活力，经初测挑选出14种相对分解能力较强的菌株，分别为堆1-Ⅰ，柏Ⅱ，枯-Ⅱ，柏-Ⅰ，粪2-Ⅲ，堆2-Ⅱ，柏2-Ⅰ，粪-Ⅱ，堆3-Ⅱ，柏-Ⅱ，粪2-Ⅰ，蘑2-Ⅰ，粪2-Ⅱ，枯-Ⅰ。

2.2.1 透明圈比较
透明圈直径的大小直接反映了酶浓度的高低，但其精度相对较差。

由于此法快速方便，适合于大量菌株筛选。

从表1可见，通过测量菌株透明圈的大小，筛选出14株菌株，其中柏-Ⅱ，堆2-Ⅱ，粪2-Ⅰ，粪-Ⅱ，柏Ⅱ的透明圈直径的大小较为突出，最大的柏-Ⅱ菌株透明圈直径达10 cm，最小的蘑2-Ⅰ直径仅有0.3 cm，相差30倍，说明柏-Ⅱ，堆2-Ⅱ，粪2-Ⅰ，粪-Ⅱ，柏Ⅱ五株菌株有很强的纤维素分解能力。

2.2.2 相对酶活性测定结果
通过透明圈与菌斑大小的比较得到相对酶活性。

从表1相对酶活性可以看出，在筛选出的14株菌株中，粪2-Ⅰ，柏-Ⅱ，枯-Ⅱ，柏Ⅱ，柏2-Ⅰ的相对酶活性分别为17，15，14.17，13.5，13.33比其他菌株的相对酶活性大。

其中最大的粪2-Ⅰ相对酶活力为17.00，最小的为蘑2-Ⅰ为1.50，两者相差11倍。

2.3 纤维素分解菌酶活力的进一步测定
按前述方法分别对14个菌株的羧甲基纤维素酶（CMC）酶活力，滤纸（FPA）酶活力和对蔬菜秆的分解效果的测定，结果见表1。

表1 不同菌株各指标的测定结果菌株编号透明圈直径 cm酶相对活性AD·d －1
滤纸酶活力g·50mL －1 CMC酶活力g·50mL －1对蔬菜的分解效果％堆1-
Ⅰ1.5 8.33 0.419756 －0.054260 17柏Ⅱ 2.5 13.50 0.661572 －0.109500 24
枯-Ⅱ 1.0 14.17 0.821262 －0.246378 23柏-Ⅰ 2.0 3.00 1.136078 0.666134
21粪2-Ⅲ 1.7 2.00 0.355880 0.022812 24堆2-Ⅱ 3.5 1.75 0.524695 －
0.118267 25柏2-Ⅰ 2.0 13.33 0.474507 －0.232692 25粪-Ⅱ 2.5 12.50
0.264629 0.068438 27堆3-Ⅱ 1.8 12.00 0.438006 －0.063876 30柏-Ⅱ 10.0 15.00 0.209878 2.628070 22粪2-Ⅰ 3.0 17.00 0.447131 －0.314817 28蘑2-Ⅰ 0.3 1.50 0.209878 －0.273754 17粪2-Ⅱ 0.9 10.00 0.136877 －0.054751 32枯-Ⅰ2.2 7.30 0.146002 －0.114064 29
2.3.1 酶活力的测定结果
纤维素酶活力是衡量菌株降解纤维素能力的一个定量指标，以菌株在单位时间内分解特定纤维素类物质的量表示。

纤维素酶活力值越高，菌株降解纤维素的能力就越强。

依表1分析得到14株菌株中，柏-Ⅰ，枯-Ⅱ，柏Ⅱ，堆2-Ⅱ，柏2-Ⅰ的滤纸酶
活力较大，其中最大的柏-Ⅰ滤纸酶活力为1.136078，最小的粪2-Ⅱ为0.136877，两者相差10倍。

对CMC酶活力的测定表明，从表1可以得到排在前五位的依次为：柏-Ⅱ，柏-Ⅰ，粪-Ⅱ，粪2-Ⅲ，堆1-Ⅰ；其中最大的柏-ⅡCMC酶活力为2.628070，最小的粪
2-Ⅰ为-0.314817，相差7倍。

2.3.2 对蔬菜分解效果
通过实验观察，过滤后的残物通过烘箱烘干后，只剩下叶脉没有完全分解，从表1
中可以得到对蔬菜秆分解效果好的前五位的依次为：粪2-Ⅱ，堆3-Ⅱ，枯-Ⅰ，粪2-Ⅰ，粪-Ⅱ。

最大的粪2-Ⅱ对蔬菜的分解率为32％，最小的堆1-Ⅰ，蘑2-Ⅰ为17％。

进一步观察可见，腐解后的蔬菜颜色呈褐色，含有的水分很多，菜叶已基本腐解，但叶脉未完全腐解。

观察表明菌液粪2-Ⅱ，堆3-Ⅱ，柏-Ⅱ，粪2-Ⅰ，粪-Ⅱ对蔬菜的分解效果较好。

3 结论与讨论
不同的菌株对蔬菜的分解能力差异很大，不同来源的纤维素，微生物的利用能力也不一样。

通过选择培养基初筛、刚果红染色复筛，再进行培养、酶活测定。

从以上分析结果可见，CMC酶活性测定结果与CMC酶活力的测定结果基本一致，另外CMC酶活力高的菌株，其滤纸酶活力，CMC酶活力也高，而且滤纸分解效果比较明显。

经综合筛选，选出2株分解纤维素能力相对较强的菌株，分别是柏-Ⅰ和柏-Ⅱ。

培养基的碳源对纤维素分解菌生长的影响，在初筛过程中使用了以羧甲基纤维素钠为限制性碳源的纤维素初步筛选培养基。

筛选结果表明，以羧甲基纤维素钠为碳源时，可生长的微生物以真菌类为主，细菌和放线菌均有所生长。

实验发现，用纤维素刚果红培养基来观察透明圈，操作简便且易观察，而且效果比较好。

但也应该注意刚果红用量的多少，每皿中培养基的多少常常会导致培养基本身的背景值大小不一，会影响观察的效果。

因此在实际操作中，应在同等背景条件下进行操作和观察。

通过透明圈的大小可以很快的挑选出纤维素分解菌，透明圈的直径的比值同酶活测定之间的一致性较好。

因此用这种透明圈筛选法进行初筛，可以很快识别出产纤维素酶的菌株，而且产酶越多，透明圈越大，产酶越快，透明圈出现越早。

然而，透明圈大小并不能完全代表菌株的产酶能力，因而仅以透明圈大小作为菌株产纤维素酶活力大小的定量指标是不太可靠的，其原因可能有多方面，如固体和液体培养条
件不同、不同菌株具有不同的生长和产酶速度及不同的纤维素酶系、菌苔大小及在平板上堆积情况的差异等，这些因素都会造成透明圈大小与液体发酵酶活结果的不完全一致。

所以用液体发酵、测定酶活，再次进行筛选是必不可少的。

影响纤维素酶活力的因素较多，在通常情况下，如酶的浓度、底物的结构和物质
pH值、反应温度和厌氧环境等都对菌株的生长有影响。

在对蔬菜秆分解效果和不同菌株对蔬菜废弃物的腐解效果观察得到，菜叶的有一部分没有很好的腐解，说明筛选出的菌株不能完全腐解蔬菜茎叶，没有充分发挥纤维素分解菌的作用，但对以后的进一步实验提供了基础。

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