高等植物DNA提取
小麦叶绿体DNA提取方法研究
St udy on Ex tr action M ethod of Wheat Chlor oplast DNA
H OU Dian - yun , M A Zhan - qiang , XU H ong , GU O Ai guang
1 1 2 2
( 1. Colleg e of A gr iculture, Henan U niversit y of Science and T echno log y, L uo yang 471003, China; 2. Co llege of Life Sciences, N or thw est A & F U niversit y, Y angling 712100, China)
摘要: 以成熟的中国春小麦叶片为材料, 采用改进的高盐- 低 pH 方法提取叶绿体 DNA, 经琼脂糖凝 胶电泳ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ PCR 扩增, 结果表明: 所提取的小麦叶绿体 DNA 纯度高( OD260/ 280 = 1 89, OD260/ 230 = 2 23) , 适于 P CR 反应、 基因扩增和酶切鉴定等分子操作, 为深入研究小麦叶绿体基因组奠定了基础。 关键词: 小麦 ; 叶绿体 DNA; 提取方法 ; 高盐- 低 pH 法 中图分类号 : S512. 1 文献标识码: A 文章编号 : 1004 - 3268( 2011) 10 - 0038 - 03
河南农业科学
[ 2]
第 40 卷
刘志文 , 韩旭 , 李莉 , 等 . 叶绿 体和线 粒体 DN A 在植 物 系统发育中的 应用进 展 [ J] . 河 南农业 科学 , 2008( 7) : 5 - 7.
以提取的小麦叶绿体 DNA 为模板 , 设 计特异 引物 , 扩增叶绿体编码的 p sbD 和 p sbC 基因的部分 序列 , PCR 结果 ( 图 3) 显示 , 利用改进后的方法所提 取的小麦叶绿体 DNA 作模板 , 可以扩增出清晰、 亮 度高的单一条带, 且片段大小与预期相符。说明提 取的叶绿体 DNA 质量浓度高 , 质量可以得到保证 , 完全能用于后续的分子操作。
植物细胞核DNA、叶绿体DNA和线粒体DNA的比较
植物细胞核DNA、叶绿体DNA和线粒体DNA的比较近年来，随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展，叶绿体DNA和线粒体DNA 的研究有了长足的进步。
植物一般都有三套遗传信息指导它的整个生命活动，即核染色体DNA(nDNA)、叶绿体DNA(cpDNA)和线粒体DNA(mtDNA)，它们在组织结构、遗传方式、表达调控等方面互有差别，又协同作用共同控制着植物的生长和发育。
1 组织结构植物细胞的大部分DNA是在核内，并与组蛋白稳定结合组成染色体，控制着大部分性状，起着主导作用。
高等植物nDNA含量大约在0.5～200pg之间，不同植物相差很大。
植物nDNA中很大比例的胞嘧啶由5-甲基胞嘧啶取代，有40%～90%是由重复的DNA组成。
植物的大多数nDNA的浮力密度在1.69～1.71g/cm3范围内，G+C的含量为30%～51%左右。
在高等植物中，cpDNA一般以共价、闭合、环形双链(cccDNA)的形式存在，是多拷贝的。
cpDNA比nDNA和mtDNA有较强的保守性，其大小在各种植物中相近，一般在120～190kb之间。
它与nDNA不同，分子较小，不含有5-甲基胞嘧啶，而且不与组蛋白结合成复合体，是裸露的，容易复性，存在为数极少的重复顺序，与原核生物的DNA类似。
cpDNA的浮力密度约为1.697g/cm3，G+C的含量为36%～40%。
cpDNA在结构上最突出的特点是有一对22kb的反向重复顺序(inverted repeat sequence)，将环形的cpDNA分割成大单拷贝区和小单拷贝区。
植物mtDNA较大，大小范围为200～2500kb，其复杂性远大于其它生物，在同一科植物中(如葫芦科)基因组大小差异可达7～8倍。
植物mtDNA通常呈环状，是双链的。
植物mtDNA的浮力密度约1.706g/cm3，这相当于大约47%的G+C。
大多数植物mtDNA具有多基因组结构，由一个主基因组和通过重组由它衍生的一系列大小不同的分子组成。
植物总DNA的提取
植物总DNA的提取一、 原理细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为核DNA或染色体DNA，也有人称之为基因组DNA(genomic DNA)，严格地讲，基因组DNA是指单倍体细胞核DNA。
细胞质中含有少量的DNA，称为核外DNA或核外基因。
主要分布在线粒体及叶绿体内，分别称为线粒体DNA(mtDNA)及叶绿体DNA(ctDNA)。
细胞内各种DNA总称为总DNA(total DNA)。
根据实验需要可分别提取不同的DNA。
植物核DNA的提取主要用于基因文库构建、PCR分析及Southern杂交，也可以提取总DNA进行Southern杂交。
核DNA分子呈极不对称的线状结构，一条染色体为一个DNA分子。
高等植物核DNA的分子量为1012左右，约含有109bp，就其长度与直径的比例而言，是一个极不对称的分子。
如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感，虽然现在已能够成功地测定出它的一级结构，但到目前为止，仍无法分离纯化出它的完整分子。
在分离纯化过程中，DNA分子的降解是很难避免的。
因而分离纯化所得到的只不过是植物核DNA分子的片段。
采用不同的分离方法，所得的片段大小有所不同。
用于Southern杂交的植物DNA样品在长度上应不小于50Kb。
线粒体DNA及叶绿体DNA的分子要小得多，分子量约为107，而且为环状结构，因此完整的线粒体DNA 及叶绿体DNA的分离并不十分困难，现已有许多报道。
核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA 的提取一般是先分离出细胞核及细胞器，然后再提取DNA。
总DNA的提取不必分离细胞核及细胞器，用温和的方法使细胞破碎后，核蛋白体自然释放出来。
（一） 方法概述植物DNA的制备与动物DNA制备原理大致相同，为获得高质量DNA应选取幼嫩组织或组织培养物为材料，由于植物材料中DNase水平低，蛋白质含量较少，其操作要点主要是克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖对DNA制备的影响。
关于植物总DNA的提取方法有关文献报道很多，但从提取原理上看主要有两种：CTAB 法和SDS法。
植物基因组dna的提取实验报告
植物基因组dna的提取实验报告植物基因组DNA的提取实验报告。
植物基因组DNA的提取是分子生物学实验中的一项重要步骤，对于研究植物的遗传特性和基因表达具有重要意义。
本实验旨在通过提取植物细胞中的DNA，为后续分子生物学实验提供基础支持。
在本次实验中，我们选择了小麦叶片作为实验材料，采用CTAB法提取植物基因组DNA，并对提取的DNA进行质量评估。
首先，我们收集了新鲜的小麦叶片样品，并将其置于液氮中迅速冷冻保存，以保持DNA的完整性。
接着，将叶片样品磨成细末状，并加入预冷的CTAB提取液中，进行细胞破裂和DNA的溶解。
随后，通过酚/氯仿提取法分离DNA与蛋白质，最终得到DNA的沉淀物。
在实验过程中，我们注意到了一些关键的操作细节。
首先，样品的冷冻保存和研磨过程需要迅速进行，以防止DNA的降解。
其次，在加入CTAB提取液后，充分混合样品并保持恒温，有助于细胞破裂和DNA的溶解。
最后，在进行DNA的沉淀时，需要注意避免将上清液一同转移，以保证提取得到的DNA纯度。
提取得到的DNA样品经过紫外分光光度计检测，结果显示其纯度较高，吸光比值（A260/A280）约为1.8，符合DNA的纯度要求。
随后，我们进行了琼脂糖凝胶电泳实验，观察到明显的DNA条带，并通过对照DNA分子量标准品的迁移情况，初步评估了提取得到的DNA片段大小。
通过本次实验，我们成功地提取到了小麦叶片样品中的基因组DNA，并对其质量进行了评估。
下一步，我们将利用提取得到的DNA样品，开展进一步的分子生物学实验，包括PCR扩增、基因克隆等，以深入研究小麦的遗传特性和基因表达。
本次实验为我们提供了可靠的DNA样品，为后续实验奠定了坚实的基础。
总之，植物基因组DNA的提取是分子生物学研究中的重要步骤，本次实验通过CTAB法成功提取了小麦叶片样品中的DNA，并对其进行了质量评估。
提取得到的DNA样品具有较高的纯度和完整性，为后续实验提供了可靠的基础支持。
植物DNA提取
⑷ 将上清液转入另一离心管中，向管中加入1/100体 积的 RNase A 溶液，置 37℃20-30min 。加入等体积 的氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下，12000rpm离心 10分钟。（可以重复2~3次）
⑸ 将上清转入另一离心管中，加入 1 倍体积的异丙 醇或2倍体积的95%乙醇，混匀，室温下放置30分钟， 观察沉淀生成。 ⑹ 8000rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀用70%乙 醇洗涤，吹干，溶于TE或去离子水中备用。
DNA浓度及纯度的测定 ：
用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm下 的读数。
样品浓度（μg/mL）= OD260×稀释倍数×50
对于DNA纯制品，其OD260/OD280≈ 1.8， OD260/OD230应大于2。OD260/OD280 >1.8 说 明有RNA污染；OD260/OD280<1.8说明有蛋白 污染。
植物总 DNA 的提取是在破碎细胞时加入去污 剂等试剂使核蛋白体解析，然后或是使蛋白 质变性沉淀，抽提DNA，或是使DNA沉淀进 入固相而与液相中的蛋白质、多糖等杂质分 离。 RNA 的去除主要采用 RNase 消化，最后 用乙醇或异丙醇沉淀DNA。
二、植物总DNA提取传统方法概述
CTAB法
（3）氯仿：异戊醇＝24：1
注：CTAB有毒。
SDS法原理：
利用高浓度的 SDS ，在较高温度（ 55~65℃ ） 条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性， 释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度 的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心除去沉 淀后，上清液中的 DNA 用酚 / 氯仿抽提，反复
抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
的溶液离心和其它操作时不能在低温下进行。 转移 DNA 溶液用的枪头要剪去尖部，以避免对 DNA的机械损伤。 所得DNA沉淀应为白色或灰白色，若呈褐色则有 多酚物质污染。 吹干沉淀时，不能吹得太干，太干会使DNA断裂， 也可不采用真空抽干，将离心管置于通风柜或超 净工作台中令乙醇自然蒸干。
一种简便的海藻DNA提取方法
种手段以使压缩极限提高到低分子量蛋白水平。
一种方法是通过提高浓缩胶中丙烯酰胺的浓度,以使蛋白质有效迁移率下降。
而甘氨酸由于受到影响不大,在实际意义上使其迁移率提高。
以及通过配制碱性浓缩胶提高甘氨酸的有效迁移率,从而达到压缩低分子量蛋白的目的。
另一种方法是本文所采用的,即通过改变过移离子,用T ricine替代甘氨酸而实现。
通过T ricine,小分子能够在较低的丙烯酰胺浓度和与分离胶相同的pH值的浓缩胶中,被有效地压缩和去压缩[5]。
在pH810～818之间,T ricine尽管分子量大于甘氨酸,仍能迁移得比甘氨酸快。
这是因为更多T ricine处于迁移中,形成阴离子。
结果使压缩极限达到低分子水平。
由于小分子蛋白(10～30kD a)会在染色和脱色过程中部分丢失,因而在加样时一般加2～5Λg以保证条带清晰。
T ricine-SD S-PA GE法对实验室设备要求不高,又能较为精确地测定A FP的分子量,这为更广泛地研究A FP提供了一种较好的方法。
参考文献[1]L ars C,R ubinsky B.FEBS L etters,1997,412(1):241～244[2]Karanova M V,M ezhevik ina LM,Petropavlo r NN.B i ofizika,1995,40(6):N ov～D ec:1341～1347[3]O gaw a M,Sugai T,M urata J,W atanuk i T.F ishphysi o logy and B i ochem istry,1997,17(1～6)D ec: 289～293[4]Chen LB,A rthur LD,Ch i-H ing CC.P roceedings ofthe N ati onal A cadem y of sciences of the U nited States of Am erica,1997,94(8):3811～3816[5]Schagger H,Jagow G.A nalytical B i ochem istry,1987,166:368～379TESTING OF MOL ECULAR W E IGHTOF ANTIFREEZEPROTE IN B Y AN I M PROVEDEL ECTROPHORESIS TECHN IQUEZou Y itao Zhu Pei p ing Zhao X iao li(Colleg e of L if e S cience,Z hej iang U n iversity,H ang z hou,310012)A n i m p roved tricine sodium dodecyl su lfate po lyacrylam ide gel electrop ho resis(T ricine -SD S-PA GE)techn ique w as u sed to test the m o lecu lar w eigh t of A FP s.A th ree-layer gel system w as u sed and the glycine w as in steaded by tricine in the buffer.Key W ords:an tifreeze p ro tein,tricine-SD S-PA GE一种简便的海藻DNA提取方法收稿日期:1999-06-013现工作单位:大连医科大学杨 君 王 茜3 刘美华 安利佳(大连理工大学生物工程系,大连,116012) 把包裹缠绕在大量粘性多糖中的海藻DNA提取出来是一个十分困难的。
实验 植物DNA提取及检测
4．将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 等体积异丙醇（预冷）。 颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸
5．8000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。 将 沉淀回溶于无菌水或 TE 缓冲液待测。
紫外仪上观察电泳带及其位置。 绘制核酸电泳示意图。
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CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜 与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来， 并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。
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DNA纯化（醇（24：1）抽提。
RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分 子的RNA。
仪器用具
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移液器－量程的选择
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四、操作步骤
1．取 2g 清洗凉干的植物幼嫩叶片于研钵中，加 入液氮，迅速研 磨。将2×CTAB抽提液与2ml巯基乙醇在提取前混合后于65℃水浴 中加热30分钟。
2．将 0.5mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，加入1ml CTAB提取液， 置于65℃水浴中保温 30min，其间颠倒混匀2－3次。破碎细胞
植物总DNA的提取 及琼脂糖凝胶电泳检测
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植物基因组 DNA的提取 琼脂糖凝胶电泳检测
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一 、实验目的
学习提取和纯化高等植物 总DNA的方法，理解其原理。
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二、实验原理
脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。
在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白 释放出来。 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在 于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制 活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体 DNA(ctDNA)。
7植物基因组DNA提取-CTAB法
1. 2% CTAB抽提缓冲液
CTAB 2g， NaCl 8.18g ， EDTA-Na2-2H2O 0.74g， 10ml 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)， 先用 70ml ddH2O溶解, 再定容至100ml，灭菌, 冷却后 加入0.2% β-巯基乙醇0.2ml。
终浓度： CTAB 2%, NaCl 1.4mol/L（生理平衡 作用）, EDTA20mmol/L(螯合离子作用)，β-巯基 乙醇 100 mmol/L或PVP（聚乙烯吡咯烷酮 ）（降 低氧化酶类的活性，防止酚氧化成醌，有效去除 多酚。）
复习题（判断）
将DNA提取液65度温育20分钟，可以灭活DNase。 （）
在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚， 说明其中蛋白质含量较高，可增加氯仿/异戊醇 抽提的次数或适当延长离心的时间。（ ）
（二）获取程序及原理
1. 破壁破膜，释放染色体
利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞；然后 加入CTAB缓冲液。
有效制备DNA时要考虑两个原则： 防止和抑制内源 DNase 对 DNA的降解； 尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
在液氮冷冻条件下研磨破碎，保证材料在此过程 中DNase无法活动。
高等植物总DNA提取
—— CTAB法AB法
实验类型：验证型
一、实验目的与要求
掌握CTAB法抽提植物DNA的基本原理。 学习并掌握CTAB法抽提植物DNA的技术和方法。
二、实验原理
（一）植物细胞中DNA在哪里？怎样获得？
➢ 植物细胞中的DNA主要存在于细胞核内，称为 核DNA、染色体DNA、核基因组DNA，细胞质中 也有少量DNA，主要分布在线粒体、叶绿体内，称 为核外DNA。 ➢ 细胞内的各种DNA称为总DNA。 ➢ 程序：破壁破膜→去蛋白质→沉淀DNA
植物DNA的提取
2011年11月11日综合性实验设计——植物DNA 的提取及纯度检验方案综合性实验设计——植物DNA的提取及纯度检验方案一、实验目的1. 学习从生物体中分离核酸的原理和方法；2. 掌握测定核酸的原理和方法；3. 掌握核酸的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；4. 培养学生创新实践能力和团队合作精神，并强化科研反哺教学效果。
二、实验原理1、关于植物DNA制备的基本原理植物细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为核DNA。
细胞质中含有少量的DNA，称之为细胞质DNA，主要分布于线粒体或叶绿体中，分别称为线粒体DNA和叶绿体DNA，细胞内各种DNA称为总DNA。
植物DNA的制备，必须首先注意植物细胞的特点：①植物组织中含有坚硬的纤维素，采用温和条件难以破碎细胞；②植物细胞一般具有大的液泡，破碎细胞时有机酸随之逸出将使pH显著下降；③通常植物细胞的DNA含量较低；④植物中含有大量多糖、脂质、色素和酚类等物质，这些杂质往往会与提取的DNA混在一起，给核酸的提取与纯化带来诸多不便。
鉴于以上特点，提取植物DNA时除了选择合理的提取方法外，还必须选择适合提取DNA的植物组织和发育阶段。
提取植物DNA的主要程序包括：①破碎细胞壁，释放细胞内含物；②破细胞膜及核膜是DNA释放到提取液中；③除去DNA提取液中含有的RNA、蛋白质、多糖、丹宁及色素等杂质。
2、关于植物DNA提取的基本方法——CTAB法CTAB法已成为从植物中提取总DNA的简单而有效的方法，主要用于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物DNA提取。
CTAB（十六烷基三乙基溴化铵），分子式C19H42NBr，是一种表面活性剂，也是一种阳离子去污剂。
CTAB可以溶解细胞的细胞膜，使核酸释放出来。
首先将植物叶片用液氮研磨，细使胞壁破裂后，再加入CTAB，使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿等抽提纯化。
CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）与核酸形成的复合物在高盐溶液（0.7mol/L NaCl）中是可溶的，当溶液盐浓度降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，它将从溶液中沉淀。
实验七_植物DNA的提取与纯度鉴定
实验试剂及其配置
• 6 高盐 溶液（pH 8.0） （要求配 高盐TE溶液（ 溶液 ） 要求配50mL） ）
试剂 1 M pH 8.0 Tris·Cl 0.5 M pH 8.0 EDTA NaCl
需要量/L 需要量 10 mL 0.2 mL 58.5g
终浓度 10 mmol/L 0.1 mmol/L 1 mol/L
需要量/L 需要量 20 g 100 mL 40 mL 82 g
终浓度 2％（ ） ％（w/v） ％（ 100 mmol/L 20 mmol/L 1.4 mol/L
实验试剂及其配置
2 1 M pH 8.0 Tris·Cl（已有不用配置） （已有不用配置）
121 g Tris碱溶于 碱溶于800 mL dd H2O，浓HCl调pH至8.0，补dd H2O定容 碱溶于 ， 调 至 ， 定容 至1000 mL。 。 注意： 缓冲液的pH值随温度变化较大 注意：Tris缓冲液的 值随温度变化较大，每1℃可引起大约 缓冲液的 值随温度变化较大， ℃可引起大约0.028 pH单位的变化。 单位的变化。 单位的变化
实验七 植物DNA的提取与纯度鉴定 的提取与纯度鉴定 植物
谢 艳
• • • • • • •
实验目的 实验原理 实验材料 实验试剂 实验仪器 实验步骤 注意事项
实验目的
• 了解植物总 了解植物总DNA提取的原理 提取的原理 • 学习和掌握提取、纯化高等植物总DNA的 学习和掌握提取、纯化高等植物总 掌握提取 的 方法和步骤
背景知识 1
不同生物须选择不同DNA提取方法 提取方法 不同生物须选择不同
不同生物（ 植物、 动物、 微生物） 不同生物 （ 植物 、 动物 、 微生物 ） 的基因组 DNA的提取难易度不同： 的提取难易度不同： 的提取难易度不同 对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较 对于低等生物，如从病毒中提取 比较 容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保 分子量较小， 容易，多数病毒 分子量较小 持其结构完整性。 持其结构完整性。 从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一 难度大一 从细菌及高等动植物中提取 细菌DNA 分子量较大，一般达 ×10 道尔 分子量较大，一般达2× 些。细菌 因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核 顿。因此易被机械张力剪断。细菌 ， DNA 外，还有质粒 还有质粒DNA 等。
综合性实验植物DNA的提取及电泳
学号：
124120434
姓
名：
刘云谣
学院： 生命科学学院
专业、班级： 12 生物技术
实验课程名称：植物 DNA 提取质量检测及特定基因片段操作 教 师： 2014 至 郝大海 2015 学年 上 学期
ห้องสมุดไป่ตู้
开 课 学 期：
云南师范大学教务处编印
实验序号 实验时间
一
实验名称
植物 DNA 提取质量检测及特定基因片段操作 实验室 睿智 3--428
的氯苯(1/2 体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用 PEG8000 代替乙醇沉淀 DNA：在 500 μ L DNA 液中加入 200μ l 20% PEG8000 (含 1.2 M NaCl)，冰浴 20min.核酸分离，纯化； 9、 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂： β -巯基乙醇、抗坏血 酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如 PVP( 聚乙烯吡咯 酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与 DNA 的结合； 10、盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料 吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化 DNA 的目的另一种方式加入 1/10 体积的 NaAc(pH5.2,3M) ， 用预冷的乙醇或异丙醇沉淀 RNA 吸附或沉淀后应用 70% 的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用 TE 缓冲液溶解 TE 中的 EDTA 能螯合 Mg2+或 Mn2+离子，抑制 DNasepH 值为 8.0，可防止 DNA 发生酸解。 七、实验结果及分析 （一） 、实验结果 纯的 DNA 样品 OD260/OD280 应为 1.8，OD260m／OD230 应大于 2.0。 1、 OD260/OD280 大于 1.9 时，表明有 RNA 污染。 2、小于 1.6 时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3、OD260/OD230 小于 2.0 时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、 氨基酸、酚等。 注： 可能出现既含蛋白质又含 RNA 的 DNA 溶液比值为 1.8 的情况。 只有当 DNA 的 OD260/OD280 接近于 1.8 时才值得去电泳。 本次实验的结果为： OD260：2.6 OD280：1.2 OD260/OD280=2.6/1.2=2.1 电泳结果如下： 条带最多的是 DNAmark 样本，它的范围在 200-4000 之间，其他的为实验中提 取的 DNA 经过 PCR 反应后得到的 DNA 样品， 经过电泳之后就可以通过比较条带 的远近和 mark 条带上的位置，就可以知道经过 PCR 后得到的 DNA 了。
植物(水稻)基因组DNA的提取
• DNA指纹技术及其在作物品种鉴别中的应用 • 水稻分子遗传图谱的构建与基因定位
植物基因组DNA的分离 ——CTAB微量法 • 学习从高等植物组织中提取基因组DNA的 方法
实验原理
• 破碎细胞壁释放释放DNA：1. 液氮冷冻，2. 用含渗透剂的 缓冲液直接研磨 • 保护DNA免受内源核酸酶的降解：1. SDS(十二烷基磺酸 钠）或CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等去污剂；2. EDTA 螯合大多数核酸酶所需的辅助因子—镁离子 • 用氯仿:异戊醇去除蛋白质，RNA酶去除RNA
实验材料
• 6个水稻品种（系） • P1（E3003） • P2（E1001） • P3（E3005） • P4（E1049） • 两优287 • 红莲优6号
实验方法
• 取2ml离心管编号，取幼嫩水稻叶片（3-5cm）剪碎，放 入离心管中，加2CTAB溶液300l 和1粒钢珠，在捣碎 仪上研磨至浆状 • 取出钢珠后再加入2CTAB溶液200l，65℃温育30分钟 • 冷却至室温后，加入500l 的氯仿/异戊醇（体积比为24： 1），反复颠倒混匀，12,000rpm，离心10分钟； • 吸取上清300l至另一1.5ml离心管中，加入等体积的冰 冷异丙醇轻轻颠倒混匀，-20 ℃沉淀20分钟； • 12,000rpm，10分钟, 小心倒去上清 • 用70％的酒精1ml泡洗，12,000rpm，5分钟； • 倒掉酒精，用移液器尽量把残余酒精吸出。风干后每个样 品加去离子水50l ，4℃保存备用
景天科植物基因组DNA的高效提取方法
基金项目 作者简介
教育部春晖计划项目 （ V8&&(8’%&&6） 。 赵为 （%16’ 7 ） ， 男， 四川成都人， 本科生， 专业： 药用植物生物 技术。 ! 通讯作者。
收稿日期
8&&$P&0P%0
<= 卷 33 期
赵 为等
景天科植物基因组 2’, 的高效提取方法
:65:
!"#"$%#& 中的 ’()* )+,-. 服务程序。 ! ! /" 结果与分析 提取 #$% 的纯度 通过 01 琼脂糖凝胶电泳分析所获
无 降 解 的 2’, 片 段。用 得的全部样品 2’, 均 为 单 一 条 带， 岛津核酸蛋白测定仪测定提取样品 2’, 的 !345 " !365 值， 结果 说明该方 见表 0。表 0 表明， 所 得 的 !345 " !365 值 均 高 于 0 / 6， 法提取的 2’, 具有较高 B(C 产 物 进 行 回 收、 克隆
序列见图 3， 登录 ’()*， 和测序， 得到了长度为 ;>0$@ 的序列， 获得 !"#$%#& 号为 2D:56;=<。 经 ’()* 比 对 分 析， 证实该序 列为目标 ’%?; 基 因 的 区 域。已 报 道 的 05 余 个 高 等 植 物 的 ’%?; 基因相应序列 长 度 多 为 0 0<: $@ 以 上。 从 图 0 可 以 看 出， 红景天 #%?; 内含子 3 与 同 科 植 物 也 存 在 着 差 异， 说明红 景天 #%?; 内含子 3 存在特殊性。 浓度 !! 7 8! 9 0 / :4 ; / ;4 : / =4 ; / :0 > / 54 < / 0> 4 / 0; 4 / 3=
DNA提取注意事项1
核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用 于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸 释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠
三、操作步骤
1、1.5ml菌液（每组两管）4 ℃ 12000rpm离心30sec， 弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。 2、每管加入400µ l裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅 助裂解，37 ℃水浴30min。 3、每管加入132µ l的5M NaCl溶液，颠倒试管，充分混 匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪 去1ml枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的 eppendorf管中。 4、加入等体积的饱和苯酚/氯仿，充分混匀后， 12000rpm离心3min，离心后的水层如混浊则说明仍含 有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤 直到水层透明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止 （约2次）。
核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
核酸制备的步骤：
I.材料准备
破碎细胞 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积的氯仿，混匀 后13000rpm离心3min，除去苯酚。
6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积 的无水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30min，然后13000rpm离心 15min，可见白色丝状沉淀物。 7、小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400µ l 70％乙醇洗涤2 次，室温干燥后，用50µ lTE （含20µ g/ml的Rnase）溶解DNA， －20℃冰箱放置备用。
流式细胞仪检测高等植物细胞核DNA含量的方法
流式细胞仪检测高等植物细胞核DNA含量的方法汪艳;肖媛;刘伟;李婷婷;胡锐;乔志仙【摘要】相对于动物和微生物而言,流式细胞术在植物科学上的应用会因植物组织与细胞(如细胞壁、中央液泡、特殊细胞器等)的特殊结构以及次生代谢产物等特殊成分,造成样品在前期处理、染色及测试等方面的困难,甚至导致检测失败或结果不准确.笔者在长期运用流式细胞仪测试工作中,积累了大量的植物样本检测经验,并参考国内外相关文献,总结出从植物取材、样品制备到植物细胞核DNA流式检测的方法和技巧,可为植物科学研究者及从事流式细胞检测的技术人员提供实验参考.【期刊名称】《植物科学学报》【年(卷),期】2015(033)001【总页数】6页(P126-131)【关键词】流式细胞术;高等植物;细胞核DNA含量;DNA解离液【作者】汪艳;肖媛;刘伟;李婷婷;胡锐;乔志仙【作者单位】中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070;中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070;中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070;中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070;中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070;中国科学院水生生物研究所分析测试中心,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】Q343;O65流式细胞仪(flow cytometer)的诞生标志着在单细胞水平上定性、定量分析及分选检测技能的快速发展，并在血液学、免疫学、肿瘤学、分子生物学和细胞生物学等学科的基础研究及临床检验中得到了广泛应用。
但在植物学研究领域中，由于植物组织与细胞结构复杂，使流式细胞仪在植物科学中的应用滞后于其它学科。
近30年来，随着流式细胞仪多功能开发、多参数流式分析与分选技术建立、流式样品制备技术的不断更新，流式细胞术在植物科学领域如植物遗传育种、植物染色体分析与文库构建、逆境植物学、植物分类学、植物病理学等各个学科中显示出广阔的应用前景[1]。
SDS法提取DNA
DNA抽提缓冲液（lysis buffer）：50mM Tris-Hcl（Ph7.2）50mM EDTA3% SDS1% β-巯基乙醇（用时加）饱和酚：氯仿（V：V,1：1）异丙醇3M醋酸钠NaOAc（Ph8.0）1．称取0.075－0.085g干菌丝置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至细粉末状，迅速转至1.5ml的离心管中并加入750μl DNA提取缓冲液（65℃预热），在振荡器上振荡几秒钟充分混匀，然后放到65℃水浴锅中水浴60min，每10min摇动一次。
2．加入750μl饱和酚：氯仿（V：V,1：1）轻轻颠倒离心管数次充分混匀，室温下12000rpm离心15min，取上清液置于新的离心管中。
3．加入1/30体积的3M醋酸钠NaOAc（PH8.0）和0.54体积的异丙醇，轻轻混匀后置于4℃冰箱中30min，室温下12000rpm离心2min，小心倒掉上清液，然后用冷的70％乙醇洗涤沉淀两次（轻轻颠倒离心管若干次），倒掉乙醇。
4．将装有DNA沉淀的离心管置于真空干燥器中，干燥约30min（时间以DNA变干为准）。
5．加入500μl的ddH2O溶解DNA沉淀，同时加入1－2μl RNase（终浓度为20μg/ml）,37水浴60min。
6．加入等体积的饱和酚：氯仿（V：V,1：1），充分混匀，然后室温下12000rpm离心15min，取上清液置于新的离心管中。
7．重复步骤3。
8．重复步骤4。
9．加入100ml TE溶解DNA，待完全溶解后置于－20℃冰箱中备用。
关于基因组酶切：每次切100 ul 体系，79 ul DNA，（浓度200微克以上），单酶切的话酶7微升，buffer 14ul，酶切5小时或者过夜都可以。
Q1：Southern杂交的基本原理是什么？应用范围？原理：其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
基因组DNA首先用一种或几种限制性内切核酸酶消化，消化后的片段通过标准琼脂糖电泳按照大小进行分离。
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三、 实验材料，用具及试剂
（1）实验材料：新鲜的菠菜叶片 （2）实验用具：
研钵 移液枪 高速离心机
（3）实验试剂：
细胞提取液，Tris饱和酚，异丙醇，石英砂 ❖ 细胞提取液成分：
SDS（十二烷基磺酸钠） EDTA （乙二胺四乙酸） 氯化钠溶液 50mmolL-1Tris-Hcl(PH=8.0)
❖ Tris饱和酚成分：
实验七 高等植物DNA的提取
一、实验目的
1、了解DNA的性质。 2、掌握从植物组织中提取核DNA的一般原理和操作 过程，为以后基因工程的研究奠定基础。
二、实验原理
植物细胞的DNA主要存在于细胞核中，称为核DNA或 染色体DNA，细胞质中也有少量的DNA，主要分布在 线粒体核叶绿体内，称为核外DNA。细胞内的各种 DNA称为总DNA。
采用加石英砂与植物材料共同研磨的方法来破坏细胞壁；
用SDS（十二烷基磺酸钠）破坏细胞膜和核膜，并且使 蛋白质变性，使蛋白质与核酸分离，通过离心就可以沉淀 蛋白质；
为防止DNA被DNA酶降解，用EDTA（乙二胺四乙酸） 可以螯合金属离子，抑制DNA酶的活性，使释放出来的 DNA避免被降解；
得到的DNA溶液用Tris饱和酚反复抽提，进一步除去蛋 白质和提纯DNA，最后用异丙醇沉淀DNA。
高等植物的核DNA相对分子质量较大，与蛋白质结 合成染色体，在纯水或1摩尔每升的氯化钠溶液中溶解度 较大，而不溶于有机溶剂。DNA为白色类似石棉样的纤 维状物。
❖ 目前植物DNA的提取方法主要有: SDS法（十二烷基磺酸钠） CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵）
植物细胞有细胞壁，在提取核DNA时首先要破坏细胞壁 和核膜。
❖ 6、吸取上清液转入另一个离心管中，加入饱和酚，定容至1 毫升，混匀，于12000转/分钟离心5分钟。
❖7、吸取上清液，加入异丙醇定容至1毫升，混匀(切勿在混 匀器混匀，颠倒混匀），12000转/分钟离心5分钟。
❖8、弃上清液，用乙醇冲洗DNA。
注意事项
（1）叶片磨得越细越好 （2）注意移液器的规范使用 （3）加药品顺序不要颠倒 （4）苯酚、异丙醇有毒，请小心操作！
Tris-Hcl(PH=8.0) （Tris：防止酚类 氧化成醌，醌破坏核酸结构） 苯酚（蛋白质变性剂，使细胞中蛋白质 变性析出）
四、实验方法
❖ 1、取鲜嫩的菠菜（去叶脉，留叶肉）50克，洗净后剪碎， 放入研钵中于冰箱内冷冻10小时。（目的使材料易于研磨）
❖ 2、加入适量的石英砂研磨成匀浆状。（迅速研磨:目的是 破坏细胞壁）
细节决定成败！！！
方法简析：
❖ 冷冻和研磨，使细胞核破裂 ❖ 加入提取缓冲液，溶解DNA ❖ 饱和酚抽提，去除蛋白 ❖ 加入异丙醇，沉淀DNA ❖ 酒精冲洗，去除剩余杂质
五、作业
记录实验结果并进行分析。
移液枪的使用： 1.设定体积
2.装枪头
3.吸液
3.1 垂直吸液，枪头尖端需进入液面2-4mm以下。 3.2 吸液时打到第一档吸液。
❖ 3、加入2倍体积的细胞提取液，轻轻混匀，装入小离心 管中1毫升。于65℃水浴下放置40分钟。
❖ 4、于8000转/分钟的速度离心5分钟。上清液中含有DNA， 沉淀中有蛋白质，大的碎片等。
❖ 5、取上清液转入另一个离心管中，加入饱和酚定容至1 毫升。在混匀器上混匀，12000转/分钟离心5分钟。 离心管分为3层。
5min ）
取上清液转另一离心管，加异丙醇定容 至1ml，混匀，离心（12000转/分钟，
5min ）
弃上清液，用乙醇冲洗
切勿在混匀器 混匀！！！
3.吸液
4.放液
4.1 4.2
4.3 4.4 4.5
5.使用完毕
注意事项
研磨
分装至离心管1ml
离心（8000转/ 分钟 5min）
取上清液转另一离心管，加饱和酚定容 至1ml，混匀，离心（ 12000转/分钟，
5min ）
取上清液转另一离心管，加饱和酚；定 容至1ml，混匀，离心（12000转/分钟，