肝脏P450还原酶特异性敲除小鼠模型在毒理学中的应用

肝脏P450还原酶特异性敲除小鼠模型在毒理学中的应用1 Application of Liver-specific Cytochrome P450 Reductase knockout mice inToxicology肖瑛，武元峰，薛翔，顾军，任进*Xiao Ying, Wu Yuanfeng, Xue Xiang, Gu Jun, Ren Jin中国科学院上海药物研究所，新药研究国家重点实验室,上海201203State Key Laboratory for New Drug Research，Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 201203关键词: NADPH-细胞色素P450酶还原酶，基因敲除，器官毒性Key Word: NADPH-P450 Cytochrome Reductase, Knockout, Organ Toxicity1.引言微粒体细胞色素P450单加氧酶（P450，CYP）在内源与外源性化合物的生物转化中起着重要的作用。

P450酶蛋白种类的多样性及其底物的重叠性使P450酶系可以催化多种类型的反应，不仅对许多外来物质如杀虫剂及环境有毒物质具有代谢作用，还参与一些起重要生理功能的内源性物质如激素、脂肪酸的代谢。

P450酶的功能与生物学作用的重要性，使其研究具有广阔的应用前景。

通过调控其表达和活性，可望改变生物体内外源性化合物尤其是药物的代谢，对于药物的研究和开发也有重要的意义。

由于P450酶系的生物学重要性，自其发现以来，该酶系的研究一直是药理学和毒理学中一个十分引人注目的领域。

P450酶基因的多态性使其有多种亚型且多具有类似的功能和相似的组织分布特征，使在一个特异组织中很难去区别单个P450酶亚型的功能。

目前已有多个P450酶亚型敲除（knockout，KO）小鼠模型，这些模型已被广泛用来研究特异性P450酶亚型在外源性化合物的代谢和毒性中的作用[[1]]。

然而这些KO模1基金项目：国家重点基础研究发展计划973项目（编号：2006CB504700）作者简介：肖瑛（1981-），女，博士研究生，研究方向为药物毒理学。

*通讯作者：任进，Email: CDSER_SIMM@mail. Tel & Fax：（021）50806600-2207型都只能是针对同源性较小的P450酶亚型，对于同源性较大的亚型较难敲除；而且由于目前对于小鼠Cyp基因的调控、底物特异性以及小鼠Cyp基因的种属差别等方面还没有较全面的认知，所以对于很多P450酶亚型来说此种敲除方法是不可行的。

Hildebrandt等提出NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR/POR）是所有微粒体P450酶的氧化还原搭档[2]，它提供P450酶氧化还原反应所需的第一个电子。

基于这个原理，策略之一就是开发一个靶向敲除P450还原酶-Cpr基因的小鼠模型，其表达的缺失将抑制所有微粒体P450酶的活性。

并且由于CPR 在胚胎发育中具有重要功能，所以只能采用条件敲除（conditional knock）的手段来得到Cpr基因敲除小鼠模型。

通过条件敲除方法已经得到肝脏CPR特异性敲除小鼠模型[3]，肺脏CPR特异性敲除小鼠模型[4]，心脏CPR 特异性敲出小鼠模型[5]和全身低表达CPR的小鼠模型[6]，这些敲除小鼠模型在化合物的毒性机制研究中有着广阔的应用前景。

2.肝脏CPR特异性敲除小鼠模型概况英国和美国的两个研究小组分别应用（conditional knockout）条件敲除的手段（图1）建立了肝脏CPR特异性敲除小鼠模型[3, 7]。

该模型将限制性内切酶酶切位点标记在Cpr基因两侧，并在肝脏中特异性表达可以识别该位点的Cre 酶，从而使小鼠在发育过程中肝脏Cpr基因被逐渐敲除导致CPR蛋白表达的缺失，最终使得肝脏P450酶活性丧失。

其主要特征为：图1肝脏CPR特异性敲除小鼠模型建立方法图解2.1 繁殖能力以及一般特征肝脏CPR特异性敲除小鼠（Cpr-Null）小鼠交配繁殖的结果表明它们可繁育，产仔数平均为6仔/窝，无胎致死性。

Null小鼠在被毛颜色、一般外观及日常活动都表现正常。

2.2 组织特异性Cpr基因敲除肝脏CPR表达的缺失通过免疫印迹可见3周时在Null小鼠肝脏微粒体CPR 蛋白表达减少为野生型小鼠（wild-type，WT）的约18%，2个月大时Null小鼠肝脏中已经检测不到CPR蛋白（图2）。

因此，2个月大时纯合子中的CPR表达基本已经缺失。

另一方面，妊娠第14天时检测鼠胚时，未观察到CPR蛋白水平的改变。

同时在2个月大时在此两种小鼠的肺、肾、脑和鼻粘膜中微粒体中CPR 蛋白表达水平无显著差异，再次证实了Cre表达的组织特异性以及CPR缺失的特异性。

图2 CPR蛋白的表达2.3 CPR表达的降低对微粒体CYP和HO活性的影响蛋白活性检测结果表明2个基因型间肝微粒体CPR的活性的差别与CPR蛋白水平的差别相一致，随着肝脏CPR蛋白表达水平的下降，2个月大时Null小鼠肝脏CPR、P450酶以及血红素氧合酶（HO）的活性相对WT小鼠都已经下降到几乎检测不到的水平（图3）。

这些数据同时也证实了CPR是微粒体CYP和HO主要的电子供体。

图3 2月龄Null小鼠肝脏中酶活性比较2.4 肝中降低的CPR表达对胆固醇平衡和肝形态的影响多种依赖CPR的酶都参与胆固醇的合成，Null小鼠中肝CPR活性的降低导致2个月时胞浆总胆固醇水平与野生型相比较下降80%，同时雌雄Null小鼠肝重/体重皆显著上升。

但是体重及其他器官如肾、肺、心脏和脑的重量没有明显改变。

与WT小鼠肝脏相比，Null小鼠的肝脏体积增大，颜色较淡，镜下病理检查可见脂肪空泡变性（图4）。

图4 肝脏的大体观察和病理检查2.5 肝脏CPR表达缺失对肝CYP、HO-1、HO-2和环氧化物水解酶的影响Null小鼠在3周和2个月大时，伴随肝脏CPR表达的显著下降，肝脏微粒体总CYP含量明显增加为WT小鼠肝脏的2倍和3倍，而肾微粒体中CYP含量也没有增加。

免疫印迹显示P450 1A、2E1、3A分别增加了1倍，2B增加了3倍，2A蛋白水平增加了5倍。

HO-1的水平也增加了约9倍，HO-2和环氧化物水解酶却没有受到影响。

3. 肝脏CPR特异性敲除小鼠的应用多个研究小组应用该小鼠模型对多种化合物进行了研究，结果表明该模型对众多外源性化合物的毒性机制研究很有价值。

3.1肝脏Cpr基因敲除对醋氨酚（acetaminophen）器官特异性毒性的影响[8]过量醋氨酚可引起肝脏和许多肝外器官的损伤，已有研究表明P450酶在醋氨酚的代谢活化中起着重要的作用，但是肝外器官的毒性是否和醋氨酚在肝脏中的生物转化相关却不清楚。

应用肝脏CPR特异性敲除小鼠模型进行研究，发现Null小鼠比WT小鼠对醋氨酚的肝脏毒性更加耐受，而且在相同的血药浓度下，Null小鼠中醋氨酚的肺脏、肾脏毒性相对WT中有所减轻，然而在鼻粘膜中毒性反而增大。

该研究表明鼻粘膜中醋氨酚的毒性与其在肝脏中的转化无关，而其它脏器如肺和肾脏中的毒性却与肝脏中产生的醋氨酚的代谢产物有关系。

3.2肝脏P450酶在环磷酰胺（cyclophosphamide）的毒代动力学以及毒性中的作用[9]环磷酰胺是一个抗癌的前体药物，它的药效的发挥需要依靠P450酶的活化。

虽然在临床已经用于抗癌有50年之久，但是关于其毒性与药效的关系却依然研究很少。

应用肝脏CPR特异性敲除小鼠模型来研究肝脏P450酶的代谢在环磷酰胺的毒代动力学中的作用，发现Null小鼠中环磷酰胺的清除速率以及体外肝脏微粒体代谢速率比WT小鼠中下降了6倍多。

环磷酰胺的主要代谢产物在Null 小鼠中虽有生成，但是半衰期延长近2倍，C max下降也近2倍。

研究表明肝脏的代谢是环磷酰胺吸收和分布中的主要路径，而且P450酶介导的氧化反应是环磷酰胺清除过程中的一个重要步骤。

3.3肝脏Cpr基因敲除对氯仿（chloroform）所致肾毒性的影响[10]氯仿是一种常用的化学试剂，可引起肝脏和肾脏的损伤。

已有体外实验表明氯仿可被肾脏P450酶代谢为具有肾毒性的中间产物，但是肾脏P450酶在氯仿所引起的肾毒性中所起的作用并没有直接的体内证据。

应用肝脏CPR特异性敲除小鼠模型研究发现，给予氯仿后，Null小鼠的肾毒性比WT小鼠更严重。

同时，组织分布结果表明，Null小鼠组织中的氯仿含量要高于WT小鼠。

该研究表明肝脏P450酶的缺失并不能使氯仿引起的肾毒性减轻，进一步提示肾脏P450酶在氯仿引起的肾毒性中发挥着重要的作用。

3.4肝脏P450酶在马兜铃酸（aristolochic acid）肾病中的作用[11]马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy, AAN）一直受到众多学者的广泛关注，但是关于马兜铃酸的代谢和其引起的肾毒性之间的关系却不是很清楚。

我们应用肝脏CPR特异性敲除小鼠模型研究发现，给予马兜铃酸I后，Null小鼠的肾脏损伤比WT小鼠更严重，而WT小鼠预给药CYP1A的诱导剂3-MC后，马兜铃酸I引起的肾毒性减轻，存活率提高。

Null小鼠中马兜铃酸I的清除率低于WT小鼠和3-MC预给药的小鼠。

组织分布结果表明，Null小鼠肝脏和肾脏中马兜铃酸I的分布高于WT小鼠，WT小鼠又高于3-MC预给药的小鼠。

同时，细胞水平研究表明，马兜铃酸I对人肾小管上皮细胞的毒性高于它的主要代谢产物马兜铃内酰胺I，而且在有S9活化系统存在的情况下马兜铃酸I引起的细胞毒性降低。

该研究表明肝脏P450酶可以将马兜铃酸代谢为毒性较低的代谢产物，因此在马兜铃酸I引起的肾毒性中具有解毒作用。

此外，肝脏CPR特异性敲除小鼠还用来研究P450和过氧化物酶在环境致癌物苯并芘和3-硝基苯并蒽醌的生物活化中的作用[12, 13]以及作为一种体内筛选模型对多种化合物进行了研究[14]，同时此模型还可以用于脂类代谢的研究等[15, 16]。

4.结语肝脏CPR特异性敲除小鼠模型可以用来系统地从整体动物的水平来研究肝脏P450酶以及CPR相关的酶在内外源性化合物的生物转化中的作用。

该小鼠模型在肝外毒性化合物如肾毒性化合物、肺毒性化合物等的毒性机理研究中有着重要的应用前景，可用来研究靶器官内的毒性是否和肝脏中的生物转化相关，以及肝脏中生物转化与靶器官内生物转化分别在该化合物毒性中的作用，同时亦可对比研究原型化合物与代谢产物的毒性机制。

在外源性化合物的代谢研究中，该小鼠模型尤其有着广阔的应用前景。

肝脏是体内最重要的参与外源性化合物代谢的器官，其中P450酶是最主要的参与代谢转化的生物酶，该小鼠模型可以用来研究化合物是否经过肝脏P450酶代谢及代谢途径是否唯一。