高感染力嵌合型腺病毒载体的构建及其感染力的流式细胞术测定

高感染力嵌合型腺病毒载体的构建及其感染力的流式细胞术测
定
马炬明;苏长青;王伟国;施建国;胡慧珍;李林芳
【摘要】目的构建1种35型腺病毒(Ad35)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合型腺病毒载体,探索该腺病毒载体感染肿瘤细胞的效率.方法 PCR扩增Ad35腺病毒Fiber序列,插入并置换Ad5的Fiber序列,构建Ad5-F35嵌合型腺病毒载体,使之携带绿色荧光蛋白报告基因EGFP;以MOI=5的Ad5-F35EGFP病毒感染度感染淋巴瘤细胞raji和胃癌细胞SGC-7901,流式细胞术检测EGFP表达,借以判断病毒感染细胞的能力.结果成功构建携带EGFP的嵌合型腺病毒载体pAd5-F35EGFP,并在293细胞中重组出Ad5-F35EGFP嵌合型腺病毒,扩增纯化后病毒滴度达到3.4×109 pfu/ml;流式细胞仪检测发现,Ad5-F35EGFP在淋巴瘤细胞raji和胃癌细胞SGC-7901内表达EGFP的强度明显比传统的Ad5-EGFP提高.结论 Ad5-F35嵌合型腺病毒感染肿瘤细胞的能力明显增强,为提高腺病毒载体转染抗肿瘤基因的效率、改进肿瘤基因治疗的临床疗效奠定了基础.
【期刊名称】《实用癌症杂志》
【年(卷),期】2007(022)006
【总页数】4页(P565-568)
【关键词】肿瘤;基因治疗;腺病毒载体;35型腺病毒;5型腺病
【作者】马炬明;苏长青;王伟国;施建国;胡慧珍;李林芳
【作者单位】310004,杭州解放军第117医院;200438,第二军医大学东方肝胆外
科医院;310004,杭州解放军第117医院;310004,杭州解放军第117医院;310004,杭州解放军第117医院;200438,第二军医大学东方肝胆外科医院
【正文语种】中文
【中图分类】R730.2
肿瘤的基因治疗越来越受到人们的重视，已经有大量的临床前研究和临床实验，探索肿瘤基因治疗的潜力。

在这个过程中，人们深刻认识到，任何应用基因运载技术治疗肿瘤患者，要取得有意义的结果，均需要对现存的载体系统进行改造。

只有克服了基因转运效率低下的障碍，才会提高人们利用基因技术改进肿瘤临床治疗效果的信心。

目前应用较多的腺病毒载体，就存在第一代E1区缺失的、第二代E1区
合并E3/E4区缺失的、第三代空壳载体的增殖缺陷型，以及能够在肿瘤细胞内特
异性复制的增殖型腺病毒载体[1～3]。

人类腺病毒有A、B、C、D、E、F 6个不同亚属，它们对宿主细胞的亲嗜性、致
瘤性及疾病史各不相同。

在基因治疗中应用最多的是安全性较好的腺病毒C亚属
中的5型[4,5]。

但是研究表明，5型腺病毒(Ad5)对部分细胞的感染效率低下，包括骨髓造血干细胞、外周血细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等。

这个特性限制了腺病毒载体在某些肿瘤治疗中的应用，特别是血液系统肿瘤。

而近来发展起来的肿瘤干细胞理论也证明，Ad5作为基因治疗的载体，不能有效感染肿瘤干细胞，是造成
治疗效果差肿瘤易复发的原因之一。

本研究通过基因操作技术，对腺病毒载体进行改造，构建成功1种嵌合型腺病毒载体，并对该载体对细胞的感染效率进行了实验，旨在探索并提高腺病毒载体转染抗肿瘤基因的效率，改进基因治疗的临床疗效。

1 材料与方法
1.1 引物合成
设计引物(表1)，由上海生工生物工程公司合成。

表1 合成的引物序列序号序列P15’-AATTTTAATTAAGAATTCAGATCTGCGGCCGCTCTAGACCCGGGGTCGACGGA TCCTTAATTA-3’P25’-AGCTTAATTAAGGATCCGTCGACCCCGGGTCTAGAGCGGCCGCAGATCTGAAT TCTTAATTAA-3’P35’-TGCTCTAGATATTCCCTTTAACTAATAAAAAAAATAATAAAGCATC-3’P45’-GCGGGATCCGTTTTGGCCAGCTGGTTTAG-3’P55’-CCGGAATTCATAACTGATCATAATCAG-3’P65’-TTAAATTCGTAAGATACATTGATGAG-3’P75’-TGTATCTTACGAATTTAAATCGATGCA-3’P85’-TGCTCTAGATTCATTTAAATCGATGCAGG-3’
1.2 载体构建
P1和P2引物各5 μl,经过磷酸激酶磷酸化后，混合，100℃加热5 min，室温逐渐冷却，制备载体pUC19连接头，与EcoRI+HindIII双酶切线性化的pUC19连接，得到pUC19-L，在EcoRI和HindIII间引入PacI、EcoRI、BglII、NotI、XbaI、SmaI、SalI、BamHI位点。

P3/P4扩增35型腺病毒(Ad35，本室保存)中的Fiber35(2090 bp)，上下游引入XbaI+BamHI，装入pUC19-L，得到pUC19-Fiber35。

P5/P6扩增pShuttle-CMV(本室构建并保存)中的SV40(240 bp)，P7/P8扩增pABS.4中的Kanr(1270 bp)，将两个PCR产物混合作为模板，P5/P8合拉
SV40/Kanr(1510 bp)，上下游引入EcoRI+XbaI，装入pUC19-Fiber35，得到pUC19-FSK。

EcoRI酶切pPE3-ADP(本室构建并保存)，回收2531 kb片段，装入pUC19-FSK，得到pAd5-F35嵌合型腺病毒载体(图1)。

酶切鉴定。

图1 嵌合型腺病毒载体pAd5-F35质粒图含有5型腺病毒同源序列和35型腺病
毒Fiber序列
1.3 含报告基因的嵌合型腺病毒载体
含有绿色荧光蛋白报告基因的质粒pCA13-EGFP(本室构建并保存)，经BglII酶切释放EGFP表达盒，插入pAd5-F35的BamHI位点，得到pAd5-F35EGFP，酶
切及测序鉴定。

1.4 腺病毒重组
pAd5-F35EGFP经PacI酶切，去除了pUC19的序列，获得2个PacI位点之间
的线性化pAd5-F35EGFP序列，然后与pBHGE3在293细胞中重组，获得含有
绿色荧光蛋白报告基因的改良的Ad5-F35EGFP嵌合型腺病毒。

PCR鉴定正确后，腺病毒Ad5-F35EGFP在293细胞中反复扩增至需要量，氯化铯梯度离心纯化，TCID50法测定病毒滴度。

1.5 细胞感染力测定
24孔板培养淋巴瘤细胞raji和胃癌细胞SGC-7901(来源于ATCC)，以MOI=5的Ad5-F35EGFP病毒感染度，感染细胞，48 h后收集细胞，上流式细胞仪检测。

实验设含5型腺病毒Fiber的病毒Ad5-EGFP(本室构建并保存)作为对照。

2 结果
2.1 嵌合型腺病毒载体pAd5-F35酶切鉴定
嵌合型腺病毒载体pAd5-F35，经过EcoRI和XbaI酶切鉴定，证实pAd5-F35载体构建成功，见图2。

图2 腺病毒载体pAd5-F35酶切鉴定
M为1 kb DNA Marker；1为EcoRI酶切释放2530+3599 bp片段；2为XbaI
酶切释放2781+3348 bp片段
2.2 重组嵌合型腺病毒Ad5-F35EGFP的PCR鉴定
提取重组嵌合型腺病毒Ad5-F35EGFP的基因组DNA，以P3/P4为引物，扩增病毒中的Fiber35序列，产生2 090 bp阳性产物，证实重组成功，见图3。

Ad5-F35EGFP在293细胞中反复扩增纯化，TCID50法测定病毒滴度为3.4×109 pfu/ml。

图3 重组腺病毒Ad5-F35EGFP PCR鉴定
M为1 kb DNA Marker；1为阴性对照；2为Ad5-F35EGFP扩增出2090 bp阳性条带
2.3 Ad5-F35EGFP对细胞感染力
培养淋巴瘤细胞raji和胃癌细胞SGC-7901，感染Ad5-F35EGFP病毒后48 h，上流式细胞仪检测EGFP的表达。

结果发现，Ad5-F35EGFP对2种肿瘤细胞的感染能力，与Ad5-EGFP相比，有明显提高，见图4。

3 讨论
由于对其生物学和遗传学特性的深入研究和了解，以及其安全性高、可感染的细胞类型广等特点，Ad5被普遍应用于肿瘤基因治疗的运载载体[3～5]。

但是，Ad5感染细胞的能力取决于细胞表面的能与病毒Fiber相互作用的柯萨奇病毒-腺病毒受体(coxsackievirus-adenovirus receptor,CAR)的丰度[6,7]。

对于那些缺乏CAR表达的细胞，Ad5感染以及运载基因的能力很差[8,9]。

而在基因治疗实践中所遇到的缺乏CAR表达的细胞为数不少，特别是造血系统肿瘤细胞以及各种实体肿瘤中的肿瘤干细胞[10,11]。

因此，改善腺病毒载体运载抗肿瘤基因对造血系统肿瘤的治疗效果，以及提高腺病毒载体感染肿瘤干细胞从而彻底消灭肿瘤复发的根源，是大家面临的迫切任务。

图4 Ad5-F35EGFP和Ad5-EGFP对肿瘤细胞感染力的比较
A为Raji细胞感染Ad5-F35EGFP；B为 Raji细胞感染Ad5-EGFP;C为SGC-7901细胞感染Ad5-F35EGFP；D为 SGC-7901细胞感染Ad5-EGFP
有研究发现，B亚属腺病毒中的35型(Ad35)对细胞的感染存在另外的机制，其Fiber蛋白可能作用于另外的细胞表面受体。

因此，Ad35的感染过程不依赖于CAR的状态，对上述缺乏CAR表达的细胞具有较强的感染力，能够有效运载抗肿瘤基因到达细胞内[12～14]。

Ad35对CD34阳性的细胞的感染力明显强于
Ad5[15]。

本项研究扩增Ad35的Fiber序列，插入并置换Ad5载体的Fiber，成功构建含有Ad35腺病毒Fiber序列的Ad5-F35嵌合型腺病毒，以此腺病毒载体携带绿色荧
光蛋白报告基因，扩增并纯化后病毒滴度达到3.4×109 pfu/ml。

流式细胞术的观察结果发现，Ad5-F35EGFP嵌合型腺病毒感染淋巴瘤Raji细胞和胃癌SGC-7901细胞的能力明显比传统的Ad5-EGFP增强，在细胞内表达EGFP的强度提高。

研究显示，含有Ad35腺病毒Fiber序列的Ad5-F35嵌合型腺病毒可以作为基因
转染的有效载体，为造血系统肿瘤等缺乏CAR受体的肿瘤的基因治疗创造条件，同时对消灭各种实体肿瘤中的肿瘤干细胞、有效遏制肿瘤复发转移的根源有积极的意义。

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