基因工程大肠杆菌基因工程(2)

3) 目的蛋白的回收
融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋
白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导 致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将
融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工
序。
融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：
化学断裂法
酶促裂解法
化学断裂法：
用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰
Pinpoint Xa
Xa因子识别位点编码序列 MCS SP6
Xa-1 Xa-2 Xa-3
ATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC ATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG C ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GC NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotI
白分子。
2. 以包涵体形式表达目的蛋白的操作
如果未进行特殊设计(如分泌型表达或融合型表达),外
源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以
上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。
因此，以包涵体形式表达目的基因的操作关键就是选择
高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长
处所在。
3. 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。
2）用于融合蛋白构建的受体蛋白：
谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 麦芽糖结合蛋白（MBP） 促进分泌 金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫亲和层析 pRIT2T 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象 pTrxFus 外膜蛋白（OmpF） 促进分泌 β-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析 泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象
亲和层析进行特异性简单纯化； 外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提 供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构 基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子 量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件； 两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决 定着融合蛋白的裂解工艺；
在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异
源蛋白位于C端。
通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特
异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源 蛋白。
1. 融合型目的蛋白表达系统的构建 1）融合蛋白表达质粒的构建原则：
受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过
二、大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
（一）包涵体型异源蛋白的表达
1. 包涵体及其性质
包涵体(Inclusion Bodies，IB)：在某些生长条件下，
大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地 集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶 性结构。
程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的
产业时代。 细菌不仅在基因重组技术的诞生和技术进步中起到了举
足轻重的作用，而且细菌的遗传改造也是基因工程中历史
最早、研究最广泛、取得实际应用成果最多的领域。
7-1. 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
包涵体表达形式的缺点：
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必
须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构 象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操 作的效率对目标产物的收率至关重要。
然而，这也是一个技术难题,尤其当目标蛋白分子中的Cys
残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不
富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的
大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧 失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。
由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同
源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细
菌细胞内。
除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋
HS HS
&#HS
S S
2R-SH
（二）分泌型异源蛋白的表达
在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分
为两种形式：
即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中； 或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外
膜进入培养基中。
蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。
形成二硫键的方式主要有：
化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空
气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸 残基的蛋白质的重折叠。
HS
HS
A S
S
2e + 2H+
二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和
GSSG），二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠 效果好。
超过30%。
4. 包涵体的变性与复性操作
1）蛋白质变性复性的动力学原理：
U 变性状态的蛋白质 N 天然状态的蛋白质 C 共价修饰的蛋白质 A 集聚状态的蛋白质 I 有效变复性过程中的中间状态 X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态
C1
U
C2
I1 X2 A
Cn
In Xn A
C
N
X1 A
X A
在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的
质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。
此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因
的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质 的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大
肠杆菌中的完全分泌。
3. 以分泌形式表达目的蛋白的优缺点
分泌表达形式的优点：
目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不 重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中， 其稳定性大约是在细胞质中的10倍。
外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表
达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常
要比包涵体方式低很多；
因此,目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆
菌尽管有，但并不普遍。
（三）融合型异源蛋白的表达
融合蛋白：将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一
起，并作为一个开放型阅读框架所表达出的蛋白质。
假单孢菌蛋白酶 猪胰蛋白酶
切割位点
Arg-C
Glu-C Lys-C
Arg-C Lys-C
目的蛋白
Arg C
受体蛋白 N
酶促裂解法：多残基位点
为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限
性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因
之间加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接
1. 蛋白质的分泌机制
目标蛋白
原核细菌周质中含有多
种分子伴侣可阻止分泌蛋 白的随机折叠，分泌在细 胞周质或培养基中的重组 蛋白很少形成分子间的二 硫键交联；
因此与包涵体相比，分
周质
信号肽 内膜
胞内
信号肽剪切酶系
外膜
泌型重组蛋白具有较高比
例的正确构象，生物活性 的回收率增加，且对蛋白
酶不敏感。
胞外
（CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基
反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用
下肽键断裂，形成两个多肽降解片段；
其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，
而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。
这一方法的优点：
回收率高（可达到85%以上），
专一性强，
产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细
含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，
蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。
如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，
一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切
过程中被有效除去。
分泌表达形式的缺点：
相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制
并不健全；
包涵体的复性与重折叠的主要任务是：
将多肽链中被拆开的游离巯基重新形成二硫键，
多肽链重新折叠
通过次级键的形成使蛋白质复性
包涵体的复性与重折叠(refolding)：二硫键形成
在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽
链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重 的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须 重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。
基的下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。
用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件：
外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残
基，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件 并不苛刻，但大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸 残基的出现频率是相当高的。
蛋白内切酶
梭菌蛋白酶 葡萄球菌蛋白酶
酶促裂解法：
亲和层析
启动子 受体基因 接头 目的基因
表达
Met
Stop Arg Lys Glu Ile-Glu-gly-Arg
Ile-Glu-gly-Arg Arg Lys Glu
酶解回收
酶促裂解法：多残基位点
T7 tac 生物素结合肽编码序列
ori
Xa因子切割位点
Apr
Ile Glu Gly Arg Glu
包涵体表达形式的优点：
能简化外源基因表达产物的分离操作
包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，
菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋
白从细菌裂解物中分离出来。
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定
在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异
源重组蛋白的稳定性已不再构成威胁。
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基因工程
7. 基因工程的应用
大肠杆菌基因工程 酵母菌基因工程 高等植物基因工程 哺乳动物基因工程
细菌与基因工程密不可分。1973年，Boyer和Cohen首次
完成外源基因在大肠杆菌中的表达，在实验室里实现了基
因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门。 几年后，第一个基因工程产品—利用构建基因的基因工
头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和
作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。
纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得不含上述寡肽序列
的目的蛋白。
由于Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋
白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广
泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物。
胞壁
2. 分泌型目的蛋白表达系统的构建
这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜
上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。
包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质
直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白 （细菌素）分泌到培养基中；
因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的
胞中的成熟表达产物较为接近。
然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则
不能用此方法!
酶促裂解法：单残基位点
蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，同时每种蛋白酶
均具有相应的断裂位点决定簇，因此可供选择的专一性断裂位
点范围较广。
几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的
精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残
蛋白质不能进入复性过程，因此，成为无活性的蛋白质。
包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进
行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）和复性操作。
2）包涵体的溶解与变性：
包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键
在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。
能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：
清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 促溶剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发 形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应 极端pH 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应 混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强
5. 包涵体的复性与重折叠（refolding）：