引物探针设计简介
引物探针验证的实验方法
引物探针验证的实验方法在分子生物学领域，引物探针验证是一种常用的实验方法，用于检测目标DNA序列的存在与数量。
本文将详细介绍引物探针验证的实验方法，包括实验原理、实验步骤、注意事项等方面，以帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
一、实验原理引物探针验证实验基于聚合酶链式反应（PCR）技术，通过设计特定的引物和探针，使目标DNA序列在PCR过程中特异性扩增，并通过探针检测扩增产物，从而实现对目标序列的定量分析。
二、实验步骤1.设计引物和探针：根据目标DNA序列，设计特异性引物和探针。
引物长度一般为20-25个核苷酸，探针长度一般为15-25个核苷酸。
2.提取模板DNA：从待测样本中提取DNA，作为PCR反应的模板。
3.配制PCR反应体系：根据实验需求，配制含有引物、探针、dNTPs、DNA聚合酶等试剂的PCR反应体系。
4.PCR扩增：将PCR反应体系放入PCR仪中，进行以下循环扩增：- 94℃预变性5分钟；- 94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30-40个循环；- 72℃延伸5分钟。
5.分析PCR产物：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带的大小和亮度，初步判断实验结果。
6.探针检测：将PCR产物与标记有荧光的探针进行杂交反应，通过荧光检测仪分析荧光信号，实现对目标序列的定量分析。
三、注意事项1.引物和探针设计：确保引物和探针的特异性，避免非特异性扩增。
2.模板DNA提取：保证模板DNA的质量和浓度，以获得可靠的实验结果。
3.PCR反应体系：根据实验需求，调整各试剂的浓度和比例。
4.PCR扩增：严格控制PCR反应条件，避免扩增过程中的污染。
5.结果分析：结合琼脂糖凝胶电泳和荧光检测，综合判断实验结果。
四、实验总结引物探针验证实验是一种准确、高效的分子生物学检测方法。
通过掌握实验原理和步骤，严格遵循注意事项，可以获得可靠的实验结果。
Taqman设计总结
Taqman设计总结⼀、单重Taqman引物探针设计：（为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast中核实⼀次）1、探针：探针的设计应该在引物的设计之前①长度：18~35（18~30之间最好、最常见），最长37；太长淬灭效果不好。
② TM值：Primer Express软件计算出来的Tm值在66~72℃之间（最常见68~70℃），最好为70℃，确保探针的Tm值要⽐引物的Tm值⾼出5~10℃，GC含量在30~80%（最好40%~70%），因此探针最好是富含GC的保守⽚段；（Primer Express：Do not expand the Tm range by more than 2 °C from the default range）。
③探针位置：尽可能地靠近上游引物,上游引物的3' 端离探针的5' 端为1-20bp（⼀般10个以内），最好是探针的5'端离上游引物的3' 有1个碱基。
④5'端应避免使⽤碱基G，5' G会有淬灭作⽤，即使被切割下来这种淬灭作⽤也还会存在；如果选择FAM-dye在5'端第⼆个序列也不能为G（G in the second position on the 5' end in FAM dye-labeled probes can reduce fluorescent normalized reporter signal）。
⑤可选：整条探针中，碱基C的含量要明显⾼于G的含量，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另⼀条链作为探针。
要同时考虑在正反两条链上设计引物与探针。
若找不到完全保守的⽚段，也只能选取有⼀个碱基不同的⽚段，且这个不同的碱基最好在探针的中间，且最好为A或T。
⑥Repeating oligonucleotides：a. 避免探针中同⼀碱基重复过多，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现，即≦3（Avoid runs of identical nucleotides. If repeats are present, there must be fewer than four consecutive G residues.）；b. 避免连续的6个A出现（Consecutive A residues：Avoid six consecutive A residues anywhere in the probe.Consecutive A residues can cause a high No Template Control (NTC) signal）；c. 避免探针的中间区域含有2个或以上的CC dinucleotides（Avoid two or more CC dinucleotides in themiddle of the probe, which can sometimes reduce signal）。
定量PCR引物探针设计原则
定量PCR引物探针设计原则定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于测量DNA分子数量的技术。
在进行定量PCR实验时，合理设计引物和探针非常重要，下面将探讨一些定量PCR引物和探针设计的原则。
1.引物设计原则：1.1引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致非特异性扩增，而过长的引物可能导致扩增效率降低。
1.2引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，过高或过低的GC含量都可能导致非特异性扩增。
1.3引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间，可以通过计算引物序列的碱基组成和长度来预测引物的Tm值。
1.4引物的特异性：引物的特异性是设计引物时最关键的考虑因素之一、引物的特异性可以通过检查与该引物匹配的靶标序列在基因组或转录组中的唯一性来评估。
可以使用生物信息学工具，如BLAST（基本局部序列比对）来分析引物的特异性。
此外，还可以使用引物的3'末端碱基序列的特异性来提高引物的特异性。
2.探针设计原则：2.1探针的长度：探针的长度一般在20-30个碱基对之间。
2.2探针的熔解温度（Tm）：与引物类似，探针的Tm值也应在50-60摄氏度之间。
2.3探针的特异性：与引物一样，探针的特异性也是设计探针时需要考虑的重要因素。
探针的特异性可以通过生物信息学工具来分析，如BLAST。
此外，还可以设计探针的3'末端碱基序列来提高其特异性。
2.4探针的化学修饰：在实验中，通常使用荧光标记的探针来实现定量PCR。
探针可以通过荧光基团，如FAM、VIC、HEX等进行标记。
此外，还可以在探针的两端引入磷酸酯键或磷酸二酯键等化学修饰，以提高探针的稳定性和特异性。
总结起来，定量PCR引物和探针的设计需要考虑引物长度、GC含量、熔解温度和特异性等因素。
在设计引物和探针时，可以使用生物信息学工具来分析其特异性，并通过化学修饰来提高其稳定性和特异性。
引物探针区别_国际标准_解释说明以及概述
引物探针区别国际标准解释说明以及概述1. 引言1.1 概述引物和探针在生物学和分子生物学研究中起着至关重要的作用。
它们是使用特定序列来检测或扩增DNA或RNA分子的小片段。
通常情况下，引物和探针被设计成与目标DNA或RNA序列互补。
1.2 文章结构本文将详细介绍引物和探针的定义及其作用，并对它们之间的区别进行阐述。
同时，我们还将解释国际标准对于引物和探针的规范并对相关条款进行说明。
最后，我们将总结引物和探针的区别以及它们在不同应用场景中的作用，并提出对国际标准的评价与建议。
1.3 目的本文旨在帮助读者更好地理解引物和探针的概念、作用以及它们之间的区别。
此外，通过解释国际标准对于引物和探针的规范要求，了解如何正确地设计和使用这些分子工具。
通过阐明引物和探针在科学研究中的重要性，可以提高读者对于这些技术应用的认识水平，并为进一步开展相关研究提供基础知识。
2. 引物和探针的定义及作用2.1 引物的含义和作用引物是指在DNA分子复制、扩增以及序列测定等实验中，用于特异性识别并结合到目标DNA序列上的短链寡核苷酸。
引物通常由20-30个碱基组成，其序列应与目标DNA序列互补或部分互补，在实验过程中起到引导扩增反应、选择性检测目标序列等作用。
引物在聚合酶链反应（PCR）中起特异性识别某一目标基因片段的作用，通过与目标DNA序列互补配对形成稳定的引物-模板复合体，为DNA聚合酶提供一个起始点进行扩增。
引物的设计需要考虑多个因素，包括GC含量、长度、配对形式和温度等参数，以确保引物能够高效地结合目标序列而不与其他非特异性序列杂交。
2.2 探针的含义和作用探针是指在基因组学研究、荧光原位杂交等实验中使用的一类带有特定报告信号（如荧光染料或放射性同位素）的核酸分子。
探针通常由20-30个碱基组成，可以与目标DNA或RNA序列特异性结合，并通过检测信号来定位和识别目标序列。
探针的设计需要依据具体实验需求确定，可以是荧光探针、原位杂交探针、Northern分析中使用的RNA探针等。
PCR和定量PCR的引物和探针设计
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增特定DNA序列的技术。
引物和探针是PCR中的关键组成部分，它们的设计对PCR的灵敏度和特异性至关重要。
引物是专门设计用于扩增目标DNA序列的两个短链DNA片段。
对于PCR反应的成功与否，引物的设计是至关重要的。
在引物设计中，以下几个因素需要考虑：1.引物长度：引物通常由18-24个碱基组成。
引物过短可能导致非特异扩增，而引物过长可能导致特异扩增低下。
2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与目标序列之间的碱基配对。
避免引物序列中存在重复和寡聚核苷酸，以防止非特异扩增。
3.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）是引物与模板DNA断裂的温度。
引物的Tm值应相似，通常在50-65℃之间。
4.引物之间的互补性：引物之间应避免自身互补或与对方互补，以防止引物形成二聚体或无特异性扩增。
探针是一种带有荧光标记的SSO（特异性杂交寡核苷酸）或DSA（二链特异性杂交寡核苷酸），它能够检测到靶序列的扩增。
探针分为两类：探针（Hydrolysis Probes）和探针（Molecular Beacon Probes）。
1. 探针（Hydrolysis Probes）：这种探针包含一个与靶序列互补的引物和一个结合到引物上的荧光染料和一个淬灭器。
当DNA扩增反应进行时，引物与靶序列结合，使荧光染料与淬灭器距离远离，并发出荧光信号。
这种探针的设计需要考虑引物和探针之间的互补性，以确保特异性扩增和信号产生。
2. 探针（Molecular Beacon Probes）：这种探针是一段独特的DNA 或RNA序列，两端固定一个荧光染料和一个淬灭器。
当探针与靶序列结合时，形成一个折叠的结构，将荧光染料和淬灭器分开。
这种探针的设计需要考虑探针序列的互补性和结构的稳定性。
在引物和探针设计中1.特异性：引物和探针应与目标DNA序列具有高度特异性的互补性，避免与非目标DNA序列发生杂交。
定量PCR引物探针设计原则
定量P C R引物探针设计原则TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】定量P C R引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar 等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
RPA技术原理及引物探针设计简介
英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。
RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。
这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。
RPA技术特点常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。
RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。
这无疑能大大加快PCR的速度。
此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。
据介绍，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。
而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。
RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。
不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条（侧流层析试纸条LFD）读取结果。
目前，TwistAmp® 试剂盒的扩增子长度在500bp以内。
不过，经过特别优化的RPA扩增，也可以生成更长的扩增产物，或者减慢扩增速度（便于定量），甚至在更低的温度下进行反应。
RPA技术原理首先重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列。
然后一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。
被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。
在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。
整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
RPA扩增的基础体系（TwistAmp® Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，只要准备好引物和模板就行。
引物探针设计
自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，T aqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般T aqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则* 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
* 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
* 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
PCR和定量PCR的引物和探针设计
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）和定量PCR（实时荧光定量聚合酶链反应）是现代分子生物学中常用的实验技术，用于扩增和检测DNA序列。
在 PCR和定量 PCR 中，引物（primers）和探针（probes）的设计是非常重要的，因为它们直接影响到实验的灵敏度和特异性。
引物是一对短的DNA分子，通常由15-30个核苷酸组成，它们会被限制性酶切割出位于目标序列两端的DNA片段。
引物的设计需遵循以下几个原则：1.引物的碱基组成：引物应具有合适的碱基组成。
GC含量较高的引物有更强的互补性和比特性，但也更容易形成二聚体，影响PCR反应的特异性和效率。
通常引物的GC含量应在40%-60%之间。
2.引物的长度：引物的长度应在18-28个碱基对之间。
引物过短会导致扩增产物的非特异性，引物过长会降低扩增效率。
3. 引物的 Tm 值： Tm 值（熔解温度）是指引物与模板 DNA 结合时解链的温度。
引物的 Tm 值应保持一致，一般在55°C - 65°C 之间。
在设计扩增子（amplifier）时，引物的 Tm 值差异应在1°C 以内，以确保扩增的特异性。
探针是一种特殊的分子，它包含一个与目标序列完全互补的引物序列和一个荧光染料分子。
探针的设计需遵循以下几个原则：1. 荧光染料的选择：选择一个与实验设备所能感测的波长相适应的荧光染料。
常见的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、荧光素异硫氰酯（FITC）以及羧基甲基罗damine（ROX）等。
2. Quencher 的选择：设定探针的Quencher。
一般使用的Quencher是BHQ1，或者参考其他文献上的Quencher的讯息。
3.引物和探针的序列：引物和探针的序列应与目标序列完全互补。
引物和探针的设计应尽量避免任意位置出现连续的鸟嘌呤（G）或者鸟嘧啶（C），以避免互结和三聚体的形成。
4.引物和探针的位置：引物和探针的位置非常重要。
定量PCR 引物、探针设计原则
精心整理定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→的DNA保持GC典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之间的TM相差避免超过2℃引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
引物探针设计简介【最新】
引物探针设计简介已有2993 次阅读2009-1-1 20:48|个人分类:课堂集锦|系统分类:科研笔记1．寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。
所选的引物序列将决定PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。
好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。
引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。
当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。
计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。
一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。
计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。
通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。
因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。
需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5'端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。
2．基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
特异性是指发生错误引发的频率。
特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。
如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。
引物探针设计培训资料
06
引物探针设计实践操作 练习
设计简单的基因组引物探针
总结词
掌握基本设计原则
详细描述
学习如何根据基因组序列选择合适的引物和探针，了解引物探针的长度、GC含量、特异性等基本参数，掌握避 免引物二聚体和发夹结构的方法。
设计复杂的转录组引物探针
总结词
提高设计技巧
详细描述
学习针对转录组测序数据的引物探针设计，了解不同转录本的表达丰度、拼接方式等，掌握设计多目 标检测引物探针的技巧。
设计特定的表观遗传学引物探针
总结词
拓展应用领域
详细描述
了解表观遗传学相关的甲基化、乙酰 化等修饰，学习如何设计针对特定修 饰的引物探针，掌握相关的实验验证 方法。
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引物探针设计
根据转录本序列，设计特异性引 物和探针。
转录组引物探针设计实例
实验验证
通过实验验证引物和探针的特异性。
结果分析
对实验结果进行分析，评估引物和探针的实用性。
转录组引物探针设计实例
注意事项
引物和探针的设计要充分考虑特异性，避免与非目标转 录本发生交叉反应。
注意转录本的拼接质量，确保转录本序列的准确性。
报告生成功能
软件可以自动生成包含设 计结果、引物探针信息和 相关分析结果的报告，方 便用户导出和使用。
03
引物探针设计实例分析
基因组引物探针设计实例
• 总结词：针对基因组引物探针设计，本实例提供了详细的步骤 和注意事项，帮助学员掌握基因组引物探针设计的原理和方法。
基因组引物探针设计实例
详细描述 设计步骤
探针是标记有荧光物质或其他可检测 标记物的寡核苷酸序列，用于检测特 定DNA或RNA序列的存在。
引物探针设计总结报告
引物探针设计总结报告引言引物探针设计是分子生物学研究中常用的实验手段，用于检测、分析和定量目标DNA或RNA序列的存在与表达水平。
准确、高效的引物探针设计是实验成功的关键。
在本报告中，我们将总结引物探针设计的基本原则和常用策略，并讨论一些优化方法，以期帮助研究人员在进行引物探针设计时取得更好的实验效果。
基本原则引物探针设计的准确性和可靠性至关重要，以下是一些基本原则可以用来指导引物探针设计的过程。
1. 特异性：引物探针应具有较高的目标序列特异性，以避免与非目标序列杂交，导致假阳性结果。
这可以通过在引物和探针序列中加入一些特异性碱基或序列来实现。
2. 稳定性：引物和探针应具有适当的碱基组成和长度，以提高稳定性。
引物和探针长度通常在15到30个碱基对之间，GC含量约为40%-60%。
3. Tm值：引物和探针的熔解温度（Tm值）应该相似，以确保它们可同时在同一温度下进行PCR反应。
Tm值计算可以使用公式Tm = 2(A+T) + 4(C+G)，其中A、T、C、G分别代表引物或探针序列中相应碱基的个数。
4. 避免互补和二聚体形成：引物和探针之间以及引物自身之间的互补性碱基对和二聚体形成应该尽量避免。
这可以通过使用特殊的软件工具进行分析和预测来实现。
常用策略在引物探针设计过程中，有一些常用的策略可以提高设计的效果。
1. 引物设计：PCR反应中常用的引物设计策略包括：提取目标序列的保守区域进行设计，避免重复序列或多态性位点，避免SNP位点，避免GC-rich或AT-rich 区域等。
引物长度通常在18到30个碱基对之间。
2. 探针设计：探针设计是用于检测靶标物的存在，并进行定量分析。
设计可以基于一种原理如荧光探针、近红外探针、分子信标探针等，或者结合多种原理来设计多功能探针。
切忌设计过长或过短的探针，避免非特异结合和背景信号干扰。
3. 引物探针设计工具：现在有许多在线的引物探针设计工具可以帮助研究人员完成设计。
随机引物标记探针的原理
随机引物标记探针的原理
随机引物标记探针的原理是利用引物（通常是随机序列）与待标记的探针的序列进行杂交反应，将引物与探针序列互相结合，并用标记物（如荧光染料或放射性同位素）对引物进行标记。
标记后的引物可以用于检测和定量待标记探针的存在和数量。
具体步骤如下：
1. 设计引物：引物通常为短序列的寡聚核苷酸，可以是完全随机的或部分随机的，以提高杂交反应的特异性。
2. 合成引物：根据设计的引物序列，合成相应的引物。
3. 标记引物：将引物与标记物（如荧光染料）进行化学修饰，将标记物连接到引物上。
4. 杂交反应：在杂交反应体系中，将标记的引物与待标记的探针序列进行杂交，使引物与探针互相结合。
5. 检测：利用标记物的性质（如荧光）对标记的引物进行检测和定量，从而间接检测和定量待标记的探针序列的存在和数量。
随机引物标记探针的优点是简单、快速，适用于大规模的探针标记，并且具有较高的特异性和敏感性。
然而，随机引物的选择可能会引入一定的非特异性杂交信号，在实验设计和数据分析时需要注意控制和纠正这些影响。
探针法引物设计原理
探针法引物设计原理今天来聊聊探针法引物设计原理。
探针法在分子生物学领域就像是一个敏锐的侦探，能够精准地找出我们想要检测的特定DNA序列。
引物在这个过程中可是相当重要的角色哦。
先从生活现象来理解一下吧，想象我们要在一个很大的图书馆里找到特定的一本书，这个图书馆里有成千上万册不同的书（相当于各种DNA序列）。
引物就像是我们事先知道的关于这本书的一些特殊线索，比如书名中的某个独特单词或者作者名字的部分内容。
说到探针法引物设计的原理呢，这可有点像设计一个寻宝路线。
首先，我们得确定这个引物的长度。
如果太短了，就像你给的线索太短，可能会在一堆相似的东西里找到好多并非我们真正要找的目标，在DNA世界里就是可能会和很多相似的非目标序列结合。
如果太长了，又像线索过于复杂冗长，找寻起来不方便，而且合成成本也会变高。
老实说，我一开始也不明白为啥引物的退火温度也那么重要。
后来才知道这就好比是和目标“接头”的合适温度。
想象你和一个人约定在某个地方见面，如果温度太高（环境过热），你们可能就匆匆错过（引物和模板不能正确结合）；温度太低（环境过冷），可能又有很多其他不合适的人会凑上来（会和非特异序列结合）。
说到这里，你可能会问那引物的特异性是怎么来保证的呢？这就要说到我们要在设计的时候尽量让引物的序列和我们的目标DNA序列独特的区域相匹配。
这就好比你找一个很有特点的人，他有一些别人都没有的外貌或者行为特征。
比如说在一个人群中（众多DNA序列），有个人戴了一顶特别古怪形状的帽子（目标序列独有的特征，对应引物特异性序列），你就可以很容易通过这个特征（引物特异结合）把他找出来。
从学习过程来讲，我当时做实验的时候，就发现如果不注意引物的设计，整个检测就会乱七八糟的。
这就像是你走在一条规划错误的寻宝路线上，肯定只能空手而归。
在实际应用中，比如说检测某种疾病的特定基因，只要引物设计得好，就能迅速而且准确地找到这个基因的存在与否。
不过呢，我也知道这里面还有些复杂的东西我没完全搞懂，比如在复杂的基因组情况下，怎样才是引物设计的最佳方案，可能还需要更多的实验和研究去探索。
2017第九章 PCR引物及杂交探针设计
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miRNA引物设计 主讲教师：赵雨杰
由于miRNA序列较短； 由于miRNA存在成熟和颈环序列； 用实时定量PCR检测生物样品中某种miRNA含量 引物设计是比较特殊的； 首先，需完成miRNA逆转录；然后，进行扩增。
2、茎环状结构的RT引物 （ABI产品为主）
由可以自身呈环茎状的特异序列＋6到8个miRNA3’端 反向互补碱基组成。(一条miRNA序列特异对应一个 茎环状结构的RT引物）。另外一条引物3‘端含有6-8 个目标miRNA5'端碱基序列，再加一段随机序列，以 确保引物的Tm值在60℃左右。
美国signosis公司的一种新方法
1. 引物应用模板核酸序列保守区内设计并具有特异性。 2. 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩 增长至10kb的片段，产物不能形成二级结构。 3. 引物长度一般在15~30碱基之间。 4. G+C含量在40%~60%之间。
5. 碱基要随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。 6. 引物自身不能有连续4个碱基以上的互补。 7. 引物之间不能有连续4个碱基以上的互补。 8. 引物5′端可以修饰。 9. 引物3′端不可修饰。
pcr扩增时taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条dna链就有一个荧光分子形成实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步
PCR引物及杂交探针设计
3. 分子信标:是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的 发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补 配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。 PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定 DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。
引物和探针设计
引物和探针设计 –PCR 和定量PCR基本原理引物设计的重要因素针对特殊应用的其他提示引物的质量和纯度目录1247基本原理引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3'-羟基由相配的引物提供。
引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。
这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。
在延长过程中，RNA 引物降解并由DNA取代。
体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。
通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。
对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
在开始引物设计之前，必须弄清以下几点：PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型）PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）可能的问题（例如假基因、SNP)1引物设计的重要因素2有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。
它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。
最流行的软件为Primer 3，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。
典型的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。
非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。
应避免编码单一序列和重复序列的引物。
引物长度和专一性引物的GC 含量应介于40%和60%之间。
应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。
最常用的解链温度计算公式显示如下。
“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。
引物探针设计模板
引物探针设计模板
在生物医学研究中,引物探针是一种非常重要的技术手段,能够帮助科学家们准确地检测和分析基因序列。
引物探针的设计模板对于这种技术的发展具有非常重要的意义。
本文将探讨引物探针设计模板的重要性以及如何进行引物探针设计。
引物探针是一种由核酸序列编码的分子,能够在PCR扩增过程中结合到目标DNA序列上,并通过PCR扩增产生大量的产物。
这种技术可以用于检测和分析特定的DNA序列,如基因、RNA等。
引物探针的设计模板是指引物的特定序列,可以分为两种类型:一种是放射性同位素标记的引物,另一种是反向引物。
放射性同位素标记的引物通常用于跟踪其在细胞内的运动和代谢过程。
反向引物则可以与目标DNA序列形成互补,从而引物探针可以结合到目标序列上。
这些特定的引物设计模板可以增加引物探针的特异性,从而使其更加准确地结合到目标DNA序列上。
在引物探针设计过程中,需要注意一些细节。
首先,引物的长度应该适中,不能太短或太长。
其次,引物的序列应该与目标序列互补,并且应该具有良好的稳定性。
此外,引物的GC含量应该适中,过高或过低的GC含量都会影响引物探针的性能。
在引物探针的应用过程中,还需要考虑一些其他因素。
首先,需要对目标序列进行PCR扩增,从而得到引物探针的产物。
其次,需要对引物探针的性能进行评估,以确保其在特定的应用环境中具有较高的准确性和可靠性。
引物探针设计模板是引物探针研究中非常重要的一个组成部分。
不仅可以提高引物探针的准确性和稳定性,而且还可以增加引物探针的应用范围。
此外,为了确保引物探针的安全性,还需要避免使用放射性同位素标记的引物。
PCR引物和探针
引物设计原则：1．上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100—200片段进行PCR 扩增。
所以引物的选取也要非常的保守.2．上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58—62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
3．确保引物中GC含量在30—80%。
应避免引物中多个重复的碱基出现,尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现.引物的3'端最好不为G或/和C。
引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
4．避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体.5．跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。
探针设计的基本原则：1.保守:探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定.理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
2。
Taqman探针的长度最好在25—32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃,这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
3。
确保探针中GC含量在30-80％。
4.避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基5.探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
6。
Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物.两者的距离最好是探针的5'端离上游引物的3’有一个碱基。
7.避免探针与引物之间形成二级结构。
8。
对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
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引物探针设计简介已有2993 次阅读2009-1-1 20:48|个人分类:课堂集锦|系统分类:科研笔记1．寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。
所选的引物序列将决定PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。
好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。
引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。
当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。
计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。
一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。
计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。
通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。
因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。
需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5'端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。
2．基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
特异性是指发生错误引发的频率。
特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。
如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。
引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。
为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。
总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。
每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。
引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。
②引物的二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。
这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。
对于引物的3'末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5'端的要求可适当放宽。
引物自身形成的发卡结构，也以3'端或近3'端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。
应尽量避免3'末端有发卡结构的引物。
③引物GC 含量和Tm值PCR引物应该保持合理的GC含量。
含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内，这可为有效退火提供足够热度。
一对引物的GC含量和Tm值应该协调。
协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失。
这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。
若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。
在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键。
一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。
(条带浅的调整:1.明确所扩基因的特性:用来研究什么.预期的表达怎么样.文献中如何报道.说不定它就是一个低表达乃至表达降低的基因.2.模板量如何确定很重要:模板的上样量是否很低?有没有做内参如ACTB或者TUBLIN做下对照看看他们表达怎么样.是不是也是很低,若太低或扩不出来说明你的体系有问题.上样量也许可以调整一下.3.Tm的调整:设计引物的时候软件会给出一个TM;公司合成回来的单子上还会有个TM.一般这两个TM是不一样的.我们一般都先按公司给的温度来扩. 调整TM的最大目的不是看产物量如何,而是看产物特异性.如果TM值过低了,就可能有非特异条带出现,这个时候要适当提高TM值来除掉非特异阔增杂带.这个是调整TM值的主要目的我觉得.4.用内参调整好模板量后,先做一个温度梯度PCR:如50-56度先做7个样来最终确定你的最适宜TM值. 之后建议再按这个TM温度,做一个循环梯度PCR,做曲线后选择最适宜的循环数(有经验的话也可以根据各条带亮度肉眼大概确认最佳循环数).5.小细节方面的问题:比如可以新铺一板胶来检样而不用旧胶.防止由于EB的原因影响肉眼看到的亮度等.)另外，由于PCR仪的不同，注意其退火温度的设定：一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围，所以你的梯度范围尽可能设置宽一点，争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火温度。
具体从多少度到多少度，要看你这对引物的Tm值，如果两个引物Tm值不高，可以设置48-60的梯度；否则可以设置58-70度的梯度；如果两个引物的Tm中等，则可以设置53-65的梯度范围，具体情况灵活掌握。
传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的，需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的，尤其是第2、3孔与第1孔接近，第10、11孔与第12孔接近。
可以舍弃第2、2、10、11孔，只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品，孔间温度变化几乎呈真正的梯度状。
④引物的额外序列与退火温度若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。
一般说来，引物5'端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。
有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5'端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。
在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别序列的5'端有2至3个非特异的额外碱基，这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。
长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定PCR反应时的退火温度又是必须的。
对于低于20个碱基的引物，Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。
而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。
⑤引物的3'末端核苷酸组成引物3'末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3'末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。
如果3'末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。
引物3'末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。
应特别注意引物不能互补，尤其是在3'末端。
引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。
这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。
引物3'末端的稳定性由引物3'末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。
此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3'末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。
需要注意的是，引物3'末端应尽量避免T。
实验证明，以T结尾的引物即使与T, G或C错配仍可有效延伸。
⑥PCR产物的长度及在耙序列内的位置所有的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的选择。
一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响。
特定的应用情况下，PCR 产物长度部分取决于模板材料。
预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。
若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验方法，120～300bp的小DNA扩增产物可能是最好的。
产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。
这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。
其他PCR方法有不同的最佳产物长度。
例如，通过定量的RNA-PCR检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。
这些产物一般在250～750bp范围内。
⑦补充说明若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像3'末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。
若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列，产物的大小是根据具体应用预选的。
在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。
在选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时，应避开mRNA的5'和3'末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。
3．简并引物设计①设计简并引物时，一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度。
很显然，我们期望选择简并度最低的氨基酸，达到提高特异性的目的。
②充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。
③应努力避免3'末端的简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3'末端不要位于密码子的第三位。
④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。
4．测序引物设计当然，测序引物的设计一般都由测序公司来完成，如果需要自己设计的话；那么除了按照上面所提到的引物设计通用标准外，还需要注意两点：①测序引物的特异性的标准掌握应该更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性。
因为在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。
②测序引物的Tm值适当高一些。
现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA 聚合酶来催化，并采用PCR的热循环程序。
选用的测序引物的Tm值稍高一些，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。
5．探针的设计探针的设计，根据不同的用途各有其设计特点，这里只是就通用的原则进行讨论：①探针的长短一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。
太短则特异性下降。
②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同时一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。