3.荧光探针

The cell cycle is an ordered series of events leading to the replication of cells
G0-G1 S # of Events
G2-M
Fluorescence Intensity
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30
化学荧光探针
膜电位探针
快响应探针： 响应时间短于1ms；变化幅度：2％～10％/ 100mV；监测动 作电位传播过程中发生的快速变化 慢响应探针: 反应速度较慢，为1～20s；变化幅度:1～2%/ 1mV
化学荧光探针
内质网和线粒体同染
21 ER-Tracker Blue-White DPX (E-12353) MitoTracker Red CM-H2XRos (M-7513)
化学荧光探针
高尔基器
高尔基器将由粗 面内质网运来的 蛋白质类物质进 行加工、浓缩、 储存、运输，最 后形成分泌泡排 出体外。
荧光探针
朱
1
2
内容提要
• 探针的分类 • 探针的应用 • 探针的选择
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动 物 细 胞 结 构 示 意 图
4
荧光探针的分类
按照荧光探针制作方式
化学荧光探针: 化学方法合成的 基因荧光探针: 可遗传、由DNA编码、蛋白质组成的
按照荧光探针功能来分
…….
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基因荧光探针
荧光基因探针
绿色荧光蛋白 Green Fluorescence Protein 最 早 ， 绿 色 荧 光 蛋 白 （ GFP ） 是 由 Shimomura等人在研究水母发光蛋白 时发现的，水母发光蛋白是从水母 Aequorea中得到的一种有生物活性发 光蛋白质。
46
47 Microtubules were labeled with mouse monoclonal anti– -tubulin antibody, biotin-XX goat anti–mouse IgG (H+L) antibody (B-2770) and Cascade Blue NeutrAvidin (A-2663).
凋 亡
细胞皱缩、凋亡小体 保持完整性 致 密 、 浓 缩 、 染色 质聚 边 被非随机切成180bp片段 完整，无崩解 形 成 凋 亡 小 体 被邻 近细 胞 吞 噬 ， 不 引 起炎 症反 生理或非生理性刺激 应 数小时 涉及酶激活及酶促反应 新蛋白的合成与表达 能量依赖性 通 常 只 影 响 散 在单 个细 胞，组织结构不被破坏 溶解
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化学荧光探针
溶酶体和线粒体同染
19 LysoTracker Red DND-99 (L-7528) MitoTracker Green FM (M-7514)
化学荧光探针
内质网
粗面内质网和滑面内质网 主要功能： 蛋白质的合成、加工、修饰和转运， 脂类合成，糖类代谢，解毒作用。
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ER-Tracker Blue-White DPX (E-12353)
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化学荧光探针
笼锁化合物探针
笼锁化合物全称为光不稳定笼锁化合物，是人工使用掩蔽基团 修饰生物活性分子而合成的无荧光前体化合物。 当该物质被强光照射后，两基团之间的共价键解离而释放出活 性分子，这个过程称为解笼锁。 由于光化学反应的速度快，生物分子不需要经过弥散过程就可 以在光解部位发挥作用；当与激光共焦扫描显微镜联用时，就 可以达到极高的时空分辨率（时间上可达毫秒级，空间上可达 到微米甚至更低）；加上光解过程的强度、时间和范围均可控 制，生物活性物质的释放极易调节，从而为研究生理过程提供 了一个强有力的工具。
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化学荧光探针
线粒体
是负责有氧代谢的细胞器。 线粒体的丰度随细胞类型、代谢水 平、细胞所处状态的不同而有所差 异 用于标记线粒体活性、定位和丰 度，监测药理学试剂的药效
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MitoTracker Red CMXRos (M-7512)
化学荧光探针
溶酶体
是一种由单层膜包被的小体，内 含各种糖苷酶、酸性磷酸酶、弹 性蛋白酶、羧肽酶、蛋白酶、组 织蛋白酶及多种蛋白酶。 大都是利用荧光底物标记水解酶 的活性和pH变化来标记的。
RH 414 (T-1111) DM-BODIPY dihydropyridine (D-7443) Right: ratio of the middle image divided by 31 the left image
化学荧光探针
慢 响 应 探 针
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化学荧光探针
钙离子探针
定性探针：由单波长激光激发，通过荧光 变化直接测量细胞内钙离子动态变化 定量探针：是双波长激发探针，利用双波 长激发和比率技术，来定量测定 这些探针本生不能透过细胞膜，因而需要 使用其AM形式。
突变和光谱变化
根据荧光基团组成： 野生型、酚阴离子型(GFPS65T)、中性酚型(Sapphire)、 YFP、CFP、BFP、苯基型 颜色： 蓝色BFP、青蓝色CFP、绿色 GFP、黄色YFP
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基因荧光探针
（引自Cubitt,A.B.,1999）
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按荧光探针功能分类
• 细胞活性探针 • 细胞器探针 • Ph值探针 • 免疫荧光探针 • ……
DNA was stained with 7-aminoactinomycin D (A-1310), and microtubules were labeled with anti– -tubulin antibodies in conjunction with fluorescein-labeled secondary antibody
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化学荧光探针
活性氧探针
胞内活性氧影响细胞代谢 应用：毒理学 常用荧光探针有H2DCFDA ，荧 光强度与活性氧的浓度呈线性关 系。
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化学荧光探针
免疫荧光探针
免疫荧光细胞组织化学是现代生物学中广 泛应用的技术之一。 特异性和敏性感。 FITC类：易光漂白，对pH值的变化较敏 感； Bodipy类：光稳定性好，发射带窄，易于 多重标记，pH稳定性好。
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化学荧光探针
光解反应 激发光的强度和波长 消光系数和量子产率 激发态中间产物的寿命 光化学反应： 偶氮苯的光致同分异构作用 硝基甲苯的光致分解作用 根据生物活性分子的不同来分类：笼锁神 经递质、调质及配体；笼锁胞内第二信 使；笼锁钙；笼锁发光基团、笼锁酶。 应用：肌肉生理、递质释放、钙振荡、微 41 管和微丝动力学
Green-fluorescent BODIPY FL C5-ceramide localized to the Golgi apparatus Red-fluorescent LysoTracker Red stain accumulated in the lysosomes 22 Blue-fluorescent Hoechst 33258 dye stained the nuclei.
48 anti–bovine -tubulin, mouse monoclonal 136-10501, biotin-XX conjugate (A-21371) and Alexa Fluor 568 streptavidin (S-11226)
Texas Red-X phalloidin (T-7471), which labels F-actin, 49 mouse monoclonal anti– -tubulin IgG and fluorescein goat anti–mouse IgG (F-2761), which label microtubules
细胞骨架
细胞形态支撑与形态建成 细胞内的转运或运动 膜相差的性质和功能 吞噬作用 细胞运动
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化学荧光探针
膜荧光探针
细胞膜基本成分：磷脂、 脂肪酸和固醇， 膜探针：非极性探针、两 性探针、膜流动性探针、 荧光标记的磷脂、脂肪酸 和固醇探针。 用途：测量膜的扩散、监 测病毒－细胞的融合、观 察膜流动性和研究膜表面 的分子组成。
坏 死
丧失完整性 不规则碎裂，溶解 无规则断裂 肿胀，崩解 细胞崩解，引起炎症 反应 非生理性刺激 无 不激活 无 无 涉及多个细胞，组织 14 结构被破坏
化学荧光探针
细胞器探针
细胞器探针：与细胞器选择 性结合的荧光染料。 主要用途：研究胞内的氧化 作用、有丝分裂、底物降解 作用、解毒反应、细胞间的 转运和细胞分拣等。
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SYTOX Blue nucleic acid stain (S-11348)
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SYTO Live-Cell Nucleic Acid Stain Sampler Kit #1 (S-7572)
The chromosomes were stained with DAPI (D-1306). The cytoskeleton was detected with anti– 45 bovine -tubulin, mouse monoclonal 236-10501, biotin-XX conjugate (A-21371), which was then visualized with red-fluorescent Alexa Fluor 568 streptavidin (S-11226)
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化学荧光探针
细胞活性探针
• 标记活细胞；酯酶底物探针、过 氧化物酶底物探针和离子泵活性 指示探针 • 识别死细胞：死细胞探针有膜不 透性DNA探针和丹磺酰赖氨酸。 • 优点：灵敏，安全。 • 其他方法：比色法、同位素示踪 法。
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正 常
形态特征 胞膜 细胞核 DNA 细胞器 结局 诱发因素 潜伏期 酶 蛋白合成 能量消耗 与其它细 胞关系 形态正常 保持完整性 均匀，疏松 完整，无断裂 完整，无崩解 正常 无刺激
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基因荧光探针
绿色荧光蛋白的生物化学特征
238个氨基酸组成。 吸收峰395nm 发射波长508nm 稳定性：65℃、pH11、 1%SDS、6mol/L盐酸 胍，或蛋白酶处理几小 时，仍然保持荧光活性。
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基因荧光探针
绿色荧光蛋白的发光机制
成环反应
A
氧化
8
源自文库
基因荧光探针
光异构化和光漂白
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基因荧光探针
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DiIC18(3) (DiI; D-282, D-3911)
化学荧光探针
细胞膜的流动性
主要方式：侧向扩散、旋转、伸缩 振动、翻转、摆动等。 侧向扩散的测量:荧光光漂白恢复 (FRAP) 旋转扩散的测量: 荧光偏振法
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Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)
POPO-1 (P-3580), BOBO-1 (B-3582), YOYO-1 (Y-3601), TOTO-1 (T-3600), JOJO-1 (J-11372), POPO-3 (P-3582), LOLO-1 (L-11376), BOBO-3 (B-3586), YOYO-3 (Y-3606) TOTO-3 (T-3604)
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化学荧光探针
核酸探针
核酸是细胞生长、分化、 遗传的重要物质 用途：测定DNA和RNA的 形态和含量；研究细胞周 期和肿瘤的诊断、治疗和 预防
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YOYO-1 (Y-3601)
化学荧光探针
人嗜中性粒细胞核染色
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SYTO 13 live-cell nucleic acid stain (S-7575)
17 LysoTracker Yellow HCK-123 (L-12491) LysoTracker Red DND-99 (L-7528)
化学荧光探针
Responsible for degrading
certain cell components material internalized from the extracellular environment
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化学荧光探针
Fluo3
可见光激发： Ex：490nm， Em：525nm； 荧光变化最大： 增强50－250倍， 对pH、Mg2＋等 相对不敏感；
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化学荧光探针
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化学荧光探针
海星卵受精诱导的钙波（5s）
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Calcium Green-1 (C-3713)
化学荧光探针
pH探针
正常的情况下，胞浆为pH6.8～7.4， 溶酶体为pH4.5～6.0 胞内pH的影响：细胞代谢、细胞间通 讯 pH探针分为中性和偏酸性，均为疏水 性探针 中性探针：需使用其AM形式 偏酸性探针：细胞胞饮作用进入溶酶 体