不同培养基对两种乳酸菌复合系生长的影响

不同培养基对两种乳酸菌复合系生长的影响
李翔国;刘海峰;姜飞;全炳武;崔宗均
【摘要】Studied the growth of two LAB communities in the media of corn powder,corn gluten meal and potato starch to screening the optimum culture medium. The results showed that the best proportion of corn powder or corn gluten meal to glucose was 7 ： 3 for the growth of LBC-8. Decreasing degree of pH value and increasing range of OD600nm of two LAB communities at corn powder plus glucose medium were higher than those at potato starch plus yeast powder medium. The best proportion of potato starch to yeast powder were 3：7 （5.0 × 10^7 CFU/mL） and 5：5 （3. 4× 10^7 CFU/mL）, respectively for the colony forming unit of two LAB communities.%采用两组乳酸菌复合系，以MRS改良培养基为对照，初步
研究以玉米面、玉米蛋白及马铃薯淀粉作为培养基成分时，乳酸菌复合系的生长情况，并筛选两组复合菌系生长最适的培养基．结果表明：复合系LBC-8在玉米面、玉米蛋白与葡萄糖7：3配比培养基中生长最适；复合系LBC-8和SFC-2的pH
值下降程度，OD600nm的增加幅度，玉米面与葡萄糖培养基中较马铃薯淀粉与
酵母粉培养基中明显；两组复合系分别在马铃薯淀粉与酵母粉3：7和5：5配比
中生长菌落数最多，分别为5．0×10^7CFU／mL、3．4×10^7CFU／mL．
【期刊名称】《延边大学农学学报》
【年(卷),期】2011(033)003
【总页数】5页(P206-210)
【关键词】乳酸菌复合系;不同配比;菌落数
【作者】李翔国;刘海峰;姜飞;全炳武;崔宗均
【作者单位】延边大学农学院农学系,吉林延吉133002;延边大学农学院农学系,吉
林延吉133002;延边大学农学院农学系,吉林延吉133002;延边大学农学院农学系,
吉林延吉133002;中国农业大学农学与生物技术学院,北京100094
【正文语种】中文
【中图分类】S476
乳酸菌（Lactic acid bacteria；LAB）是自然界中广泛存在的一类菌群，在葡萄糖或乳糖的发酵过程中能产生乳酸的细菌统称为乳酸菌.乳酸菌是一类无芽孢、革兰
氏染色阳性细菌.乳酸菌总群较大，目前可分为乳杆菌（Lactobacillus）、双歧杆
菌（Bifidobacterium）、链球菌（Streptococcus）、肠球菌（Enterococcus）、乳球菌（Lactococcus）、明串球菌（Leuconostoc）、片球菌（Pediococcus）、利斯特氏菌（Listeria）等18个属［1］，共有200多种.能分解饲料原料中的糖
等碳水化合物生成乳酸，引起乳酸发酵.乳酸本身不仅是营养物质，在饲料中还可
起到抑制其它微生物生长的作用，能够使饲料长期保存.乳酸菌是调制饲料过程中
的主要有益细菌，青贮饲料和长效发酵饲料利用它的活动提高饲料的适口性、营养性和耐贮性.
在国内外，目前培养乳酸菌最常用的培养基为MRS培养基、MRS改良培养基和
脱脂乳等［2］.这些培养基成本高，不适合在大规模生产中应用.围绕乳酸菌生产
型大量培养条件已有研究，张继英和张娅婷［3］为德氏乳杆菌的培养筛选了低成本的马铃薯培养基及番茄汁培养基；符桢华［4］筛选了适合植物乳杆菌生长的菠
萝皮汁培养基，这些都是针对纯培养单一微生物的工作.对复合菌系还未有适合多
种菌良好共生长的低成本培养基及生长规律研究方面的报道.乳酸菌作为重要的发
酵接种剂越来越受到重视，但纯培养的单一菌种接种效果不能令人满意［5］.长期的试验和生产实践中人们发现很多生物过程不能由单株微生物独立完成，必须依靠两种或两种以上的微生物来共同完成［6］.不同种类LAB在具体的环境中起不同
作用，单独使用某种LAB作为接种剂已不能适应实际生产需要.中国农业大学高丽娟等研究出的LAB复合菌系SFC－2由秸秆发酵物经长期驯化而构建，生长稳定，对环境变化的抗逆性强，发酵产物适合作为饲料添加剂［7］，是很有前景的饲料发酵接种剂.适合该复合菌系生长的低成本培养基配方正在研发，相关培养基中复
合菌系的生长规律也有待于深入研究.
本试验针对SFC－2和LBC－8两组乳酸菌复合系，以MRS改良培养基为对照探
讨玉米面、玉米蛋白及马铃薯淀粉作为培养基成分时两组乳酸菌复合系的生长情况，并筛选两组复合菌系生长最适的培养基，以期为该复合菌系的生产应用提供低成本培养方案.
1 材料与方法
1.1 乳酸菌复合系的菌源及筛选方法
1）乳酸菌复合菌系LBC－8 以土壤、醪糟及酸奶作为菌源，分别加入甘蔗渣中密封发酵，3种菌源经过约3d密封发酵处理后，分别取出1g接入MRS培养基
（1L蒸馏水中加葡萄糖20g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，
K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，糖蜜2mL，吐温80 1mL，
MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，pH 值调至6.2～6.4，115℃灭菌20min）中，之后每2d接种传代，并同时测定pH值，在连续多代接种后选择
pH值能够迅速下降到4以下的处理.之后将所选的不同来源菌液混合在一起培养，连续接种数代待其稳定，命名为LBC－8.
2）乳酸菌复合菌系SFC－2 来源于玉米和水稻干混合发酵物，是经长期定向驯化
而构建的乳酸菌复合系.培养12h后pH值下降至3.8，乳酸含量达10.64mg／mL，其中64%为L－（＋）乳酸.通过16SrDNA克隆文库分析证明其组成菌至少有7种，其近缘种主要为L.fermentum、L.plantarum及L .paracasei；在16SrDNA 的克隆文库中，76.3%为L.fermentum 的近缘种，20.3%为L.plantarum 的近缘种，3.4%为L.paracasei的近缘种［7、8］.
1.2 培养基及培养条件
1）液体培养基① 玉米面培养基：玉米面与葡萄糖分别以10∶0，9∶1，7∶3，5∶5，3∶7，1∶9，0∶10的比例混合后融于25倍量的蒸馏水中，每个处理均添加0.2%K2HPO4，pH值调至6.2～6.4，水浴锅里水煮1h，取上清液用于接菌试验.② 玉米蛋白培养基：将玉米面培养基中的玉米面改为玉米蛋白，其它同上.③
马铃薯淀粉培养基：酵母粉与马铃薯淀粉以7∶3的比例混合，其它同上.④MRS－S培养基：为MRS改良培养基，即将MRS培养基中葡萄糖改为蔗糖，pH值调至6.2～6.4.
2）固体培养基① 马铃薯淀粉琼脂培养基：马铃薯淀粉与酵母粉分别以10∶0，9∶1，7∶3，5∶5，3∶7，1∶9，0∶10的比例混合，加定量琼脂制成固体培养基.② MRS琼脂培养基：MRS培养液中加定量琼脂制成固体培养基.
1.3 试验方法
1）液体培养基采用光电比浊法［9］，在600nm波长下，以无菌培养液作参比
溶液［10］，用分光光度计测定光密度值（OD值）.另外，在培养过程中用PHS
－3C精密pH计每隔2h测定pH值的变化情况，并用下述公式计算pH值降低率.
2）固体培养基采用稀释平板分离计数法［11］.用无菌移液器吸取0.2mL菌液分别放在3个直径为9cm的无菌平皿中，每个稀释浓度重复3次；将融化并冷却至
45℃左右的培养基，倾注在各个不同稀释浓度的平皿内，每个培养皿20mL，立即在工作台内轻轻与稀释液混匀，待凝固后倒入37℃恒温培养箱内恒培养48h，然后计算菌落数，求其平均菌落数.
2 结果与分析
2.1 复合系LBC－8在玉米面与葡萄糖7种配比培养中生长量及pH值变化
以玉米面与葡萄糖为主成分做成7种配比的培养基，在起始pH值为6.3，室温约20℃条件下培养LBC－8，培养时间24h，每隔2h测1次不同配比培养物的OD 值及pH值（图1，C－玉米面，G－葡萄糖，下同）.复合系LBC－8在MRS培养基中0～10h生长势旺盛，在10h时OD值达到2.180，10h后OD值基本保持不变；复合系LBC－8在玉米面与葡萄糖比例为10∶0，9∶1，7∶3时较其余4种比例生长稍微旺盛，其中7：3比例时生长均匀、稳定.复合系LBC－8在供试8种培养基中pH值降低率随菌液培养时间的延长而升高，尤以MRS培养基中降低幅度较大，其余7种培养基中7：3比例的pH值降低率最大.
图1 LBC－8在玉米面与葡萄糖不同配比培养基中OD600nm（a）及pH值降低率（b）的动态Fig.1 Dynamics of OD600nm（a）and decreasing rate of pH value（b）of LBC－8 at different proportion medium of corn powder and glucose
2.2 复合系LBC－8在玉米蛋白与葡萄糖7种配比培养中生长量及pH值降低速率的变化
与上述条件相等情况下观察各配比培养基中24h内每隔2hLBC－8的生长量和pH值的降低率（图2）.复合系LBC－8在玉米蛋白与葡萄糖比例为9∶1，7∶3，5∶5时较其余4种比例生长稍微旺盛，24h后OD值分别为1.231，1.319，1.417，而在0∶10比例中几乎没有变化.复合系LBC－8在供试7种培养基中pH 值的降低率随菌液培养时间的延长而升高，接菌24h后玉米蛋白与葡萄糖比例为
7∶3，5∶5，9∶1时pH值的降低率达到50%以上，依次为55.20，54.17和52.88%.
因此，复合系LBC－8无论在玉米面还是玉米蛋白培养基中，生长最适培养基配比均为与葡萄糖以7∶3比例混合.
图2 LBC－8在不同配比玉米蛋白与葡萄糖培养基中OD600nm（a）及pH值降低率（b）的变化Fig.2 The chang of OD600nm（a）and decreasing rate of pH value（b）of LBC－8 at different proportion medium of corn gluten meal and glucose
2.3 LBC－8在玉米面与葡萄糖、酵母粉与马铃薯淀粉的2种配比培养中生长量及pH值变化
将玉米面与葡萄糖、酵母粉与马铃薯淀粉均以7∶3的比例混合后，在室温20℃条件下连续24h培养，每间隔2h测定1次复合系LBC－8的pH值及OD值的变化情况（图3，P－马铃薯淀粉＋酵母粉，C－玉米面＋葡萄糖，下同）.复合系LBC －8在玉米面培养基中pH值由初始的4.82迅速下降到接菌24h后的2.91；在马铃薯淀粉培养基中pH值下降则较小，由初始的4.74下降到接菌24h后的3.40.复合系LBC－8在玉米面培养基中OD值在接菌2h后较刚接菌时降低外，随培养时间的延长逐步上升，接菌24h后为0.861；复合系LBC－8在马铃薯淀粉培养基中生长平稳，由初始的0.095缓慢增加到0.249.
图3 LBC－8在玉米面、马铃薯淀粉及MRS培养基中随培养时间其pH值及
OD600nm的变化Fig.3 pH value and OD600nmchanges of LBC－8 at corn powder，potato starch and MRS medium with culture time
2.4 复合系SFC－2在玉米面与葡萄糖等2种配比培养中生长量及pH值降低速率的变化
将玉米面与葡萄糖、酵母粉与马铃薯淀粉均以7∶3比例混合后，与上述培养条件
相等情况下，测定复合系SFC－2的pH值及OD值变化情况（图4）.复合系SFC －2在玉米面、马铃薯淀粉培养基中的pH值及OD值的变化情况与复合系LBC－8总体相似.
图4 SFC－2在玉米面、马铃薯淀粉及MRS培养基中pH值及OD600nm的变化Fig.4 pH value and OD600nmchanges of SFC－2 at corn powder，potato starch and MRS medium
2.5 两组复合系在马铃薯淀粉与酵母粉不同配比固体培养基中的菌落数比较
在不同比例马铃薯淀粉与酵母粉培养基上接种经过多次活化的两组复合系（表1）.复合系LBC－8在马铃薯淀粉与酵母粉比例为3∶7时生长最多，为5.0×107 CFU ／mL，马铃薯淀粉与酵母粉比例为0∶10，1∶9，5∶5时略显减少，为4.2×107 CFU／mL，而在7∶3，9∶1，10∶0时均无生长.复合系SFC－2在马铃薯淀粉与酵母粉比例为5∶5时生长最多，为3.4×107 CFU／mL，3∶7，7∶3时略显较少，为3.1×107 CFU／mL，而在10∶0时无生长.两组复合系在马铃薯淀粉与酵母粉
固体培养基中的菌落数较MRS培养基中的菌落数8.2×107 CFU／mL和5.4×107 CFU／mL相比还是具有一定的差异.
表1 两种乳酸菌复合系在不同配比马铃薯淀粉与酵母粉培养基上的生长情况
（×107CF U／mL）Table 1 Growth of 2 kinds of LAB community at different proportion medium of potato starch and yeast powder复合系Community
马铃薯淀粉：酵母粉Potato starch：Yeast powder MRS培养基0∶10 1∶9
3∶7 5∶5 7∶3 9∶1 10∶0MRS medium LBC－8 4.2 4.2 5.0 4.3 －－－ 8.2 SFC－2 2.9 2.3 3.1 3.4 3.1 2.5 － 5.4
3 讨论与结论
1）复合系LBC－8在玉米面、玉米蛋白与葡萄糖的不同配比培养基中，生长最适
的配比均为与葡萄糖以7：3比例混合.
2）复合系LBC－8和SFC－2的pH值下降程度和OD600nm的增加幅度均在玉米面与葡萄糖培养基中较马铃薯淀粉与酵母粉培养基中明显，但与MRS培养基相比还是有一定的差异，OD600nm的增加幅度差异最明显.
3）经多次活化的复合系LBC－8和SFC－2分别在不同配比马铃薯淀粉与酵母粉
培养基中的菌落数比较结果，LBC－8和SFC－2分别在马铃薯淀粉与酵母粉3：7，5：5配比中菌落数最多，分别为5.0×107 CFU／mL和3.4×107平CFU／mL，但与 MRS培养基中的菌落数8.2×107 CFU／mL和5.4×107 CFU／mL相比还是具有一定的差异.
参考文献：
［1］杨洁彬.乳酸菌－生物学基础及应用［M］.北京：中国轻工业出版社，1996. ［2］张建友，李艳武，赵群波.冻干乳酸菌菌种增菌培养基的优化［J］.中国乳品
工业，2002，30（5）：40－43.
［3］张继英，张娅婷.不同选择性培养基对乳酸菌生长的影响［J］.信阳农业高等
专科学校学报，2006，16（3）：119－120.
［4］符桢华.乳酸菌培养基－菠萝皮汁与 MRS的对比试验［J］.现代食品科技，2009，25（12）：1 416－1 418.
［5］Weinberg Z G，Muck R E.New trendsand opportunities in the developmentand use of inoculants for silage［J］.FEMS Microbiology Reviews，1996，19：53－68.
［6］继亚君.青贮接种剂的应用研究概况［J］.青海畜牧兽医杂志，1996，26（2）：41－43.
［7］高丽娟，王小芬，杨洪岩，等.秸秆发酵乳酸菌复合系SFC－2的构建及其组成多样性研究［J］.环境科学，2007，28（5）：1 088－1 094.
［8］Lijuan Gao，Hongyan Yang，Xiaofen Wang，et al.Rice straw
fermentation using lactic acid bacteria［J］.Bioresource Technology，2008，99（8）：2 742－2 748.
［9］郑晓冬.食品微生物学［M］.杭州：浙江大学出版社，2001，103.
［10］牛天贵.食品微生物学实验技术［M］.北京：中国农业大学出版社，2002，144.
［11］赵斌，何绍江.微生物学实验［M］.北京：科学出版社，2002.。