乳腺癌耐药细胞株中 P-gp、CD147和 E-cadherin 表达的意义

乳腺癌耐药细胞株中 P-gp、CD147和 E-cadherin 表达的
意义
阎良;吴雪卿;黄建平;庞惠芳
【摘要】目的：探讨乳腺癌耐药细胞株中P-gp、CD147和E-cadherin表达的意义。

方法采用Western blot 方法，比较不耐药细胞、药物诱导的耐药细胞和
mdr1基因导入的耐药细胞中P-gp、CD147和E-cadherin（E-cd）表达的差异性。

结果 P-gp在不耐药细胞中表达很弱，而在两株耐药细胞中均呈高表达。

CD147在药物诱导的耐药细胞中表达增强，分子量较小。

而E-cd在药物诱导的
耐药细胞中表达缺失。

结论药物诱导和基因转入均能造成乳腺癌细胞产生多药耐药，而CD147和E-cd在三株乳腺癌细胞中的表达差异与mdr1基因或P-gp蛋白表
达并无直接关系，其内在的关系及临床意义值得深入探讨。

%Objective To explore the expression of P-gp、CD147 and E-cadherin in drug-resistant breast cancer cells . Methods The expression of P-gp,CD147 and E-cd in multi-drug resistance ( MDR) human breast cancer cell line MCF 7/Adr
( induced by adriamycin ) , MCF7/MDR ( mdr1 gene transmited ) and their sensitive parental line ( MCF7 ) were compared by Western blot.Results
The expression of P-gp was much higher in MCF7/Adr and MCF7/MDR than that of MCF7.Increased production of CD147,with ligher molecular weight ,was observed in the MCF7/Adr.The expression of E-cd could be
find in MCF7/MDR and MCF7,while lost in MCF7/Adr.Conclusion Both adriamycin and gene transmition can induce breast cancer cell to produce MDR.The expression of CD147 and E-cd in the 3 cancer cell lines has no
relation with mdr 1 gene or expression of P-gp,their relationship is worthy of further investigation .
【期刊名称】《实用癌症杂志》
【年(卷),期】2014(000)009
【总页数】3页(P1060-1062)
【关键词】乳腺癌;耐药细胞;基因表达;P-gp蛋白;CD147蛋白;E-cadherin蛋白【作者】阎良;吴雪卿;黄建平;庞惠芳
【作者单位】200021 上海中医药大学附属曙光医院;200021 上海中医药大学附属曙光医院;200021 上海中医药大学附属曙光医院;201203 上海中医药大学病理教研所
【正文语种】中文
【中图分类】R737.9
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来乳腺癌的发病率有明显的增高。

化学药物治疗作为乳腺癌术前或术后辅助治疗得到了广泛的应用，肿瘤体积大的乳腺癌术前短期化疗可使肿瘤体积缩小，有利于手术切除，但对术后长期的化疗以及无法手术患者姑息性化疗的意义有不同的意见。

近年来的研究发现化疗药物诱发的肿瘤细胞多药耐药(MDR)和侵袭转移之间可能存在某种关联，乳腺癌细胞在MDR药物作用下不但P-gp和EMMPRIN(CD147)表达增强，还可能出现上皮-间质转化(EMT)，这种转化有利于肿瘤细胞逃避化疗药物的攻击，并促进肿瘤细胞侵袭转移[1]。

但EMT的发生与mdr基因活化的关系尚不清楚。

本课题通过比较不耐药乳
腺癌细胞株(MCF-7)、相应的用化学药物诱导的乳腺癌耐药细胞株(MCF-7/Adr)和多耐药基因1(multidrug resistance gene1，mdr1)导入建立的乳腺癌耐药细胞
株(MCF-7/MDR1)中P-gp、CD147和E-cadherin(E-cd)的表达，以探讨MDR
基因与CD147表达以及肿瘤细胞EMT的关系。

1 材料与方法
1.1 细胞株
不耐药乳腺癌细胞株(MCF-7)和相应的用化学药物诱导的乳腺癌耐药细胞株(MCF-7/Adr)购自中国科学院上海细胞研究所，mdr1导入建立的乳腺癌耐药细胞株(MCF-7/MDR1)由复旦大学上海医学院病理学系惠赠。

细胞用RPMI 1640 (gibco BRL，karlsruhe，germany)培养液培养(Thermo培养箱和超净工作台)，培养液中含有10%小牛血清、100 U/mL盘尼西林及100 μg/mL链霉素，37℃、5%CO2的温箱中培养。

每隔48 h换培养液。

用0.25%的胰蛋白酶消化，收集并传代。

实验选用对数生长期的细胞。

1.2 Western blot方法
收集细胞经预冷的PBS清洗，置细胞裂解液(50 mM pH 8.0 Tris-HCl，150 mM NaCl，1%NP-40，0.1%SDS，0.5% NaN3，2 mM EDTA，25×蛋白酶抑制剂)，冰浴30 min，4℃离心(12，000 r/min，10 min)收集上清，按照BCA Protein Assay Kit定量。

不连续(8%分离胶和5%的浓缩胶)垂直SDS-PAGE电泳仪(Bio-Rad)电泳，每孔上样蛋白50 μg，电泳完成后，蛋白条带经湿式转移仪(Bio-Rad)转移到硝酸纤维素膜上。

经3%脱脂奶粉封闭，用鼠抗抗人P-gp (Chemicon公司)、兔抗人E-cadherin (Santa Cruz公司)、鼠抗人CD147(Santa Cruz公司)和β-actin抗体(Sigma公司)37℃孵育1 h，4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗(Amersham Pharmacia Biotech)37℃孵育30 min，化学发光法显示条带(ECL kit，amersham pharmacia biotech)。

2 结果
Western blot结果显示三株细胞中P-gp、CD147和E-cd存在差异表达。

由图1可见，P-gp在不耐药细胞中表达很弱，而在两株耐药细胞中均呈高表达。

CD147在不耐药细胞和导入mdr1基因细胞中的表达相近，在药物诱导的耐药细胞中表达增强，而且其条带的位置偏下，提示其分子量较小。

而E-cd在不耐药细胞和导入mdr1基因细胞中均有表达，在后者中表达更为明显，但在药物诱导的耐药细胞中无表达。

图1 Western blot 检测结果
3 讨论
P-gp是mdr1编码的跨膜糖蛋白，人类的mdr1基因位于第7号染色体上，全长约330 kb，转录41～45 kb的高度同源的RNA，翻译的氨基酸残基分子量约为140 kD，其翻译后修饰加上去的糖链约为30 kD，两者总分子量为170 kD，即为P-gp。

P-gp可以利用它的疏水位点与疏水性抗肿瘤药物结合，通过ATP水解供能，逆浓度梯度将药物泵出细胞外，导致细胞内药物浓度降低而产生耐药[2]。

本实验结果显示P-gp在2株耐药细胞中高表达，不耐药细胞中表达很弱，提示敏感乳腺癌细胞株MCF-7经阿霉素诱导或mdr1基因转染均可表达P-gp，从而产生耐药性。

CD147为分子量50 000～60 000的跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员[3]，已被证实为广泛存在于肿瘤细胞中[4-7]。

在本实验发现在mdr1基因导入的耐药细胞与药物诱导的耐药细胞CD147的表达不同，前者与不耐药细胞的表达相似，而在药物诱导的耐药细胞中表达增强，提示mdr1基因导入引起的P-gp表达增多本身并不能直接影响CD147的表达。

有文献报道CD147转染能增强乳腺癌细胞株MMPs的表达，加速在裸鼠内的成瘤性，并促进肿瘤的浸润和转移[8]。

也有报道CD147还能影响乳腺癌细胞mdr1基因转录和P-gp表白的表达[9]。

本实验还
发现药物诱导的而药细胞株中CD147不但表达增强，而且其条带的位置偏下，提示其分子量较小，这可能与其糖化程度有关，而一般认为CD147分子的糖化对促进MMPs表达等作用的体现是必需的[10]。

这种表达量和糖化水平的不同是否可
能与药物诱导和基因转入引起的耐药细胞株许多不同的生物学表现有关尚有待深入研究。

上皮细胞向间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程[11]。

EMT是肿瘤发生转移的重要机制之一，在肿瘤细胞侵袭和远处转移过程中
起着重要作用。

有文献报道高剂量的阿霉素可能诱导MCF7细胞发生EMT，表现为E-cd、CK19表达降低，α-SMA、vimentin表达升高，同时癌细胞的耐药性和体外侵袭力也得以增强[1]。

本实验发现不耐药细胞和导入mdr1基因细胞中E-cd 均有表达，但在药物诱导的耐药细胞中E-cd阴性，这显示基因导入与药物诱导肿瘤细胞耐药的差异性，即药物诱导的耐药细胞株可能具有更为明显的EMT倾向，这也可以解释MCF-7/Adr乳腺癌细胞为什么比MCF7和MCF7/MDR1具有更强的侵袭和转移能力。

这种差异显然也并不是mdr1基因或P-gp蛋白表达增高的直接结果，进一步探讨其内在联系和可能的影响环节将具有明显的理论意义和临床应用前景。

参考文献
[1] Li QQ，Xu JD，Wang WJ，et al.Twist1-mediated adriamycin-induced epithelial-mesenchymal transition relates to multidrug resistance and invasive potential in breast cancer cells〔J〕.Clin Cancer Res，2009，15(8)：2657-2665.
[2] Loo TW，Clarke DM.Recent progress in understanding the- mechanism of P-glycoprotein-mediated drug efflux〔J〕.J Membr Biol，2005，206(3)：
173-185.
[3] Biswas C，Zhang Y，DeCastm R，et al.The human tumor ce-ll-derived collagenase stimulatory factor(renamed EMMPRIN)is a member of the immunoglobulin superfamily〔J〕.Cancer Res，1995，55(2)：434-439. [4] Sameshima T，Nabeshima K，Toole BP，et al.Glioma cell e- xtracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN)(CD147)stimulates production of membrane-type matrix metalloproteinases and activated gelatinase A in co-cultures with brain-derived fibroblasts〔J〕.Cancer Lett，2000，157 (2)：177-184.
[5] Kanekura T，Chen X，Kanzaki T.Basigin(CD147)is expressed on melanoma cells and induces tumor cell invasion by stimulating production of matrix metalloproteinases by fibroblasts〔J〕.Int J Cancer，2002，99(4)：520-528.
[6] 陈翔，林静，林伟，等.CD147 siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖及
CD147表达的影响〔J〕.中华皮肤科杂志，2006，39(4)：204-206.
[7] 王善伟，陈丽荣.CD147、MMP-9和P-ERK在乳腺癌中的表达及临床意义〔J〕.实用肿瘤杂志，2007，22(2)：133-137.
[8] Zucker S，Hymowitz M，Rollo EE，et al.Tumorigenic potential of extracellular matrix metalloproteinase inducer〔J〕.Am J Pathol，2001，
l58(6)：1921-1928.
[9] Li QQ，Wang WJ，Xu JD，et al.Involvement of CD147 in regulation of multidrug resistance to P-gp substrate drugs and in vitro invasion in breast cancer cells〔J〕.Cancer Sci，2007，98(7)：1064-1069.
[10] Tang W，Chang SB，and Hemler ME.Links between CD147 function，
glycosylation，and caveolin-1〔J〕.Mol Biol Cell，2004，15(9)：4043-4050.
[11] Lee JM，Dedhar S，Kalluri R，et al.The epithelial-mesench- ymal transition：new insights in signaling，development，and disease〔J〕.J Cell Biol，2006，172(7)：973-981.。