5-分子标记及相关的实验技术.
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优点：多态性丰富。 缺点：引物需要标记。
5) CAPS标记
特异引物PCR与酶切相结合的一种标记。
根据RAPD标记或RFLP标记，设计特异引物进行PCR
扩增（SCAR，STS）。有时扩增片段大小无差异，此
时对扩增片段进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙
烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。
揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变 异的信息。
（5）取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，DNA沉淀。 （6）挑出DNA团，用70%酒精洗两次。 （7）风干。 （8）溶解于适量的TE 缓冲液中或水中。 （9）-20 ℃保存。
1.3 DNA 质量和浓度的检测
(1) 外观： 好的 DNA 沉淀为白色，干后透明。如果干后仍呈白 色，常因蛋白较多；若呈 黄至棕色，则是有多酚类 杂质；呈胶冻状则含有多糖。 （2）紫外分光光度法： 1)测量 260 nm 处的紫外吸收值，用于定量，每个 OD 值相当于 DNA 浓度为 50 μg/mL。 DNA浓度=A260×50 μg/mL×稀释倍数 2)A260/A280比值若为 1.80 左右，则 DNA 比较纯; ＞1.80，则含有 R N A； ＜1.80，则含有蛋白质。
（3）琼脂糖凝胶法 1)琼脂糖电泳后胶孔处有 EB(溴化乙锭) 吸收，表明有多糖和蛋白。 2) 电泳呈弥散状，DNA降解。 3)未降解的 DNA，电泳时用标准量的 λDNA 进行定量。
1.4植物DNA提取注意事项
(1)液氮量要足够,研第一个样时，加入液氮后，先不磨， 等液氮挥发一些，研钵冻透，第二次加入液氮，研磨。
1）DNA提取
CTAB法 根据试剂不同分为 SDS法 大量制备 根据实验目的不同分为 小量制备
1.1 CTAB法 CTAB是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合 物在高盐溶液中(＞0.7 mol/L NaCl)可溶，并且稳定 存在。
在低盐条件下(＜0.5 mol/L NaCl)， CTAB与核酸的复合
(2)
(3) (4)
(5) (6)
(7) (8) (9)
(10) 加入2/3体积的冰预冷的异丙醇,并上下翻转以充分 混合,至-20℃2ｈ。 (11)于4℃,1200×ｇ离心10ｍｉｎ。
(12) 在一新管中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/Ｌ
ＮａＡｃ溶液,用玻棒将ＤＮＡ转入该管(如不能直接 用玻棒缠出,可离心后倒出上清,再在其中加入20ｍｌ 含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液),放置20ｍ ｉｎ后稍许离心,移走上清并吸出残存乙醇,室温干 (13) 加入1 0ｍｌＴＥ(10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ ＰＨ=8 0,1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ)并加入终浓度为 20(ｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ,过夜。
(14) 风干,用50μｌＴＥ缓冲液溶解,存于-20℃备用。
2)RNA提取
与DNA提取相比，RNA提取的最大特 点是由于细胞中RNase非常稳定，能降 解RNA，必须采取措施，抑制 RNase活 性。
2.1提取RNA主要步骤： （1）所有的玻璃器皿，都在160℃烘8小时；塑 料器皿和所有用到的水都用0.5%的DEPC处理， 37 ℃，保温2天，然后高压灭菌。 （2）操作时戴一次性手套，并勤换，戴口罩。 （3）取植物样品时，迅速用液氮冷冻，放-70 ℃保存。 （4）将植物组织彻底磨碎。 （5）使蛋白变性，以便使蛋白和核酸分离开来， 所用试剂既能抑制Rnase活性，又能使蛋白变性。 （6）将RNA与DNA和蛋白质分离出来。
例1、CTAB法小量制备植物DNA
以小麦为例： CTAB缓冲液： 1.4M 山梨醇 10ml 1M Tris_Cl PH8.0 22ml 0.5M EDTA PH8.0 4.4ml CTAB 0.8ml N-LSC 1g 加水至100ml (1)取少许小麦叶片,放入1.5ml离心管中,加入液氮冷 冻,用带尖的玻璃棒研碎。 (2)加入500ul,65℃预热的缓冲液混匀,65 ℃水浴保温 20分钟。 （3）加入500ul氯仿-异戊醇（24：1），混匀。
1）去除酚类：
含有酚类杂质的 DNA 其沉淀物多呈黄色至褐色，难以溶 解或溶液色深。
抽提缓冲液中要加入一定量的
A：防止酚类氧化的试剂： 如β-巯基 乙醇、抗坏血酸、半 胱氨酸、亚硫酸钠、二硫苏糖醇。
B：与酚类结合的物质如PVP (聚乙烯吡咯烷酮)。
2）去除多糖： 如果材料中含有较多多糖，一般提取方法将很难去除。多 糖常与 DNA 共 沉淀 而使沉淀物呈胶冻状。 A：将简易提取法所得DNA溶于TE缓冲液中后(DNA的充 分溶解对于有效去除多糖和次生代谢杂质极为重要)，加入 适量4 mol/L NaCl，使溶液中NaCl 的终浓度达到1.0～2.5 mol/L， 然后再次用-20℃无水乙醇将DNA沉淀出来，经洗 涤风干后，溶于TE中。 B： 使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅 速混匀，多糖会先沉淀。 C：沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。 a)高盐法：如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。 b)PEG(聚乙二醇，WT 8 000)代替乙醇沉淀 DNA： D：选择幼嫩组织。
物就会沉淀，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。
当材料中多糖少时，可不用 1% CTAB 沉淀缓冲液来
沉淀 DNA，在经氯仿-异戊醇(24∶1)抽 提之后，用 异丙醇或乙醇沉淀 DNA，使提取过程简化 用异丙醇或乙醇沉淀核酸，CTAB则溶于乙醇中。 CTAB法获得的核酸质量好，完整20-40kb，RNA少。
缺点：操作复杂，成本高, 需要标记探针。
2）RAPD 标记
随机引物PCR标记。 模板DNA扩增区段上引物结合位点碱基发生突 变或扩增片段之间发生插入突变或缺失突变， 因此表现为扩增产物的有无或片段的大小的 差异。 RAPD通常是显性的——片段的有无。 有时为共显性——片段的大小的差异。 RAPD所用引物通常为9—10个碱基，因此， PCR要用较低的退火温度（36℃ ）。
第三节：分子标记
1、几种主要分子标记简介
2、植物核酸的提取
3、PCR技术 4、Southern杂交技术
1、几种主要分子标记简介
1）RFLP标记
RFLP标记基于Southern杂交技术。
限制性片段长度多态性。
这种多态性是由于限制性内切酶酶切位
点或位点间DNA区段发生突变引起的。
基因组酶切后，产生连续的大小不一的酶切片 段，电泳不能直接辨别某一片段大小的变化。 利用某一基因组DNA片段或某一cDNA片段克 隆为探针，通过Southern杂交进行检测。 优点：共显性，重复性和稳定性好。
附1：棉花DNA提取
ＤＮＡ研磨缓冲液: 0.1ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ 5ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ 0.35ｍｏｌ/Ｌ葡萄糖 2%ＰＶＰ400（聚乙烯吡咯烷酮 ） 1%ＤＩＥＣＡ 0.1%Ｖｃ 0.2%β -巯基乙醇 ｄｄＨ2Ｏ
细胞核裂解缓冲液: 2%ＣＴＡＢ ; 1ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣ; ｌ0ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ ; 4ｍｏｌ/ＬＮａＣ; ｌ%ＰＶＰ40; 1%ＤＩＥＣＡ ; 1%Ｖｃ; 2%β -巯基乙醇; ｄＨ2Ｏ
防止材料融化。
（2）研碎，粉面状。影响产量的关键。 （3）氯仿-异戊醇（24：1）抽提时，摇晃一定要轻，减少 DNA断裂。 （4）CTAB法离心时，温度不能低于15 ℃，否则，CTAB沉淀， 损失DNA。
（5）溶解DNA时，避免用枪吸上吸下。
（6）避免反复冻融。 （7）棉花等酚类、多糖物质多的植物DNA提取时，缓冲液和 分离步骤应有相应的变化。
优点：1)引物已经商品化，覆盖整个基因 组，多态性高， 2)DNA量要求少，质量要求不高， 操作简单。 缺点： 1)通常为显性，无法区分显性纯合 体和杂合体。 2)引物较短，PCR结果不稳定。
3)SSR标记
SSR是特异引物的PCR标记。称为微卫星或简单重复序列。 重复单元为几个核苷酸，重复次数一般为10-50个。 由于基本单元的重复次数不同而形成SSR座位的多态性。 根据SSR座位两侧序列设计一对特异引物来扩增SSR序列。 经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的迁移距离，就可 知某个SSR座位上的多态性。
2.2 RNA电泳检测
电泳检测RNA的完整性 可采用变性胶或非变性胶检测.
非变性胶浓度要高1.2-1.4%，电压适当增加,快速结束, 可检测RNA的降解程度。
变性胶中RNA分子量才与泳动速度成正比，因此，变性 胶既能检测RNA的降解程度，又可检测大小。 例2 RNA变性胶电泳
优点：多态性十分丰富，共显性。
缺点：引物设计比较困难。Hale Waihona Puke Baidu
4）AFLP标记
AFLP是基于限制性酶切和PCR的DNA标 记。 将样品DNA用限制内切酶进行酶切，再 对酶切片段进行有选择地扩增，检测其 多态性。
首先用两种能产生粘性末端的限制性内切酶将基
因组DNA切割成分子量大小不等的限制性片段，然 后将这些片段和与其末端互补的已知序列的接头连 接，所形成的带有接头的特异片段用作随后的PCR 反应膜板。 PCR引物5´端与酶切位点序列互补，3 ´端在酶切 位点后增加1-3个选择性碱基，使得一定比例的酶切 片段被选择地扩增，PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳来分辨。
（4）15000转/分，离心5分钟。 （5）吸上清到一新的离心管中，加0.6 倍体积异丙醇,混匀,放置2-3分 钟,15000转/分离心5分钟. (6)70%的酒精洗涤一次. (8)干燥,加50ul TE缓冲液溶解DNA,也可 用水溶解。
1.2 SDS法 是阳离子去污剂。 用含有高浓度 SDS 的抽提缓冲液在 65 ℃ 对植物细胞进行裂解后，
用提高盐浓度(KAc)和降 低温度(冰上 保温)的办法沉淀除去蛋白和多糖， 剩下的 DNA 再进一步纯化。
例2、 SDS法大量制备植物DNA（水稻）
SDS-DNA提取缓冲液： 100mM Tris-Cl pH8.5 500mM NaCl 50mM EDTA Ph8.0 1.5% SDS (1)取5g左右水稻叶片，剪成2cm左右，放入研钵中，加 入液氮冷冻，研磨至细粉状。 （2）将粉末导入50ml离心管中，加入10ml 65 ℃预热 的缓冲液，在65 ℃水浴中保温20分钟左右。中间混 样2-3次。 （3）离心管中加入5ml 5M KAC混匀，冰浴20分钟。 （4）加入10ml氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀5分 钟，4000转/分离心10分钟。
6）SNP标记
基于单核苷酸多态性的DNA标记 鉴定SNP最直接的方法是通过设计特异PCR引物扩增
某个特定区域的DNA片段，通过测序和遗传特征的
比较来鉴定该DNA片段是否可以作为SNP标记。
SNP在基因组中广泛存在，数量丰富。
2、植物核酸的提取
基本步骤： 磨样——缓冲液浸提——抽提——沉淀核酸— —70%酒精洗——溶解核酸
(1)
取2ｇ新鲜幼嫩的叶片放入研钵中,加入液氮后快速、 充分研磨,待成极细的粉末状时迅速转入到50ｍｌ 离心管中。 在50ｍｌ离心管中加入10ｍｌ冰预冷的研磨缓冲 液,在涡悬振荡器上充分混匀。 于4℃,2700×ｇ离心20分钟,倒去上清液。 在沉淀中加入5ｍｌ裂解缓冲液,在涡旋振荡器上充 分混匀。 于65℃水浴锅中温育30ｍｉｎ。 加入5ｍｌ氯仿/异戊醇(24/1),并上下翻转以充分混 合。 于4℃,2700×ｇ离心5分钟。 转移上层水相至一新的50ｍｌ离心管中。 重复步骤7-9一次。
例1：酸性异硫氰酸胍－苯酚－氯仿抽提法
(Wadsworth et al.,1988) （1）取一定量植物材料于液氮中研碎， （ 2 ） 置 于 3ml 异硫氰 酸胍提取 液 (4M 异 硫氰酸胍 ， 0.1M巯基乙醇, 0.5%十二烷基肌氨酸钠 , 25mM柠檬 酸钠PH7.0)中，混匀。 （ 3 ）依次加入 0.3ml 2M NaAc （ PH 4.0) 、 3ml 酸性苯 酚和1ml氯仿/异戊醇,混匀。 （4）4 ℃，12000转/分，离心20分。 （5）用苯酚/氯仿/异戊醇再抽提一次。 （6）上清用等体积的异丙醇沉淀。 （7）将沉淀用70%乙醇洗涤一次。稍晾干。 （8）总RNA溶于无核酸酶的水中，于-70C保存。
5) CAPS标记
特异引物PCR与酶切相结合的一种标记。
根据RAPD标记或RFLP标记，设计特异引物进行PCR
扩增（SCAR，STS）。有时扩增片段大小无差异，此
时对扩增片段进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙
烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。
揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变 异的信息。
（5）取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，DNA沉淀。 （6）挑出DNA团，用70%酒精洗两次。 （7）风干。 （8）溶解于适量的TE 缓冲液中或水中。 （9）-20 ℃保存。
1.3 DNA 质量和浓度的检测
(1) 外观： 好的 DNA 沉淀为白色，干后透明。如果干后仍呈白 色，常因蛋白较多；若呈 黄至棕色，则是有多酚类 杂质；呈胶冻状则含有多糖。 （2）紫外分光光度法： 1)测量 260 nm 处的紫外吸收值，用于定量，每个 OD 值相当于 DNA 浓度为 50 μg/mL。 DNA浓度=A260×50 μg/mL×稀释倍数 2)A260/A280比值若为 1.80 左右，则 DNA 比较纯; ＞1.80，则含有 R N A； ＜1.80，则含有蛋白质。
（3）琼脂糖凝胶法 1)琼脂糖电泳后胶孔处有 EB(溴化乙锭) 吸收，表明有多糖和蛋白。 2) 电泳呈弥散状，DNA降解。 3)未降解的 DNA，电泳时用标准量的 λDNA 进行定量。
1.4植物DNA提取注意事项
(1)液氮量要足够,研第一个样时，加入液氮后，先不磨， 等液氮挥发一些，研钵冻透，第二次加入液氮，研磨。
1）DNA提取
CTAB法 根据试剂不同分为 SDS法 大量制备 根据实验目的不同分为 小量制备
1.1 CTAB法 CTAB是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合 物在高盐溶液中(＞0.7 mol/L NaCl)可溶，并且稳定 存在。
在低盐条件下(＜0.5 mol/L NaCl)， CTAB与核酸的复合
(2)
(3) (4)
(5) (6)
(7) (8) (9)
(10) 加入2/3体积的冰预冷的异丙醇,并上下翻转以充分 混合,至-20℃2ｈ。 (11)于4℃,1200×ｇ离心10ｍｉｎ。
(12) 在一新管中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/Ｌ
ＮａＡｃ溶液,用玻棒将ＤＮＡ转入该管(如不能直接 用玻棒缠出,可离心后倒出上清,再在其中加入20ｍｌ 含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液),放置20ｍ ｉｎ后稍许离心,移走上清并吸出残存乙醇,室温干 (13) 加入1 0ｍｌＴＥ(10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ ＰＨ=8 0,1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ)并加入终浓度为 20(ｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ,过夜。
(14) 风干,用50μｌＴＥ缓冲液溶解,存于-20℃备用。
2)RNA提取
与DNA提取相比，RNA提取的最大特 点是由于细胞中RNase非常稳定，能降 解RNA，必须采取措施，抑制 RNase活 性。
2.1提取RNA主要步骤： （1）所有的玻璃器皿，都在160℃烘8小时；塑 料器皿和所有用到的水都用0.5%的DEPC处理， 37 ℃，保温2天，然后高压灭菌。 （2）操作时戴一次性手套，并勤换，戴口罩。 （3）取植物样品时，迅速用液氮冷冻，放-70 ℃保存。 （4）将植物组织彻底磨碎。 （5）使蛋白变性，以便使蛋白和核酸分离开来， 所用试剂既能抑制Rnase活性，又能使蛋白变性。 （6）将RNA与DNA和蛋白质分离出来。
例1、CTAB法小量制备植物DNA
以小麦为例： CTAB缓冲液： 1.4M 山梨醇 10ml 1M Tris_Cl PH8.0 22ml 0.5M EDTA PH8.0 4.4ml CTAB 0.8ml N-LSC 1g 加水至100ml (1)取少许小麦叶片,放入1.5ml离心管中,加入液氮冷 冻,用带尖的玻璃棒研碎。 (2)加入500ul,65℃预热的缓冲液混匀,65 ℃水浴保温 20分钟。 （3）加入500ul氯仿-异戊醇（24：1），混匀。
1）去除酚类：
含有酚类杂质的 DNA 其沉淀物多呈黄色至褐色，难以溶 解或溶液色深。
抽提缓冲液中要加入一定量的
A：防止酚类氧化的试剂： 如β-巯基 乙醇、抗坏血酸、半 胱氨酸、亚硫酸钠、二硫苏糖醇。
B：与酚类结合的物质如PVP (聚乙烯吡咯烷酮)。
2）去除多糖： 如果材料中含有较多多糖，一般提取方法将很难去除。多 糖常与 DNA 共 沉淀 而使沉淀物呈胶冻状。 A：将简易提取法所得DNA溶于TE缓冲液中后(DNA的充 分溶解对于有效去除多糖和次生代谢杂质极为重要)，加入 适量4 mol/L NaCl，使溶液中NaCl 的终浓度达到1.0～2.5 mol/L， 然后再次用-20℃无水乙醇将DNA沉淀出来，经洗 涤风干后，溶于TE中。 B： 使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅 速混匀，多糖会先沉淀。 C：沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。 a)高盐法：如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。 b)PEG(聚乙二醇，WT 8 000)代替乙醇沉淀 DNA： D：选择幼嫩组织。
物就会沉淀，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。
当材料中多糖少时，可不用 1% CTAB 沉淀缓冲液来
沉淀 DNA，在经氯仿-异戊醇(24∶1)抽 提之后，用 异丙醇或乙醇沉淀 DNA，使提取过程简化 用异丙醇或乙醇沉淀核酸，CTAB则溶于乙醇中。 CTAB法获得的核酸质量好，完整20-40kb，RNA少。
缺点：操作复杂，成本高, 需要标记探针。
2）RAPD 标记
随机引物PCR标记。 模板DNA扩增区段上引物结合位点碱基发生突 变或扩增片段之间发生插入突变或缺失突变， 因此表现为扩增产物的有无或片段的大小的 差异。 RAPD通常是显性的——片段的有无。 有时为共显性——片段的大小的差异。 RAPD所用引物通常为9—10个碱基，因此， PCR要用较低的退火温度（36℃ ）。
第三节：分子标记
1、几种主要分子标记简介
2、植物核酸的提取
3、PCR技术 4、Southern杂交技术
1、几种主要分子标记简介
1）RFLP标记
RFLP标记基于Southern杂交技术。
限制性片段长度多态性。
这种多态性是由于限制性内切酶酶切位
点或位点间DNA区段发生突变引起的。
基因组酶切后，产生连续的大小不一的酶切片 段，电泳不能直接辨别某一片段大小的变化。 利用某一基因组DNA片段或某一cDNA片段克 隆为探针，通过Southern杂交进行检测。 优点：共显性，重复性和稳定性好。
附1：棉花DNA提取
ＤＮＡ研磨缓冲液: 0.1ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ 5ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ 0.35ｍｏｌ/Ｌ葡萄糖 2%ＰＶＰ400（聚乙烯吡咯烷酮 ） 1%ＤＩＥＣＡ 0.1%Ｖｃ 0.2%β -巯基乙醇 ｄｄＨ2Ｏ
细胞核裂解缓冲液: 2%ＣＴＡＢ ; 1ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣ; ｌ0ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ ; 4ｍｏｌ/ＬＮａＣ; ｌ%ＰＶＰ40; 1%ＤＩＥＣＡ ; 1%Ｖｃ; 2%β -巯基乙醇; ｄＨ2Ｏ
防止材料融化。
（2）研碎，粉面状。影响产量的关键。 （3）氯仿-异戊醇（24：1）抽提时，摇晃一定要轻，减少 DNA断裂。 （4）CTAB法离心时，温度不能低于15 ℃，否则，CTAB沉淀， 损失DNA。
（5）溶解DNA时，避免用枪吸上吸下。
（6）避免反复冻融。 （7）棉花等酚类、多糖物质多的植物DNA提取时，缓冲液和 分离步骤应有相应的变化。
优点：1)引物已经商品化，覆盖整个基因 组，多态性高， 2)DNA量要求少，质量要求不高， 操作简单。 缺点： 1)通常为显性，无法区分显性纯合 体和杂合体。 2)引物较短，PCR结果不稳定。
3)SSR标记
SSR是特异引物的PCR标记。称为微卫星或简单重复序列。 重复单元为几个核苷酸，重复次数一般为10-50个。 由于基本单元的重复次数不同而形成SSR座位的多态性。 根据SSR座位两侧序列设计一对特异引物来扩增SSR序列。 经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的迁移距离，就可 知某个SSR座位上的多态性。
2.2 RNA电泳检测
电泳检测RNA的完整性 可采用变性胶或非变性胶检测.
非变性胶浓度要高1.2-1.4%，电压适当增加,快速结束, 可检测RNA的降解程度。
变性胶中RNA分子量才与泳动速度成正比，因此，变性 胶既能检测RNA的降解程度，又可检测大小。 例2 RNA变性胶电泳
优点：多态性十分丰富，共显性。
缺点：引物设计比较困难。Hale Waihona Puke Baidu
4）AFLP标记
AFLP是基于限制性酶切和PCR的DNA标 记。 将样品DNA用限制内切酶进行酶切，再 对酶切片段进行有选择地扩增，检测其 多态性。
首先用两种能产生粘性末端的限制性内切酶将基
因组DNA切割成分子量大小不等的限制性片段，然 后将这些片段和与其末端互补的已知序列的接头连 接，所形成的带有接头的特异片段用作随后的PCR 反应膜板。 PCR引物5´端与酶切位点序列互补，3 ´端在酶切 位点后增加1-3个选择性碱基，使得一定比例的酶切 片段被选择地扩增，PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳来分辨。
（4）15000转/分，离心5分钟。 （5）吸上清到一新的离心管中，加0.6 倍体积异丙醇,混匀,放置2-3分 钟,15000转/分离心5分钟. (6)70%的酒精洗涤一次. (8)干燥,加50ul TE缓冲液溶解DNA,也可 用水溶解。
1.2 SDS法 是阳离子去污剂。 用含有高浓度 SDS 的抽提缓冲液在 65 ℃ 对植物细胞进行裂解后，
用提高盐浓度(KAc)和降 低温度(冰上 保温)的办法沉淀除去蛋白和多糖， 剩下的 DNA 再进一步纯化。
例2、 SDS法大量制备植物DNA（水稻）
SDS-DNA提取缓冲液： 100mM Tris-Cl pH8.5 500mM NaCl 50mM EDTA Ph8.0 1.5% SDS (1)取5g左右水稻叶片，剪成2cm左右，放入研钵中，加 入液氮冷冻，研磨至细粉状。 （2）将粉末导入50ml离心管中，加入10ml 65 ℃预热 的缓冲液，在65 ℃水浴中保温20分钟左右。中间混 样2-3次。 （3）离心管中加入5ml 5M KAC混匀，冰浴20分钟。 （4）加入10ml氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀5分 钟，4000转/分离心10分钟。
6）SNP标记
基于单核苷酸多态性的DNA标记 鉴定SNP最直接的方法是通过设计特异PCR引物扩增
某个特定区域的DNA片段，通过测序和遗传特征的
比较来鉴定该DNA片段是否可以作为SNP标记。
SNP在基因组中广泛存在，数量丰富。
2、植物核酸的提取
基本步骤： 磨样——缓冲液浸提——抽提——沉淀核酸— —70%酒精洗——溶解核酸
(1)
取2ｇ新鲜幼嫩的叶片放入研钵中,加入液氮后快速、 充分研磨,待成极细的粉末状时迅速转入到50ｍｌ 离心管中。 在50ｍｌ离心管中加入10ｍｌ冰预冷的研磨缓冲 液,在涡悬振荡器上充分混匀。 于4℃,2700×ｇ离心20分钟,倒去上清液。 在沉淀中加入5ｍｌ裂解缓冲液,在涡旋振荡器上充 分混匀。 于65℃水浴锅中温育30ｍｉｎ。 加入5ｍｌ氯仿/异戊醇(24/1),并上下翻转以充分混 合。 于4℃,2700×ｇ离心5分钟。 转移上层水相至一新的50ｍｌ离心管中。 重复步骤7-9一次。
例1：酸性异硫氰酸胍－苯酚－氯仿抽提法
(Wadsworth et al.,1988) （1）取一定量植物材料于液氮中研碎， （ 2 ） 置 于 3ml 异硫氰 酸胍提取 液 (4M 异 硫氰酸胍 ， 0.1M巯基乙醇, 0.5%十二烷基肌氨酸钠 , 25mM柠檬 酸钠PH7.0)中，混匀。 （ 3 ）依次加入 0.3ml 2M NaAc （ PH 4.0) 、 3ml 酸性苯 酚和1ml氯仿/异戊醇,混匀。 （4）4 ℃，12000转/分，离心20分。 （5）用苯酚/氯仿/异戊醇再抽提一次。 （6）上清用等体积的异丙醇沉淀。 （7）将沉淀用70%乙醇洗涤一次。稍晾干。 （8）总RNA溶于无核酸酶的水中，于-70C保存。