小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养
树突状细胞培养方法
树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。
为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。
本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。
1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。
首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。
然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。
最后，将细胞进行培养。
2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。
目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。
添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。
3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。
常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。
可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。
4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。
因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。
一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。
5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。
为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。
可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。
6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。
可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。
7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。
为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。
总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。
小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养及鉴定
源 的未 成 熟 和 成 熟 Ｄ Ｃ．
［ 关键词］树突状细胞 ；小 鼠；近交系 ；骨髓 细胞 ；吞 噬作用
［ 中图分类号］Ｒ ３ ２ ２ ． ２［ 文献标识码］Ａ ［ 文章编号］２ ０ ９ ５ －６ １ ０ Ｘ （ ２ ０ １ ３ ）１ １ －０ ０ ０ ５ －０ ４
Ｃｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ Ｉ ｄｅ ｎｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｄｅ ｎｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｍｏ ｕｓ ｅ Ｂｏ ｎｅ Ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｉ ｎ Ｖｉ ｔ ｒ ｏ
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（ １ ）Ｂ ｉ ｏ ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ，Ｔ ｈ ｅ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｃ ｌｍ ａ ｅ ｔ ｔ ｅ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ｌ ａ ｏ ｆＫｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｋｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ １ １ ； ２）Ｄ ｅ ｐ ｔ ． ｆＡ ｏ ｎ ｅ ｓ ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，Ｔ ｈｅ Ｉ ｓ ｔ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ｔ ａ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｆＫ ｏ ｕ ｎ ｍ ｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｋｔ ｍｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ ３ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） ［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｅ ｎ ｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ＤＣ ） ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｂ ｏ ｎ ｅ ｍ ａ ｒ ｒ ｏ ｗ
小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。
小鼠树突状细胞(DC)培养
8．加入树突细胞培养液重悬细胞，调整细胞数至1×106/ml(Scepter自动细胞计数器,美国Millipore公司)，按2ml/孔接种至12孔细胞培养板（4.5cm2/孔），置37℃、5%CO2孵箱培养。
9．于培养第3，5天每孔分别更换2ml树突细胞培养液。第6天收集悬浮细胞，流式抗体染色后，流式细胞仪检测树突状细胞的表型。
1.4.4 红细胞裂解液pH7.2（1L）：
NH4CL 8.56g
Tris碱 2.059g
MilliQ水定容至1L 调节pH至7.2
1．处死BALB/c小鼠并浸泡于75%医用酒精10min，随后取小鼠股骨及胫骨并用眼科剪剔除附着在骨骼上的肌肉。
2．剪掉两侧股骨头，将吸满PBS缓冲液的注射器针头插入骨腔中，并缓慢推动注射器冲洗骨髓腔，直至骨变白。
3．将收集到的骨髓细胞悬液500×g离心5mim，弃上清。
4．向骨髓细胞沉淀中加入红细胞裂解液并反复吹打混匀，置37℃孵箱孵，吸弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，200钼铜网过滤除去骨髓细胞悬液中组织碎块。
6．用1ml PBS缓冲液重悬细胞，加入功能纯化抗体抗-小鼠CD4/CD8a/ MHC-Ⅱ/CD45R及兔血清补体，37℃孵育1h，以去除T淋巴细胞、B淋巴细胞及MHC-Ⅱ+细胞。(功能纯化抗体抗-小鼠 CD4(L3T4)、CD8a(Ly-2)、CD45R(B220)、MHC-Ⅱ（I-A/I-E）抗体购自eBioscience公司)
bmdc培养方法
bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。
以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。
将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。
将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。
3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。
此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。
在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。
此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。
4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。
将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。
将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。
5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。
用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。
用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。
总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）培养小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF 至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
小鼠骨髓及脾脏来源的树突状细胞培养及鉴定
Ｃ Ｆ 和 白细 胞 介 素 （Ｌ ４ 协 同 诱 导 下 培 养 ， Ｓ） Ｉ－ ） 光镜 下 观 察 Ｄ 的 形 态 ， 式 细 胞 仪 检 测 Ｃ ８ 、 Ｄ ６表 达 水 平 。结 果 Ｃ 流 Ｄ ０Ｃ ８ 骨髓 细 胞 体 外 诱 导 培 养 ３天 后 ， 镜 下 显 示 细 胞 表 面 不 规 则 ， 树 突 状 突 起 ， 光 呈 可见 典 型 的 树 突 状 细 胞 形 态 ， 表 达 共 刺 低 激分 子 （ Ｄ ０Ｃ ８ ） Ｃ ８ ， Ｄ ６ 。结 论 与 脾 脏 细 胞 相 比 ， 髓 细 胞 中不 仅 富 含 大 量 的 ＤＣ的 前 体 细 胞 而 且 诱 导 成 ＤＣ时 间 短 。 骨 关 键 词 ： 突状 细 胞 ； 髓 ； 脏 ； 树 骨 脾
ｄ ｔ ｃ ｅ ｗｉｈ ｆｏ ｅｅ ｔｄ ｔ ｌ ｗ ｃ ｔ ｙ ｏｍｅ ｒ ｔ ｙ．Ｒｅ ｕ ｔ ｂｏ ｍ ａ ｒ ｓ ｌｓ ｎｅ ｒｏｗ ｃ ｌｓ ｐｐ ａ ｅ ｉｒ ｇｕｌｒ ａ ｏｒ ｅ ｎ ｉｉ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ａ ｔ ｒ ｅ ｌ ａ ｅ ｒ ｄ ｒ ｅ ａ ｎｄ ｆ ｍ ｄ ｄｅ ｄｒｔｃ ｏｃ ｓ ｅ ｆｅ ３
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小鼠骨髓源树突状细胞体外诱导培养及初步鉴定
小鼠骨髓源树突状细胞体外诱导培养及初步鉴定刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【摘要】To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells ( DC) from mouse bone marrow in vitro and observe their morphology, recombinant mouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor( GM-CSF) and interleukin-4( IL4) induction were used to induce mouse bone marrow cells to form dendritic cells in vitro. After 9 days , the percentage of the cultured DCs was more than 80％ with typical morphology of DCs under light microscope. The mature cells had clear marker on their surface. This meant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.%用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,进行形态学变化观察,分析细胞表面分子,刺激T细胞增殖,探讨小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)体外诱导培养并进行初步鉴定.体外培养9d后BMDC可达80%以上m,光镜下可见典型的树突状细胞形态.清楚表达成熟期主要表面标志物,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖.获得了较高纯度的BMDC,避免了使用传统磁珠分离方法所带来的成本高,操作复杂,产出率低的弊端,为研究BMDC功能以及运用开展下游实验提供材料.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)002【总页数】4页(P25-27,31)【关键词】树突状细胞;体外诱导培养;初步鉴定【作者】刘铮;代继宏;符州;冯琳琳【作者单位】儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,重庆,400014;儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国防科技合作基地【正文语种】中文【中图分类】Q813.5Abstract:To establish a method of cultivation and purification of dendritic cells(DC)from mouse bone marrow in vitro and observe theirmorphology,recombinantmouse granulocyte and macrophage colony stimulus factor(G M-CSF)and interleukin-4(I L4)induction were used to inducemouse bonemarrow cells to for m dendritic cells in vitro.After9 days,the percentage of the culturedDCswasmore than 80%with typicalmorphology ofDCs under lightmicroscope.The mature cells had clearmarker on their surface.Thismeant that these used substances could stimulate allogenic mixed lymphocyte proliferation.Keywords:dendritic cells;culture in vitro;initial appraisal树突状细胞(dendritic cell,DC)是一种专职性抗原提呈细胞,在肿瘤、抗感染免疫、移植排斥等方面起着关键的引导和调节作用,并能显著激活初始型 T淋巴细胞并诱导其增殖,处于免疫应答过程的中心环节。
树突状细胞培养方法
2.2.4 小鼠骨髓源性树突状细胞的培养1）颈椎脱位法处死健康雄性4到6周龄的BABLIc小鼠，75％乙醇浸泡10分钟。
2）无菌条件下取双侧股骨、胫骨，剥离附着的肌肉软组织后浸泡在75%乙醇中2分钟。
RPMI1640冲洗，剪开骨的两端，1 ml 注射器抽取RPMI1640，分别从骨两端插入骨髓腔反复冲洗直至变白，RPMI1640清洗骨髓细胞后重悬。
3）在离心管中预先加入小鼠脾淋巴细胞分离液，将相同体积的骨髓细胞悬液小心加入淋巴细胞分离液上层，不打乱两层液体界面。
4）4℃，1500rpm离心7min后吸取中间白膜层，PBS清洗所获的单个核细胞。
5）BMDC完全培养液重悬后，以2×106每孔的浓度分种至6孔培养板中，每孔4ml完全培养基。
6）将细胞培养板放入37℃，含5%CO2的培养箱中培养6小时。
7）弯头滴管轻轻吹打，连同培养液一起弃去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞；加入新鲜完全培养基和500 U/ml的rmGM-CSF及rmIL-4继续培养。
8）隔日半量换液，补加相同浓度细胞因子，尽量保留悬浮细胞。
9）培养至第6天，轻轻吹打收集所有悬浮细胞，即为未成熟的BMDC。
10）诱导培养过程中每天观察细胞集落及形态变化并拍照。
11）流式检测所诱导的未成熟BMDC表面分子CD11c的表达以评估BMDC 的纯度。
收集培养至第6天的BMDC，PBS洗2次，1×106个细胞用冷的Buffer （PH7.2的PBS+150mMNacl+ 0.09%NaN3+0.2%BSA）100µL悬浮。
加入3µL FITC-CD11c，对照管加入PBS，4℃冰箱避光反应45min。
Buffer洗2次，弃上清，500µL 1%多聚甲醛固定。
送第四军医大学流式细胞室上机检测。
小鼠骨髓源树突状细胞制备
试验研究 | Experimental research0 引言1973年Steinman和Cohn首次分离出一类同巨噬细胞、粒细胞和淋巴细胞形态与功能不同的细胞，命名为树突状细胞(DCs)。
其主要来源是骨髓CD34+多能造血干细胞，是体内唯一能直接激活初始T细胞的抗原提呈细胞(APC)[1]，是机体免疫的始动者及固有免疫和适应性免疫的桥梁。
髓系树突状细胞通过血液与淋巴液从骨髓移动并分布到皮肤，后趋向淋巴组织启动免疫反应。
淋巴系树突状细胞是T细胞集聚区的固定哨兵，分布主要局限在胸腺髓质及淋巴结T细胞区，具有免疫调节和免疫耐受作用。
当抗原性物质侵入机体时，宿主体内的免疫系统会启动一系列免疫防卫机制识别并清除病原体，特异性免疫应答启动前，需要APC摄取、加工、处理抗原并将抗原信息提呈给免疫应答的淋巴细胞。
主要组织相容性复合物（MHC）是一段基因密度高的染色体区段，是一种复杂且多态性高的遗传系统。
主要存在2个途径即溶酶体途径（MHC-Ⅱ类途径）和胞质溶胶途径（MHC-Ⅰ类途径）。
另外，还存在MHC非依赖性的抗原提呈途径，称为CD1分子提呈途径。
DCs的成熟经历前体期、幼稚期及成熟期3个时期。
开始由骨髓进入血液循环，随后到达靶组织或器官，停留在潜在抗原物质出现位置，主要有MHC-I型和MHC-II型2种抗原提呈途径。
成熟DCs生物学特征有：能有效活化初始T细胞，有效摄取和处理抗原，CD80和CD11c可作为成熟DCs的标志，成熟DCs能启动免疫应答、释放干扰素等细胞因子等。
DCs 能摄取抗原并将其加工处理成能够被T细胞识别的多肽段。
T细胞受体特异性识别抗原肽-MHC分子复合物，刺激T细胞活化，进而启动胞内信号转导，诱导细胞增殖和分化有关基因的表达。
成熟T细胞主要包括CD4+T细胞（辅助T细胞）和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）2个亚群。
免疫应答中，辅助T细胞最先激活，并释放细胞因子，激活巨噬细胞，诱导CTL成熟，促进细胞免疫应答，辅助B细胞产生抗体等。
小鼠骨髓源性树突细胞的体外优化培养及其生物学特性鉴定
１２）、白细胞介 素 一１０（ＩＬ一１０）］分泌及诱导 Ｔ淋 巴细胞 的增殖能 力等进 行鉴定 。结果 镜下观 察细胞 有 明显 的
不规则枝 状突起 ，有典 型 ＤＣｓ形态特征 。流式结 果显示 细胞 纯度 为 ７７．４％左右 ；经 ＬＰＳ刺激 后树 突细胞 ＣＤ８６、
ＭＨＣ ｌＩ的比例 均明显增加 （Ｐ＜０．００１）；ＥＬＩＳＡ结 果显示与 对照组 相 比，ＬＰＳ刺激组 ＩＬ一１２、ＩＬ一１０的含量 明显增
续培 养 ，４８ ｈ收集上清 细胞 离心后种于 ６孔板 中以上培养基继续培养 ，９６ ｈ后换液处理 ，第 ８天时添加 ＬＰＳ刺 激作
为 ＬＰＳ刺激组 ，未添加 ＬＰＳ作为对照组 ，结合流式细胞仪 （ＦＣＭ）、酶联免疫 吸附技术 （ＥＬＩＳＡ）等从 细胞形 态 、表 面
分子 ［Ｂ７—２分子 （ＣＤ８６）］及主要组织相容性 复合 体 Ⅱ（ＭＨＣⅡ）的特异 性表达 、相关 因子［白细胞介 素 一１２（ＩＬ一
【关键词】 树突细胞；体外优化 ；生物学特性
【中图分类号 】Ｒ２８５．５
【文献标 识码 】Ａ
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍ ａｒｒｏｗ ——ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅｉｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍ ｉｃｅ
· ４８２ ‘
世界中西 医结合杂志 ２０１８年第 １３卷第 ４期 ｗ。ｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ。ｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１８，Ｖｏ１．１３，Ｎｏ．４
实 验 研 究 ·
小 鼠骨髓 源性 树 突 细胞 的体 外 优 化 培 养 及 其 生 物 学 特 性 鉴 定
小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存
中国组织工程研究与临床康复第14卷第45期 2010–11–05出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research November 5, 2010 Vol.14, No.45 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH8455 Department ofUrinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,ChinaZhu Guo-hui★, Studying for master’s degree, Departmentof Urinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,Chinadrzhugh@hotmail.com Correspondence to:Liu Xiu-heng, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department ofUrinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,Chinadrliuxh@Supported by: the National Natural Science Foundationof China, No. 30672107*Received: 2010-05-01 Accepted: 2010-06-30小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存*★朱国辉，翁小东，刘修恒，匡幼林Culture and cryopreservation of mouse bone marrow-derived dendritic cellsZhu Guo-hui, Weng Xiao-dong, Liu Xiu-heng, Kuang You-linAbstractBACKGROUND: Dendritic cell is an ideal carrier of tumor antigen due to the presenting function and the promotion of T cell proliferation. How to obtain large numbers of dendritic cells is important for producing tumor vaccine.OBJECTIVE: To induce, culture, amplify and cryopreserve dendritic cells derived from mouse bone marrow, then compare the biological characters of cryopreserved dendritic cells with the fresh dendritic cells, than find an effective method to obtain and store large numbers of dendritic cells.METHODS: Dendritic cells from mouse bone marrow cells were induced, cultured and amplified in complete medium with recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rmGM-CSF) (10 μg/L) and recombinant mouse interleukin 4 (rmIL-4) (5 μg/L). On day 6, the dendritic cells were frozen in complete medium with dimethyl sulphoxide. After thawing, lipopolysaccharide was added to induce the maturation. At last, large number of mature dendritic cells was obtained. Then the viability, morphology, dendritic cells markers and mixed lymphocyte reaction were compared between the thawed cells and fresh cells.RESULTS AND CONCLUSION: After thawing, the recovery rate of cells was (82.2±4.73)%. The survival cells became mature dendritic cells induced by lipopolysaccharide. Compared with fresh dendritic cells, there was no significant difference in morphology, dendritic cells markers and mixed lymphocyte reaction. Results suggest that there was no significant difference in biological characters between frozen-thawed dendritic cells and fresh dendritic cells. To store dendritic cells through cryopreservation can avoid repeating culture in different times and can obtain large numbers of dendritic cells.Zhu GH, Weng XD, Liu XH, Kuang YL.Culture and cryopreservation of mouse bone marrow-derived dendritic cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(45): 8455-8459. [ ]摘要背景：树突状细胞因其良好的抗原提呈功能及促T细胞增殖功能，成为肿瘤抗原的良好载体。
小鼠骨髓细胞提取及培养
小鼠骨髓细胞提取及培养小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。
2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。
3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。
5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。
6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。
轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。
7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。
8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。
9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。
10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。
2、按照24孔板每个孔的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。
3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。
4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。
5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。
注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。
2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。
3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。
一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法
专利名称：一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法专利类型：发明专利
发明人：国林沛,解晖,杨宪法,王准,彭双鹤,唐慧琴
申请号：CN202111468217.1
申请日：20211203
公开号：CN114058585A
公开日：
20220218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及细胞培养领域，特别是小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的原代培养。
该细胞培养步骤，包括：步骤A：获取小鼠完整的股骨；步骤B：获取股骨中的骨髓干细胞；步骤C：将骨髓干细胞接种于细胞培养板中，并加入细胞因子，刺激分化为树突状细胞。
本发明提供了一种经济高效的培养小鼠骨髓来源树突状细胞的方法，数十分钟即可获得大量的骨髓干细胞，加入少量的细胞因子培养6‑8天即可获得2×107以上成熟的树突状细胞。
申请人：无锡市第二人民医院
地址：214001 江苏省无锡市梁溪区中山路68号
国籍：CN
代理机构：天津佳盟知识产权代理有限公司
代理人：林玉慧
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bmdms培养方法
bmdms培养方法
BMDMS是指骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages）。
它们是一种重要的免疫细胞，常被用于研究免疫学、生物学和疾病模型等方面。
下面我将从多个角度介绍BMDMS的培养
方法。
1. 材料准备。
常用培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）或RPMI 1640培养基，其中含有10%胎牛血清（FBS）或去
血清培养基，还有抗生素如青霉素/链霉素。
2. 培养骨髓细胞。
首先需要从小鼠或大鼠的骨髓中分离细胞。
通常使用灭菌的
方式，将小鼠或大鼠的胫骨和腓骨取出，用培养基冲洗骨髓腔，将
细胞悬浮液通过滤网筛选，得到单个的骨髓细胞。
3. 培养和分化。
将分离得到的骨髓细胞接种在培养皿中，培养基中含有巨噬细胞分化因子如M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）。
细胞培养在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，每隔2-3天更换一次培养基，培养7-10天左右，即可得到成熟的BMDMS。
4. 细胞纯化。
有时为了得到更纯净的BMDMS，可以利用差速贴壁法（adherence method）或密度梯度离心分离等技术进行细胞纯化。
总之，BMDMS的培养方法是一个复杂而精细的过程，需要严格控制培养条件和培养基的配方，以确保得到高质量的巨噬细胞。
同时，培养过程中的细胞分化、纯化等步骤也需要根据具体实验的要求进行调整和优化。
希望以上信息能够对你有所帮助。
bmdc细胞提取步骤
bmdc细胞提取步骤BMDC（骨髓源性树突状细胞）的提取步骤通常包括以下几个步骤：1.准备工作：a.高效细胞培养基：根据实验要求选择适合的培养基，常见的包括RPMI-1640培养基、DMEM等。
b.包含20%胎牛血清（FBS）的细胞培养基。
c.手术器械：包括手术刀、剪刀、镊子和注射器等。
d.消化酶：常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。
e.细胞培养条件：包括恒温恒湿的细胞培养箱以及含5%CO2的细胞培养箱。
2.动物准备：a.选择符合实验要求的动物（常用小鼠）。
b.按照实验室动物管理规定进行麻醉和安乐死操作。
c.用70%乙醇对动物表面进行消毒。
3.BMDC提取：a.彻底消毒动物表面后，在操作实验纸上将动物放置在耳板的背面。
b.使用消毒的剪刀和镊子，从动物的骨髓中提取骨骼。
c.将提取的骨骼置于含有培养基的试管中，并用注射器吸入10mL的培养基，将髓腔彻底清洁。
d.将清洗后的骨骼放在含有培养基的培养皿中，在恒温恒湿的培养箱中孵育24小时。
4.BMDC筛选和分离：a.24小时后，将培养皿中的骨骼取出，用胰蛋白酶和胶原酶进行胶原酶消化处理。
b.消化结束后，用细胞培养基将胶原酶停止消化，并通过筛选筛除未消化的骨骼颗粒。
c.将筛选后的纯化细胞放入含有培养基的96孔培养板中，每孔种植一定数量的细胞。
d.将种植后的培养板放入恒温恒湿的培养箱中进行细胞培养和观察。
5.细胞培养和扩增：a.用培养基进行细胞培养，每2-3天更换一次培养基。
b.确保培养皿内有适当的氧气和营养物质。
c.观察细胞的生长情况，密度达到一定程度后，用胰蛋白酶进行细胞裂解。
d.细胞数目达到要求后，用所需的方式进行实验或培养。
BMDC的提取过程需要严格的操作和分离步骤，确保获取纯化的树突状细胞，这对进一步的实验研究是非常重要的。
香菇多糖对小鼠骨髓树突状细胞表型和功能的影响
香菇多糖对小鼠骨髓树突状细胞表型和功能的影响胡婷婷;孟一鸣;单风平【摘要】通过研究香菇多糖(Lentinan,LNT)对小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)功能调节的机制,进一步阐明香菇多糖的免疫活性.本实验将BMDCs分成脂多糖(LPS)阳性对照组、LNT处理组和RPMI1640空白对照组,应用酸性磷酸酶活性检测、流式细胞仪检测技术、吞噬实验、酶联免疫吸附试验检测各组BMDCs表型和功能的各种指标.结果显示,LNT(50 μg/mL)处理组BMDCs酸性磷酸酶活性降低;BMDCs吞噬能力比RPMI1640空白对照组明显下降;BMDCs表面MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86和DEC205的表达增加;BMDCs白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达增加.证明了适宜浓度的LNT可以促进BMDCs表型及功能的成熟.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2014(034)002【总页数】5页(P54-58)【关键词】香菇多糖;骨髓树突状细胞;表型;功能成熟【作者】胡婷婷;孟一鸣;单风平【作者单位】中国医科大学免疫学教研室,辽宁沈阳 110001;中国医科大学免疫学教研室,辽宁沈阳 110001;中国医科大学免疫学教研室,辽宁沈阳 110001【正文语种】中文【中图分类】Q939.93;R392香菇多糖(Lentinan，LNT)是香菇子实体提取物中的主要有效成分之一，是1969年 Chihara等［1］首次从香菇中分离出的具有抗肿瘤活性的多糖。
研究发现，LNT具有多种药理学作用，是一种兼有抑制肿瘤和提高免疫功能的多糖类生物反应调节剂［2］。
LNT可以增强巨噬细胞的吞噬功能，激活T淋巴细胞释放活化因子，提高NK细胞活性，诱导干扰素或白细胞介素等细胞因子的产生［3］。
树突状细胞(dendritic cells，DCs)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，具有独特的抗原递呈和激活功能;作为免疫反应的核心和关键，在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用［4］。
小鼠骨髓树突状细胞的培养扩增及生物学特性分析
中国组织工程研究与临床康复 第 12 卷 第 53 期 2008–12–30 出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research December 30, 2008 Vol.12, No.53基础医学小鼠骨髓树突状细胞的培养扩增及生物学特性分析***☆彭福华1，钟秀风2，胡学强1，王敦进1，朱灿胜1，王玉鸽1Amplification and biological characteristics of mouse bone marrow-derived dendritic cells in vitroPeng Fu-hua1, Zhong Xiu-feng2, Hu Xue-qiang1, Wang Dun-jin1, Zhu Can-sheng1,Wang Yu-ge1 AbstractBACKGROUND: So far, dendritic cells are considered to be the principal antigen-presenting cells (APC) with strongest function, but the number of dendritic cells is low in vivo. A method to get a large amount of dendritic cells is the premise of research on its properties and functions. OBJECTIVE: To establish a method for cultivation and amplification of mouse bone marrow-derived dendritic cells in vitro, and to observe cell morphology and related characteristics. DESIGN, TIME AND SETTING: An observational experiment of morphology was performed at Laboratory of Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-Sen University, from August 2006 to May 2007. MATERIALS: Twenty healthy female C57BL/6 mice were selected in the experiment. METHODS: Under aseptic condition, bone marrow cells were extracted from the tibia and femur bones of C57BL/6 mice. Bone marrow mononuclear cells were isolated, and cultured in the RPMI 1640 medium with recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rmGM-CSF) and interleukin (IL)-4 in vitro. Dendritic cells obtained were divided into two groups: lipopolysaccharide (LPS) -dendritic cell and sample dendritic cell. Dendritic cells in the LPS-dendritic cell group were treated with LPS for stimulating and the dendritic cells in the simple dendritic cell group were used as controls without treatment. MAIN OUTCOME MEASURES: The morphology of the dendritic cells was observed by inverted microscope and electron microscope. The biological characteristics of the dendritic cells were identified by flow cytometry. RESULTS: Two weeks after culture, the cultured cells displayed the typical morphology of dendritic cells. Under the inverted microscope, the surface of the cultured cells was irregular, and there were many dendrite-like processes on the surface. Under the electron microscope, the cultured cells had the typical morphology of dendritic cells. The cultured cells were indentified as myeloid dendritic cells by flow cytometry. High expressions of MHC-II, CD80, CD86 and CD11c were observed on the surface of the cultured cell. In the simple dendritic cell group, MHC-II expression was at a moderate level, CD80, CD86 and CD11c expressions were at a low level, and the cultured cells had the weak ability to stimulate the proliferation of T cells. In the LPS-dendritic cells group, MHC-II, CD80, CD86 and CD11c expressions were at a high level. CONCLUSION: The method of primary culture used in this experiment can produce a large amount of dendritic cells in vitro, and the cultured cells displays the typical morphology of dendritic cells with a higher purity. Peng FH, Zhong XF, Hu XQ, Wang DJ, Zhu CS,Wang YG.Amplification and biological characteristics of mouse bone marrow-derived dendritic cells in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(53):10547-10550(China) [ ]1Department of Neurology, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China; 2Department of Pathology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China Peng Fu-hua☆, Doctor, Department of Neurology, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China pengfh@mail. Correspondence to: Hu Xue-qiang, Professor, Department of Neurology, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China Supported by: Sun Yat-Sen University Clinical Research 5010 Program No.2007027*, Guangdong Natural Science Foundation, No. 8151008901000104*; A Program from Guangdong Province Science and Technology Department, No.2006B36004003* Received: 2008-10-13 Accepted: 2008-11-28摘要背景：树突状细胞是目前已知功能最强的专职性抗原递呈细胞，但树突状细胞在体内分布广泛且数量较少，获得大量的树 突状细胞是研究树突状细胞特性和功能的前提。
小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定
小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定作者：田蓉，李巍，于继云，刘玉峰【关键词】树突细胞In vitro culture and characterization of mouse spleen dendritic cells【Abstract】 AIM: To explore and optimize the methods for in vitro culture of mouse dendritic cells (DC) that were then observed morphologically and identified biologically. METHODS: Mice were injected with 200 mg/kg cyclophosphamide through the tail vein, and were sacrificed 8 d later. Spleen cells were cultured with ordinary methods firstly, and 3 d later conditional medium containing IL4, GMCSF was added, and TNF αwas added at day 5. At day 8, cells were subjected to phasecontrast microscope, scanning electron microscope, and transmission electron microscope analysis. At day 3, 5, 7, cells were subjected to FACS for detection of cell surface markers. RESULTS: Cultured cells displayed a typical DC phenotype in morphological analysis, and FACS showed these cells expressing such DC markers as CD11c, CD86,ⅠAb, H2D6. CONCLUSION: Using ofIL4, GMCSF, TNFαas stimulators in the mouse spleen cell culture can obtain DC with high quality and high purity, which makes a foundation for future research on the basic and clinical usage of DC.【Keywords】 dendritic cells; cytokines; MHCⅡ molecule【摘要】目的：探索、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞（DC）的方法，并进行形态学观察和生物学鉴定. 方法：应用环磷酰胺200 mg/kg经尾静脉注射Balb/c小鼠，8 d后处死小鼠，常规培养脾细胞，第3日加入含有IL4, GMCSF细胞因子的条件培养液，第5日补加TNFα,第8日制备标本进行相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，并分别在培养第3, 5, 7日经流式细胞仪检测成熟细胞表面标志. 结果：刺激培养细胞经相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，具有典型的DC形态，流式细胞仪检测发现细胞表面表达CD11c, CD86, ⅠAb, H2D6标志物. 结论：在小鼠脾脏细胞培养中加入IL4, GMCSF, TNFα等刺激，可获得足量、较高纯度的DC，为DC的基础研究与临床应用奠定了基础.【关键词】树突细胞；细胞因子；MHCⅡ类分子0引言自从Steinman等于1973年发现树突状细胞（dentritic cell, DC）以来［1］，DC作为体内最重要的抗原提呈细胞，其强大的提呈抗原作用和启动初始T细胞的能力，日益引起国内外学者的关注. 特别是DC与肿瘤免疫的密切关系以及在抗肿瘤方面的独特功能，使其成为肿瘤免疫研究的一个重要领域. DC来源于骨髓CD34+细胞［2］，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的关键，然而DC在体内分布散在，含量极低，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1%. 目前体外培养DC的方法尚不尽人意，在很大程度上限制了对DC基础和临床工作的开展. 我们在体外培养扩增了Balb/c小鼠的DC细胞，在培养中添加IL4, GMCSF, TNF等刺激，并通过相差显微镜、电镜观察和流式细胞仪检测分析对所培养细胞进行鉴定，为优化DC的体外培养方法进行积极的探索.1材料和方法1.1材料环磷酰胺购自上海华联公司；荧光标记抗体：CD11cFITC, IAbFITC, H2DbFITC, CD86FITC购自Diaclone公司；rmGMCSF, rmIL4, TNFγ，胎牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶购自美国GIBCOL公司；Hepes，青霉素，链霉素购自美国Sigma公司；倒置相差显微镜为日本Olympus公司生产，低速离心机为北京医用离心机厂生产，微量台式高速离心机为德国Heraeus公司生产，流式细胞仪为Coulter公司生产，扫描电镜、透射电镜由美国BD公司生产；6~8 wk 龄雄性Balb/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心.1.2方法1.2.1DC细胞的分离与培养将环磷酰胺按200 mg/kg体质量由小鼠尾静脉注射，8 d后颈椎脱位处死小鼠，750 mL/L乙醇浸泡10 min，无菌条件下用镊子取出脾脏移入放在平皿的100钼钢网上，剔除脾周围的结缔组织，剪碎、研磨后收集滤过的细胞悬液，离心800 r/min, 7 min，加TrisNH4Cl 3 mL，溶除红细胞，获取细胞悬液，以完全培养基悬浮为1×109 /L细胞，37℃，50mL/L CO2孵箱培养. 3 d后，吸弃全部培养基及悬浮细胞，加rmGMCSF/rmIL4条件培养基隔日半量换液，第5 d补加细胞因子TNFγ 1 mg/L，第7 d吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，次日收集悬浮的细胞即为富集的DC. 相差显微镜下观察细胞形态特点.1.2.2扫描电镜观察取如上培养7 d的细胞悬液，接种放置在培养皿中的盖玻片上，37℃， 50 mL/L CO2孵箱培养. 待细胞汇合，取出盖片，浸入PBS漂洗细胞表面；将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加4℃预冷的40 mL/L戊二醛，在4℃固定2 h，吸出固定剂，PBS浸洗2次，每次10 min，再用4℃预冷的10 g/L锇酸固定，在4℃固定1 h，然后用PBS浸洗2次，每次10 min；用系列梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，扫描电镜观察细胞表面结构.1.2.3透射电镜观察取如上培养7 d的细胞悬液，PBS洗涤，细胞沉淀用40 mL/L戊二醛固定，梯度乙醇脱水，包埋，经超薄切片铅铀染色后透射电镜观察细胞超微结构.1.2.4细胞表面标记FACS分析分别收集培养第3, 5, 7 d的细胞，离心800 r/min, 7 min，弃上清，用含20 mL/L牛血清的PBS 洗液 1 mL洗涤2次，分别加终浓度为 5 mg/L的标记抗体 1 μL （CD11cFITC, IAbFITC, H2DbFITC, CD86FITC）. 设阴性对照组. 4℃轻度震荡30 min；再用PBS 1 mL洗液洗涤2次；间标抗体再加入FITC 标记羊抗鼠lgG, 100 μL/管，终浓度为5 mg/L，4℃避光轻度震荡30 min， PBS 1 mL洗液洗涤2次，加10 g/L多聚甲醛400 μL固定，上流式细胞仪检测. 2结果2.1DC的分离与培养经尾静脉注射环磷酰胺的小鼠，饲养8 d 后，脾脏明显增大，为正常小鼠脾脏体积的3倍左右，脾细胞数平均7.5×107/只. 镜下观察细胞体积较大、均匀、圆形，加入GMCSF 20 μg/L, IL4 1 μg/L体外培养3 d后，增殖出大量悬浮的粒细胞及疏松黏附于贴壁单核细胞上的增殖性细胞集落. 第8日收集已脱落的及疏松黏附的细胞集落，即为富集DC.2.2相差显微镜观察培养7 d的DC，相差显微镜下可见较大体积的悬浮细胞，具多形性，贴壁时有细长突起，“呈树突状”，悬浮时向四周伸展出大量毛刺状胞质突起，呈“刺猬状”，部分伸展为不规则状（图1）.图1培养DC的相差显微镜观察×100（略）2.3扫描电镜观察培养7 d的DC，扫描电镜下可见细胞伸展出大量大小不一、扁平的胞质突起，末端圆钝，细胞膜光滑无皱折（图2A）.2.4透射电镜观察培养7 d的DC，透射电镜DC胞体周围可见不规则突起和褶皱；胞核染色深，偏向一侧，形状不规则，多为分叶状；胞质线粒体较为丰富，较多吞饮大泡及小泡，高尔基体、溶酶体少. 所培养细胞具有典型的DC形态特征（图2B）.A：扫描电镜；B：透射电镜.图2培养DC的电镜观察×1000（略）2.5细胞表面标志FACS鉴定应用流式细胞仪分析体外培养第3, 5, 7日，及补加细胞因子TNFγ后第7 d的DC表面标志显示： N418（CD11c）细胞比例分别为16.22%, 13.54%, 34.37%, 78.16%; MHCII （Iab）细胞比例分别为28.80%, 21.88%, 25.85%, 58.45%; MHCI类（H2Db）细胞比例分别为4.82%, 2.46%, 11.94%, 24.635; B72（CD86）细胞比例分别为77.89%, 59%, 75.71%, 80.59%; 随着细胞成熟，MHCI 类分子、MHCII类分子、共刺激分子的表达逐渐增高，加入TNFγ后，所测DC各表面标记均有较明显的增高，显示出TNFγ在DC的成熟分化中的突出作用. 流式细胞仪分析细胞表型结果证实所培养的细胞为淋巴系DC.3讨论DC在组织中分布广，但含量极少，因此建立成熟的DC体外培养技术获得足够数量的有功能的DC就显得非常重要［3］. 1992年，Steinman实验室首先建立了用GMCSF从小鼠骨髓中大规模培养制备DC 的方法，目前，小鼠DC的来源仍主要采用这种方法. 但新近研究表明［4］，如果应用亚致死量化疗或放疗药物处理小鼠，使DC前体细胞重新定位于脾脏，在特定的造血环境下扩增，再取出以GMCSF或GMCSF+IL4培养，就能扩增出大量DC，且具有产量大、纯度高、稳定性高、操作简便等特点. 在上述工作基础上，本实验予高剂量（200 mg/kg体质量）环磷酰胺经尾静脉注射小鼠，8 d后可见小鼠脾脏显著增大，此脾细胞经GMCSF （20 μg/L）+ IL4（μg/L）培养，第5日补加细胞因子TNFγ，第8日，获得了大量淋巴系DC，每只小鼠平均可得7.5×107细胞数，较文献报道细胞数高. 将培养细胞悬液在相差显微镜及电镜下观察，发现所培养细胞具有典型的DC形态特征，均明显有别于单核细胞和巨噬细胞［5］.DC的发育、成熟与其在体内的迁徙过程和细胞表面标记的变化之间的复杂关系，是其重要的生物学特点［6］. DC并不是一个均一的群体，但所有的DC均来源于骨髓干细胞，不论是组织DC还是培养DC，不论是人DC还是小鼠DC，均可区分为非成熟和成熟两个阶段［7］. 非成熟DC主要位于易与外来抗原接触的外周器官，细胞表面较高表达与吸收和加工抗原有关的分子，如CD1A，CCR6；而当DC细胞完成抗原加工功能，向次级淋巴器官迁徙的过程中，那些影响DC 细胞迁徙、提呈抗原、激活T细胞的趋化因子、黏附分子、MHCI类分子、MHCII类分子及共刺激分子，包括CD1, CD4, CD33, CD40, Iab, H2Db, CD80 （B71），CD86（B72）等的表达逐渐增加，最终，DC转变成为能够专职递呈抗原、发挥免疫功能的成熟DC［8-9］. 我们分别收集所培养第3, 5, 7日及补加细胞因子TNFγ后第7日的DC，应用流式细胞仪分析细胞的表型，结果显示所培养的DC已表达了主要表面标记，并随时间变化总体呈现上升趋势，在培养第5日有所降低，但到第7日时，均明显升高，由于所测表面分子均为成熟DC主要的标记，所以表型的变化规律基本符合DC的成熟过程. 培养DC表面这些分子的升高或较高比例的表达，表明其已成为有可能发挥功能的抗原递呈细胞.另外，我们注意到，在培养第5日补加细胞因子TNFγ后，DC表面的标记分子明显上升，这进一步证实了TNFγ在DC发育、成熟中的作用. 可能的机制为：TNF作为第一信号，可上调并维持干细胞的GMCSFR，抑制干细胞朝粒系转化；上调的GMCSFR在接受GMCSF的刺激后，进一步朝DC方向发展. 实验结果中有些标记分子的表达比预期的以及理论上的表达量低，可能是由于体外培养DC的各种环境和条件与体内还存在着不同以及操作上的某些差异造成的，但结合细胞形态及表面标志物整体分析，本实验已培养出了具备典型成熟DC特征的细胞，为进一步探讨DC体外对T淋巴细胞的激活作用及抗瘤作用奠定了基础.【参考文献】［1］ Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in perpheral lymphoid organs of mice I. Morphology, quantitation, tissue distribution ［J］. J Exp Med, 1973,137(5):1142-1162.［2］ Kleindienst P, Brocker T. Endogenous dendritic cells are required for amplification of T cell responses induced by dendritic cell vaccines in vivo ［J］. J Immunol, 2003,170(6):2817-2823.［3］ Crespo I, Paiva A. Immunophenotypic and functional characterization of cord blood dendritic cells ［J］. Stem Cells Dev, 2004,13(1):63-70.［4］ Pospisilova D, Borovickova J. Methods of dendritic cell preparation for acute lymphoblastic leukemia immunotherapy in children ［J］. Med Oncol, 2005,22(1):79-88.［5］ Sandell MH. Dadabayey AR. Prognostic value of tumorinfiltrating dendritic cells in colorectal cancer: Role of maturation status and intratumoral localization ［J］. Clin Cancer Res, 2005,11(7):2576-2582.［6］Andersson BU, Tani E. Prognostic value of tumorinfiltrating dendritic cells in colorectal cancer: Role of maturation status and intratumoral localization ［J］. Clin Cancer Res, 2005,11(7):2576-2582.［7］Hamada I, Kato M. Clinical effects of tumorassociated macrophages and dendritic cells on renal cell carcinoma ［J］. Anticancer Res, 2002,22(6C):4281-4284.［8］ Hajek R, Butch AW. Dendritic cell biology and the application of dendritic cells to immunotherapy of mμLtiple myeloma ［J］. Med Oncol, 2000,17(1):2-15.［9］ Avigan D. Fusions of breast cancer and dendritic cells as a novel cancer vaccine ［J］. Clin Breast Cancer, 2003, 3 （Suppl 4）: S158-S163.11。
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2002 年---美国匹兹堡癌症研究院大学(University of Pittsburgh Cancer Institute (UPCI)) 的 Son 也研发出一种超大量 BMDC 培养方法，称为 bulk-culture method。该法每只小鼠可获 得的 BMDC 的数量是 Inaba 经典方法的 7-10 倍，即 3 – 4 x 107 个 BMDC，而且培养时间 与 Inaba 经典方法相似，仅需 7 天[9]。 1. 2. 3. 4. 骨髓取出后仅溶血，不做任何其它处理； 使用6孔培养板培养； 培养过程中使用GM‐CSF+IL‐4联合诱导； 培养的第4天和第7天补加足量的GM‐CSF和IL‐4。
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【BMDC 培养的发展简史】
1973 年 ---加拿大籍科学家 Raplph M. Steinman 在美国洛克菲勒大学 (Rockefeller University)工作时从小鼠外周淋巴器官(脾、淋巴结和派氏集合淋巴结)中首次鉴定出树突状 细胞(Dendritic Cells, DC)[1]。Steinman 也因此获得了 2011 年诺贝尔生理学或医学奖。 1992 年---日本京都大学(Kyoto University)的 Inaba 在添加 GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集 落刺激因子)的情况下，分别成功从小鼠血液和骨髓细胞体外诱导出大量的 DC[2,3]。因此， Inaba 被认为是小鼠 DC 体外培养的创立者，且 Inaba 法被称为小鼠 BMDC 培养的经典方 法。 1. 这些工作均是在Ralph M. Steinman的参与下完成的； 2. Inaba培养的BMDC来源于小鼠股骨和胫骨中的骨髓； 3. Inaba先用抗体+补体法去除骨髓中的淋巴细胞，以防淋巴细胞对 BMDC培养的影响； 4. 在诱导分化过程中，为防止粒细胞的干扰，Inaba通过每2天轻摇培 养板并3/4体积换液的方法来尽量去除粒细胞； 5. Inaba证实单用GM‐CSF通过6‐8天的培养，即可从骨髓细胞诱导得到 大量的DC细胞，而且混合淋巴细胞反应提示其为成熟的DC细胞； 6. 该法可从一个小鼠的骨髓中培养获得 5‐7 x 106个DC细胞。
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1. 骨髓不作任何预先处理； 2. 使用细菌培养皿(Petri Dish)替代细胞培养板； 3. 细胞的初始铺板密度低，为2 x 105/ml； 4. 培养时间延长至10‐12天； 5. 仍仅用GM‐CSF诱导，但第8天或第10天后减量使用； 6. 第6天和第8天半量换液，但吸出的悬浮细胞离心后放回原板。
【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法(改良)[3,10] 背景：
1. Inaba 法获得的 BMDC 数目为 5-7 x 106 个/小鼠； 2. Inaba 原法操作比较复杂，需要将骨髓中的淋巴细胞等用抗体+补体法预先去除， 后来的改良法均省却了这个步骤，其实 Inaba 后来自己也说这个步骤虽然可提高 BMDC 的纯度，但不会对 BMDC 的生成产生影响，可做可不做[10]； 3. Inaba 原法仅用 GM-CSF 来诱导 BMDC 的产生，虽然得到的 BMDC 在混合淋巴 细胞反应中有较强的刺激能力，但 DC 的成熟度不及 GM+IL-4 的联合诱导，所以 后来的改良法中多用 GM+IL-4 联合诱导。
收集DC，重新铺板， 以促进DC更成熟
加入以下任意一种成熟诱 导剂： 1. rmTNF‐ (25‐50ng/ml) 2. LPS (1g/ml) 3. rmCD40L (1g/ml)
【前 言】
原递呈细胞 (Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始 T 细胞 (Naï ve T cells)增殖的 APC，而其它种类的 APC(如单核巨噬细胞，B 细胞等)仅能刺激已活化 的或记忆性的 T 细胞，因此 DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中也 发挥着极其重要的作用。 虽然 DC 存在于体内多种组织中，但含量很少，无法满足科学研究和临床治疗的需要， 所以人们尝试多种方法来体外培养和扩增 DC。对于人，最常用的方法是从人外周血单个核 细胞(PBMC)诱导 DC 的产生。而对于小鼠，最常见的方法是从骨髓细胞诱导产生 DC，即骨 髓来源的 DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。 鉴于功能分析和分子生物学研究的需要，获得更高数量和更高纯度的 BMDC 是大家一 直追求的目标，本文将与大家分享 BMDC 的经典制备方法和大量制备法，大家可根据自身
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D
C 是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出 许多树突样或伪足样突起而得名。DC 是由 2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大 籍科学家 Ralph M. Steinman 于 1973 年发现的[1]，是目前发现的功能最强的抗
培养步骤：
1.
1.1
小鼠骨髓细胞的获得
小鼠(6 - 10 周龄)颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨(femurs)和胫骨(tibias)， 并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；
注：不要损伤到骨。
1.2 1.3 将骨移至超净台内，并用盛有 70%酒精的无菌培养皿浸泡 2-5min，以消毒灭 菌，然后用无菌的 PBS 洗 2 次； 将骨移入另一个盛有 PBS 的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽 取 PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至 骨完全变白； 1.4 1.5 1.6 收集骨髓悬液，用 200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织； 滤过液 1200 rpm 离心 5min，弃上清； 加入 2 ml 氯化铵红细胞裂解液(1x)，重悬细胞，室温孵育 3-5min，最长 10min； 氯化铵红细胞裂解液的配制： 1. 先配制10x的贮存液，配法如下： 称取82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA，溶于1L的蒸馏 水中，0.22m滤膜过滤除菌，4oC储存6个月；
1994 年---奥地利因斯布鲁克大学(University of Innsbruck)的 Romani 等发现 GM-CSF 和 IL-4(白细胞介素 4)联合诱导，可从人血液 PBMC(外周血单个核细胞)制备出大量的 DC，而 GM-CSF 单独诱导的效果不好[4]。后来，科学家也将 IL-4 应用于小鼠 BMDC 的培养[5,6]。 1999 年----德国明斯特大学(University of Munster)的 Labeur 研究表明，单独用 GM-CSF 诱导的 BMDC 为未成熟 DC(immature DC, iDC)，GM-CSF 和 IL-4 联合诱导出来的 BMDC 的成熟度居中，添加 CD40L 或 LPS 可进一步诱导 DC 完全成熟，即成熟 DC(mature DC, mDC)[7]。 1999 年---德国埃尔朗根大学(University of Erlangen)的 Lutz 开发出一种可获得超大量 BMDC 的方法，每只小鼠可获得的 BMDC 的数量是 Inaba 经典方法的 50 倍之多，达 1-3 x 108 个 DC 细胞/小鼠[8]。该法被 DC 研究者广泛认可和使用。
摘自文献 Inaba K, et al. J Exp. Med. 1992; 176(6):1693-702 [3]
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摘自文献 Son YI, et al. J Immunol Metods. 2002; 262(1-2): 145-57 [9]
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2.3 每 2 天轻轻摇晃培养板，然后 3/4 体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。
注：1)此步骤的目的是去除粒细胞和淋巴细胞，因粒细胞和淋巴细胞为悬浮生 长； 2) Inaba 认为培养的前 4 天，大部分 DC 贴壁仍较牢，所以此法不会大量 损失 DC； 3) 若发现损失的 DC 细胞过多，可仅在培养的第 2 天用此法换液； 4) 在培养的第 4 天，可以看到聚团生长的 DC 贴附于板底，第 6 天则可 观察到很多 DC 成集落生长。
小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养
主要目次
【经典的 BMDC 制备方法简图】--------------------------------------------- 1 【BMDC 培养的发展简史】--------------------------------------------------- 2 【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法(改良) ----------------------------------4 【BMDC 大量制备法】-Son 法-------------------------------------------------6 【BMDC 大量制备法】-Lutz 法------------------------------------------------7 【注意事项】----------------------------------------------------------------------9