3.荧光探针
检测汞离子的荧光探针及其制备方法与使用方法[发明专利]
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专利名称：检测汞离子的荧光探针及其制备方法与使用方法专利类型：发明专利
发明人：韩益丰,陈舒欣,秦思瑶,章世深,汪玲
申请号：CN201910802152.6
申请日：20190828
公开号：CN110487761A
公开日：
20191122
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了检测汞离子的荧光探针及其制备方法与使用方法。
本发明利用氧杂蒽与苯炔构筑具有双光子发射的新型荧光体系，并在meso‑位螺环处直接引入汞离子设别部分，使其能对汞离子进行特异性响应。
探针本身共轭体系由于meso‑位硫代氨基脲的存在而被破坏，无荧光发射。
但当存在汞离子的条件下，由于汞离子促进的分子内脱硫环化反应，使得meso‑位螺环打开，探针分子发射出强的红色荧光。
本发明提供的氧杂蒽与苯炔构筑具有双光子性质的“开‑关”型汞离子探针对汞离子溶液具有良好的响应，能够实现对样品内微量汞离子的灵敏定量检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
申请人：浙江理工大学
地址：310018 浙江省杭州市下沙高教园区2号大街928号
国籍：CN
代理机构：杭州君度专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：杨舟涛
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DiI (细胞膜红色荧光探针)说明书
DiI (细胞膜红色荧光探针)产品编号 产品名称包装 C1036DiI (细胞膜红色荧光探针)10mg产品简介：DiI 即DiIC 18(3)，全称为1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate ，是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光。
DiI 是一种亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。
DiI 在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。
DiI 被激发后可以发出橙红色的荧光，DiI 和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱参考下图。
其中，最大激发波长为549nm ，最大发射波长为565nm 。
DiI 的分子式为C 59H 97ClN 2O 4，分子量为933.88，CAS number 为41085-99-8。
DiI 可以溶解于无水乙醇、DMSO 和DMF ，其中在DMSO 中的溶解度大于10mg/ml 。
发现较难溶解时可以适当加热，并用超声处理以促进溶解。
DiI 被广泛用于正向或逆向的，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂(long-term tracer)。
DiI 通常不会影响细胞的生存力(viability)。
被DiI 标记的神经细胞在体外培养的条件下可以存活长达4周，在体内可以长达一年。
DiI 在经过固定的神经元细胞膜上的迁移速率为0.2-0.6mm/day ，在活的神经元细胞膜上的的迁移速率为6mm/day 。
DiI 除了最简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移，通过FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)检测脂在细胞膜上的扩散，检测细胞毒性和标记脂蛋白等。
用于细胞膜荧光标记时，DiI 的常用浓度为1-25µM ，最常用的浓度为5-10µM 。
盐酸黄连素的制备与应用研究进展
第52卷第9期 辽 宁 化 工 Vol.52，No. 9 2023年9月 Liaoning Chemical Industry September，2023基金项目：辽宁省应用基础研究计划（项目编号：2022JH2/101300113）。
收稿日期：2023-02-20盐酸黄连素的制备与应用研究进展孙振华1，王国胜2*（1. 中国中药控股有限公司, 广东 佛山 528300； 2. 沈阳化工大学 化学工程学院，辽宁 沈阳 110142）摘 要：介绍了盐酸黄连素的制取技术，包括天然产物提取技术和化学合成技术；介绍了盐酸黄连素的药理作用、染色性能、荧光探针、传感器与电极、衍生物以及纳米给药技术等方面的研究进展；对化学合成方法的改进、盐酸黄连素中有关物质的确证以及结构特征与应用领域的开发提出了有益的建议。
关 键 词：盐酸黄连素；制取技术；有关物质；应用领域中图分类号：TQ463 文献标识码： A 文章编号： 1004-0935（2023）09-1337-07盐酸黄连素( berberine) ，又名盐酸小檗碱，是黄色的针状结晶，分子式（不含结晶水）为 C 20H 18ClNO 4，分子量371.8，熔点145 ℃，工业品含有 2~5个分子结晶水，可溶于热水、乙醇，难溶于乙醚、苯。
常态下为淡黄色粉末，加热失水后为土黄色。
盐酸盐难溶于水，但易溶于热水，而硫酸盐则易溶于水。
黄连素是一种季铵型异喹啉类生物碱，且其具有氮三角的化学结构。
黄连素是小檗属植物中提取的一种黄色提取物，最早是在1830 年由 Buchner 与 Herberger 发现的[1]。
在 19 世纪 20 年代黄连素也被命名为牙买加菜树苦素和花椒树脂。
而黄连入药在我国有着悠久的历史，早在《神农本草经》一书中便有收录，长期以来，中国将其用来抗菌、消炎、止泻等。
目前，发现其它中药材如黄柏、关黄柏、古山龙、三颗针、功劳木、白屈菜、伏牛花、南天竹、金印草、俄勒冈山葡萄、黄藤和树姜黄等数十种植物中也含有黄连素。
细胞活力研究检测指标
细胞活力研究检测指标细胞活力研究通常涉及多种检测指标，以评估细胞的生理状态、代谢活性和功能。
以下是一些常见的检测指标：1. 细胞增殖能力：1)MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）试验：通过测量活细胞中线粒体脱氢酶的活性来评估细胞增殖。
2)CCK-8（Cell Counting Kit-8）试验：类似于MTT，但使用水溶性四唑盐WST-8，减少了实验步骤。
3)BrdU（5-溴脱氧尿苷）掺入试验：通过检测BrdU在DNA合成期的掺入来评估细胞增殖。
2. 细胞存活率：1)细胞计数：直接使用血球计数板或自动细胞计数器计算活细胞数量。
2)台盼蓝染色：排除法，活细胞不会吸收台盼蓝，死细胞会被染成蓝色。
3. 细胞凋亡检测：1)Annexin V/PI染色：通过流式细胞仪检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜完整性来识别早期和晚期凋亡细胞。
2)TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记）试验：检测DNA断裂，是细胞凋亡的标志。
4. 细胞周期分析：流式细胞仪：使用PI或Hoechst染料对DNA进行染色，分析细胞周期分布。
5. 细胞代谢活性：1)ATP含量测定：ATP是细胞能量代谢的重要指标。
2)乳酸脱氢酶（LDH）释放：衡量细胞膜完整性和细胞损伤程度。
6. 氧化应激指标：1)ROS（活性氧物种）检测：使用荧光探针如DCFH-DA进行检测。
2)抗氧化酶活性：如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
7. 蛋白质和基因表达：1)Western blot：检测特定蛋白质的表达水平。
2)qPCR（实时定量聚合酶链反应）：检测特定基因的mRNA表达水平。
8. 细胞信号通路活性：磷酸化蛋白检测：通过Western blot检测特定蛋白的磷酸化状态来评估信号通路的激活。
9. 细胞粘附和迁移能力：1)划痕试验：评估细胞迁移能力。
2)侵袭和迁移试验：使用Transwell小室评估细胞的侵袭和迁移能力。
荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（Fluorescence in Situ Hybridization，FISH）是一种分子生物学技术，用于研究染色体结构和功能、基因组描绘、肿瘤和遗传性疾病诊断及治疗等领域。
其原理是利用荧光探针与目标DNA碱基序列互补配对，使染色体或基因区域成为荧光标记物，从而实现对核酸序列的直接可视化和定量分析的一种分子探针技术。
1. FISH技术的发展历程FISH技术首次应用于分子遗传学研究可以追溯到20世纪70年代。
最初的技术主要是通过蛋白质标记方法，如辣根过氧化酶结合（HRP）和碱性磷酸酶结合等，来识别DNA序列。
然而这种方法往往存在较大的检测误差和信号弱等问题。
随着荧光染料和显微镜方法的发展，荧光成为FISH技术中的关键技术。
荧光标记FISH（Fluorescence-Labeled FISH，Fl-FISH）技术逐渐取代了传统的蛋白质标记方法，成为目前FISH技术的主流。
2. FISH技术的原理FISH技术的主要原理是利用荧光探针或荧光标记分子与特定的目标DNA序列互补配对，使其可视化。
荧光探针主要包括含有荧光染料结构域和与目标DNA碱基序列相互作用结构域的寡核苷酸或单链DNA分子。
探针长度通常在15-30bp左右，越短的探针对于特异性检测越有利。
FISH技术的操作过程一般包括以下几个步骤：（1）标本制备，如组织切片、细胞准备等。
（2）脱氧核糖核酸（DNA）变性，使之成为单链状态，以方便荧光探针与目标DNA碱基序列的互补配对。
（3）探针杂交，将荧光标记探针与目标DNA碱基序列杂交，或者将探针标记在载体DNA上，通过载体DNA与目标DNA 互补配对实现探针的标记。
（4）洗涤，去除杂交与未杂交的探针，防止假阳性结果的产生。
（5）荧光染色，使探针与目标DNA形成的复合物发生荧光信号，从而能够通过荧光显微镜观察到。
3. FISH技术的应用（1）研究染色体和基因组的结构和功能，如染色体结构异常、基因扩增和缺失等病理变化的检测和评价。
浙江省丽水、衢州、湖州三地市2024年高三第一次调研测试生物试卷含解析
浙江省丽水、衢州、湖州三地市2024年高三第一次调研测试生物试卷注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、准考证号填写在答题卡上。
2．回答选择题时，选出每小题答案后，用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑，如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其它答案标号。
回答非选择题时，将答案写在答题卡上，写在本试卷上无效。
3．考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题(本大题共7小题,每小题6分,共42分。
)1．在真核细胞中，生物膜系统的存在对细胞的生命活动有重要作用，下列关于生物膜系统的说法错误的是（）A．生物膜系统创造细胞微环境，利于提高新陈代谢效率B．核膜的存在使得蛋白质的合成速率变慢C．细胞中所有生物膜的组成成分和基本结构相同D．高尔基体边缘膨大脱落的小泡可以成为溶酶体2．不定根的形成是植物发育生物学备受关注的问题，国内某团队研究不同浓度IAA对大豆下胚轴插条不定根形成的影响。
实验材料为大豆品种主茎型和分枝型的下胚轴插条，实验处理是下胚轴插条浸在相应浓度IAA溶液24小时后用清水冲洗下胚轴，8天后测得不定根数目如下表：根据实验结果分析，下列有关叙述错误的是（）A．IAA浓度对两个品种插条不定根形成均具有两重性B．在IAA浓度为300μlmol·L-1条件下，分枝型插条可能部分死亡C．随着IAA浓度的增加，两个品种形成不定根数量均先增加后减少D．IAA对不同品种的处理效果差异明显的原因可能是遗传物质不同3．一种角蝉幼虫和蚂蚁长期栖息在一种灌木上，角蝉幼虫分泌的含糖分泌物是蚂蚁的食物，同时蚂蚁也保护角蝉幼虫不被跳蛛捕食。
科学家随机选取样地中一半灌木，将上面的蚂蚁捕净，另一半灌木不做处理，统计角蝉幼虫数量变化，结果如下图，以下分析正确的是（）A．题中食物链是灌木→角蝉→蚂蚁→跳蛛B．角蝉幼虫和蚂蚁的种间关系是互利共生C．蚂蚁所摄取的能量直接来源于灌木D．有蚂蚁时角蝉幼虫数量将持续增加4．下列与进化有关的叙述，正确的是（）A．一片树林中的黑色桦尺蠖和灰色桦尺蠖是由一个物种进化成的两个种B．人们用农药处理作物上的害虫，经过该人工选择，害虫种群中抗性基因的频率增加C．抗青霉素的突变型细菌不可能是染色体畸变的结果D．在某个很大的种群中，AA的基因型频率等于A频率的平方5．化疗药物长春碱能够与微管蛋白结合阻碍纺锤体形成，从而抑制癌细胞增殖。
Fluo-3 AM_钙离子荧光探针_
Fluo-3 AM (钙离子荧光探针)产品简介：Fluo-3 AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。
分子式为C51H50Cl2N2O23，分子量为1129.85。
Fluo-3和Fura-2相比，其优点是：一方面可以被氩离子激光(argon-ion laser)的488nm激发光激发，便于检测；另一方面，Fluo-3和钙离子结合后荧光变化更强，即对钙离子浓度变化的检测更加灵敏；同时，Fluo-3和钙离子的结合能力较弱，这样可以比Fura-2检测到细胞内更高浓度的钙离子水平；此外，对于细胞内的钙离子的即时变化反应得更加准确，减小了因为和钙离子解离速度慢而导致的荧光变化滞后。
本Fluo-3 AM (钙离子荧光探针) 是配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中的储存液，浓度为5mM。
Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。
Fluo-3 AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。
Fluo-3 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。
Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。
实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525-530nm。
Fluo-3的激发光谱和发射光谱参考下图。
用于细胞内钙离子检测时，Fluo-3 AM的常用浓度为0.5-5μM。
通常用含有0.5-5μM的Fluo-3 AM的适当溶液和细胞一起在20-37℃孵育15-60分钟进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。
保存条件：-20℃避光保存，6个月有效。
注意事项：本Fluo-3 AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
PCR技术培训教材(外传新人学习版本)
二、PCR 反应五要素 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+。 （一） 引物
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培训教材（201103）
（1）PCR 所扩增的靶序列在基因组中的位置和长度是由引物限定的，引物的特异性对扩增产物起 决定作用。引物长度以 18—30bp 为宜，常用为 20bp 左右。 （2）引物扩增跨度（扩增片段长短） ：扩增片段在普通 PCR 以 200—500bp 为宜，而实时荧光 PCR 则为 50—150bp。 （3）引物内部的二级结构：引物内部应避免出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3’端的 互补。 （4）引物的 G+C 比例及碱基：G+C 含量以 40%-60%为宜，G+C 比例太低扩增效果不佳，G+C 比 例太高易出现非特异条带。 （5）引物的 Tm 值：理想的引物的 Tm 值应在 55-60℃。引物对之间的 Tm 值差异不应超过 2-3℃. 引物的 Tm 值计算可按以下公式计算：Tm=2(A+T)+4(G+C) (6) 引物量： 引物浓度过高则导致错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 （7）引物的 3’端碱基：引物的 3’端碱基尤其是最末及倒数第二个碱基，应严格配对。末端碱基 不配对易导致 PCR 失败。在引物的 3’端碱基，最好为 G 或 C。 （二）酶 用于 PCR 的耐热 DNA 聚合酶可分两类，一类为从水生嗜热菌中纯化的 TaqDNA 聚合酶，一类为 通过基因工程在大肠杆菌中表达的酶。酶的浓度过高可导致非特异性扩增，过低则导致扩增效率低， 产物量减少。 （三）dNTP 四种碱基的浓度应相等，任何一种碱基的浓度偏高或偏低都会引起错配。碱基的浓度过低则会降 低 PCR 产物的产量，过高则因为 dNTP 能于镁离子结合，使游离的镁离子降低，从而影响 TaqDNA 酶 的活性。 （四）模板 模板核酸的量与纯度也是 PCR 成败的关键环节。模板中若含有 PCR 反应的抑制物，如血红蛋白、 粘蛋白、重金属离子、肝素等，则会抑制 PCR 扩增。同时，模板核酸的量也不易过高，过高也会抑制 PCR 扩增。 （五）Mg2+ Mg2+是 TaqDNA 聚合酶的不可少的辅助因子。Mg2+浓度过高则易出现非特异性扩增，过低则降低 酶的活性，使反应产物减少。一般在 1.5-3.0mmol/L 范围内。 三、PCR 反应特点 特异性强： PCR 反应的特异性决定因素为： ①引物与模板 DNA 特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关
3.荧光探针
DNA was stained with 7-aminoactinomycin D (A-1310), and microtubules were labeled with anti– -tubulin antibodies in conjunction with fluorescein-labeled secondary antibody
化学荧光探针
笼锁化合物探针
笼锁化合物全称为光不稳定笼锁化合物，是人工使用 掩蔽基团修饰生物活性分子而合成的无荧光前体化合 物。当该物质被强光照射后，两基团之间的共价键解 离而释放出活性分子，这个过程称为解笼锁。由于光 化学反应的速度快，生物分子不需要经过弥散过程就 可以在光解部位发挥作用；当与激光共焦扫描显微镜 联用时，就可以达到极高的时空分辨率（时间上可达 毫秒级，空间上可达到微米甚至更低）；加上光解过 程的强度、时间和范围均可控制，生物活性物质的释 放极易调节，从而为研究生理过程提供了一个强有力 的工具。
华中科技大学生物医学光子学研究所 Instituted for Biomedical Photonics, HUST
动 物 细 胞 结 构 示 意 图
荧光探针的分类
化学荧光探针: 化学方法合成的。 基因荧光探针: 可遗传、由DNA编 码、蛋白质组成的。
化学荧光探针
细胞活性探针
• 标记活细胞；酯酶底物探针、过氧 化物酶底物探针和离子泵活性指示 探针 • 识别死细胞：死细胞探针有膜不透 性DNA探针和丹磺酰赖氨酸。 • 优点：灵敏，安全。 • 其他方法：比色法、同位素示踪 法。
Microtubules were labeled with mouse monoclonal anti– -tubulin antibody, biotin-XX goat anti–mouse IgG (H+L) antibody (B-2770) and Cascade Blue NeutrAvidin (A-2663).
分析化学习习题十四
第十四章荧光分析法一、单项选择题（类型说明：每一道试题下面有A、B、C、D 四个备选答案，请从中选择一个最佳答案。
）1、下列哪种化学反应可以产生化学发光？（）A ．中和反应B．离子交换反应C 氧化反应D 置换反应2、分子荧光与化学发光均为第一激发态的最低振动能级跃迁至基态中各振动能量能级产生的光辐射，它们的主要区别在于（）A．分子中的电子层不同B．跃迁至基态中的振动能级不同C．产生光辐射的能源不同D．无辐射驰豫的能源不同3、受激单线态的平均寿命应为（）秒。
-8 B．10-7 C．10-6 D．1A．10受激三线态的平均寿命应为（）秒。
A．10-8 B．10-7 C．10-6 D．10-55、下列那种离子不能产生荧光？（）A．K+ B．Mg 2+ C．Al 3+ D．V(IV)6、根据下列化合物的结构，判断那种物质的荧光效率最大？（）A.苯B.联苯C.对联三苯D.蒽7、下列结构中那一种能产生荧光的强度最大？（）A.苯酚B.苯C.硝基苯D. 苯甲酸8、苯胺在下列哪个pH 值能产生荧光（苯胺以分子形式产生荧光）（）9、下列那种说法是正确的（）A.荧光物质的浓度增加，荧光强度增大。
B. 荧光物质的浓度增加，荧光强度减弱。
C. 荧光物质的浓度减弱，荧光强度减弱。
D. 荧光物质的浓度减弱，荧光强度减弱。
10、下列说法那种是正确的（）A.溶液温度升高，荧光效率增加，荧光强度增大。
B.溶液温度降低，荧光效率增加，荧光强度增大。
C.溶液温度升高，荧光效率降低，荧光强度增大。
D.溶液温度降低，荧光效率降低，荧光强度增大。
11、下列那种基团能使单线态转让三线态（）A. NH 2B. OHC. C6 H5D. I12、下列那种溶剂对荧光的光谱干扰最小（）A.水B.乙醇C.环已烷D. 四氯化碳13、荧光光度计和分光光度计的主要区别是（）A.光源B.光路C.单色器D.检测器瑞利散射是在那种情况下产生的（）A.自发辐射B.受激辐射C.辐射能照射分子产生热运动D. 光子和物质分子发生弹性碰撞，只是光子运动方向发生了改变15、拉曼散射是在那种情况下产生的（）A.自发辐射B.受激辐射C.辐射能照射分子产生热运动D.辐射能照射分子产生非弹性碰撞，并发出光辐射。
定量PCR中ct值的含义
定量P C R中c t值的含义Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】实时荧光定量P C R 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
一. 实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-153. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2. 荧光定量标准曲线4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
实时荧光Taqman 探针设计
一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm 值。
二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。
现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。
3-荧光及荧光标记
• 原因在于，电子的能量传给氧，形成 活性氧，氧化荧光基团。
• 荧光寿命短，可以提高灵敏度。
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6 滤光片
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为什么需要滤光片
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LP 长通滤光片
SP 短通滤光片
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BP 带通滤光片
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二色性的滤光片
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分色镜----允许大于某个波长的光通 过，其他的被反射。
荷兰石竹
Beet Fleshy Root
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Emission spectra of the main sources of
autofluorescence in roots and leaves
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Figure 4
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4 间接荧光——某些物质自身不会吸收 激发光，或吸收后不能释放荧光，但 可以吸收或吸附特定的荧光色素或染 料，而这些特定的荧光色素或染料也 只能吸收特定的激发光，再释放出特 定的荧光，从而间接地鉴别出某种物 质，这称为间接荧光法。
rhodamine 123
rhodamine B, hexyl ester, perchlorate (R 6)
tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate (TMRE)
nephriticum”的木头切片的水溶液， 呈现天蓝色.。
3
• 在17世纪，Boyle（1626—1691）和 Newton（1624—1727）等著名科学 家再次观察到荧光现象，并且给予更 详细的描述。
• 尽管在17世纪和18世纪中还发现了其 它一些发荧光的材料和溶液，
• 然而在解释荧光现象方面却几乎没有 什么进展。
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稀土元素在荧光探针中的应用
稀土元素在荧光探针中的应用稀土元素是近年来备受重视的一类元素，它们不仅在冶金、电子、石油等工业领域有着广泛的应用，而且在化学生物学和生物医学领域也有着重要的作用。
其中，稀土元素在荧光探针中的应用备受关注，未来有望成为生物医学和化学生物学研究的重点领域之一。
一、稀土元素荧光探针的优点稀土元素在荧光探针中的应用主要体现在以下几个方面：1、荧光强度高、持久时间长相比于有机荧光调控分子，稀土元素的荧光强度更高、寿命更长。
这让稀土元素荧光探针具有在低浓度下检测目标物质的能力。
2、发射波长可调稀土元素的发射波长可以通过改变稀土离子的配位环境、激发光波长、能级跃迁等方式进行调节，这让稀土元素荧光探针具有较大的适应性。
3、稀土元素具有高选择性稀土元素的化学性质稳定，它们与其他离子之间的相互作用会导致其发射峰的强度和位置的变化。
这种选择性可以通过对目标物的分析来实现。
二、稀土元素荧光探针的应用领域稀土元素荧光探针的应用领域主要有以下几个方面：1、生物体内荧光成像稀土元素荧光探针在生物体内荧光成像中具有广泛的应用。
例如，激发Eu3+离子后可以通过激发光的倍增，使其荧光强度增加10倍以上，并且长荧光寿命使它可以用于细胞内成像。
2、化学反应追踪稀土元素荧光探针具有灵敏度高、随时间变化的荧光强度的特点，因此可以应用于化学反应的跟踪。
例如，对一种荧光探针中稀土离子的浓度随时间的变化进行观察，从而得到化学物质在反应中的变化实时记录。
3、环境监测稀土元素荧光探针可以用于环境监测中。
例如，通过控制稀土离子在生物体内的位置，可以实现对水中有害物质的检测，从而实现简单、快速、准确的水质检测。
三、稀土元素荧光探针的研究领域稀土元素在荧光探针中的应用还是个相对新的领域，其研究方向主要包括以下几个方面：1、荧光强度的提高稀土元素荧光探针中的荧光强度是研究的重点之一。
目前的研究主要集中于寻找新的稀土离子，并研究离子结构和配位模式与稀土离子的荧光强度之间的关系。
定量PCR中_ct值的含义
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
一.实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´SD cycle 6-153. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2. 荧光定量标准曲线4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光探针在生命科学中的应用
荧光探针在生命科学中的应用生命科学一直是科学家们研究的热门领域，其中涉及的生命活动过程异常复杂。
为了更好地理解和研究生命活动，科学家们发明了各种各样的工具。
荧光探针便是生命科学领域中其中一种非常有用的工具。
荧光探针是指具有荧光特性的化学分子。
在特定的物理或化学条件下，它们可以通过吸收外部能量并将其转化为荧光来实现分子或生物进程的定量检测和显微成像。
荧光探针的应用非常广泛，不仅可以用于实验室内的分子检测和显微成像，还可以作为医学检测中的诊断工具。
下面，我们来看一下荧光探针在生命科学中的应用。
1. 荧光探针在分子基因学的应用在分子基因学中，荧光探针可以用来检测DNA或RNA分子中的特定序列。
这种方法叫做荧光原位杂交（FISH）技术。
FISH技术能在细胞和组织水平上帮助科学家进行基因探究。
例如，它可以用来检测DNA的缺失或增加，这在许多遗传疾病的诊断中非常有用。
2. 荧光探针在细胞学的应用荧光探针在细胞学领域中也有着广泛的应用。
它可以帮助科学家们对细胞内蛋白质、RNA或DNA等生物分子进行检测。
这种技术被称为细胞荧光染色技术，其中荧光探针常常用于标记蛋白质的位置。
这样，科学家们可以观察它们在不同时间点和不同的细胞环境中的变化，为对细胞活动的研究提供有力的支持。
3. 荧光探针在蛋白质学的应用荧光探针也可以用于研究蛋白质的结构和函数。
在蛋白质学领域中，荧光探针被用于检测不同的蛋白质之间的相互作用，如酶与底物之间的相互作用。
此外，荧光探针还可以作为蛋白质分子折叠状态的指示器，帮助科学家们更好地理解蛋白质的结构和功能。
4. 荧光探针在医学诊断的应用荧光探针在医学诊断中也有着广泛的应用。
例如，荧光探针可以用于快速检测病原体，如流感病毒、乙肝病毒和艾滋病病毒等，这在流行病学中非常重要。
此外，荧光探针还可以用于素材检测和癌症筛查等方面，这有效地促进了医学领域的发展。
结论荧光探针在生命科学中是一种非常有用的工具，它可以用于检测特定分子的存在和位置，帮助科学家们更好地理解生命机理。
3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物 细菌膜电位
3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物细菌膜电位3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物与细菌膜电位1. 介绍在生物化学和微生物学领域，细菌膜电位是一个十分重要的概念。
细菌膜电位是指细菌细胞膜内外两侧离子的电化学梯度所形成的电位差，对于细菌细胞的代谢活动、生长和存活起着至关重要的作用。
2. 3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物的作用3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物是一种广泛应用于生物化学实验室的荧光探针，它能够与细菌膜特定的蛋白结合，影响细胞内钾离子的流动并改变细菌膜电位。
通过与3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物的结合，可以观察和分析细菌膜电位的变化，进而研究其对细菌代谢和生长的影响。
3. 3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物在细菌膜电位研究中的应用3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物与细菌膜电位的关系一直是科学家们关注的热点。
通过荧光显微镜和其他生物物理学技术，研究人员可以观察和测量细菌膜电位的变化，揭示3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物对细菌活动的影响机制。
这些研究成果有助于更深入地理解细菌代谢调控和药物抗性机制。
4. 3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物对细菌膜电位的影响机制在研究中发现，3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物能够结合在细菌膜的蛋白质上，并改变细胞内外的离子平衡，导致细菌膜电位的变化。
这种变化可能会影响细菌细胞内的代谢通路和信号转导，进而影响其生长和存活。
3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物也可作为荧光探针，通过荧光成像技术实时监测细菌膜电位的动态变化，为相关研究提供了重要的实验手段。
5. 个人观点和总结从事生物化学和微生物学研究多年，我对3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物与细菌膜电位的相互作用深感兴趣。
这一研究领域不仅有助于深入理解细菌的代谢机制和耐药性形成的原理，还为开发新的抗菌药物和治疗策略提供了理论基础。
荧光探针简介
光诱导电子转移（PET）机理
引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,5167-5170
双光子荧光探针的优点：
1、生物分子的双光子吸收截面大都很小，故而不会产生 背景荧光，从而背景干扰很小；
2、长波激发，短波发射，故而穿透能力很强，且对生物 体的光损伤较小；
就可以观察到荧光能量由供体向受体转
移的现象，即用供体的激发波长激发时， 可观察到受体的荧光发射。
基于其它原理的荧光探针
钠离子与大环结合后限制了分子的构象异构，使分子结构具有了更好的刚 性和平面性，从而增强了荧光。
引自：J.Am.Chem.Soc.,2005,127,6956-6957
单光子荧光探针的缺点
质研发、有机合成人员和大批具备专业背景的销 售人员）。
引自：上海染料，2009，37（5），39~50
国内进行相关研究的大学和研究所（部分）
中科院（化学研究所、感光化学研究所、理化技术研究所 等等）；
高校：中南大学、兰州大学、山东大学、武汉大学、吉林 大学、南京大学、华东理工大学、大连理工大学、中山大 学、南京师范大学、山东师范大学、湖南大学等等。
O
O
H
O
N
N
(HOOCH2CH2C)2N
O
+Ca2+ -Ca2+
配体与Ca2+络合后，荧光显著增强
-OOC N
O
-OOC
O
Ca2+ O
H
N
N
-OOC N
O
-OOC
引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445
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46
47 Microtubules were labeled with mouse monoclonal anti– -tubulin antibody, biotin-XX goat anti–mouse IgG (H+L) antibody (B-2770) and Cascade Blue NeutrAvidin (A-2663).
荧光探针
朱
1
2
内容提要
• 探针的分类 • 探针的应用 • 探针的选择
3
动 物 细 胞 结 构 示 意 图
4
荧光探针的分类
按照荧光探针制作方式
化学荧光探针: 化学方法合成的 基因荧光探针: 可遗传、由DNA编码、蛋白质组成的
按照荧光探针功能来分
…….
5
基因荧光பைடு நூலகம்针
荧光基因探针
绿色荧光蛋白 Green Fluorescence Protein 最 早 ， 绿 色 荧 光 蛋 白 （ GFP ） 是 由 Shimomura等人在研究水母发光蛋白 时发现的，水母发光蛋白是从水母 Aequorea中得到的一种有生物活性发 光蛋白质。
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化学荧光探针
笼锁化合物探针
笼锁化合物全称为光不稳定笼锁化合物，是人工使用掩蔽基团 修饰生物活性分子而合成的无荧光前体化合物。 当该物质被强光照射后，两基团之间的共价键解离而释放出活 性分子，这个过程称为解笼锁。 由于光化学反应的速度快，生物分子不需要经过弥散过程就可 以在光解部位发挥作用；当与激光共焦扫描显微镜联用时，就 可以达到极高的时空分辨率（时间上可达毫秒级，空间上可达 到微米甚至更低）；加上光解过程的强度、时间和范围均可控 制，生物活性物质的释放极易调节，从而为研究生理过程提供 了一个强有力的工具。
POPO-1 (P-3580), BOBO-1 (B-3582), YOYO-1 (Y-3601), TOTO-1 (T-3600), JOJO-1 (J-11372), POPO-3 (P-3582), LOLO-1 (L-11376), BOBO-3 (B-3586), YOYO-3 (Y-3606) TOTO-3 (T-3604)
化学荧光探针
内质网和线粒体同染
21 ER-Tracker Blue-White DPX (E-12353) MitoTracker Red CM-H2XRos (M-7513)
化学荧光探针
高尔基器
高尔基器将由粗 面内质网运来的 蛋白质类物质进 行加工、浓缩、 储存、运输，最 后形成分泌泡排 出体外。
凋 亡
细胞皱缩、凋亡小体 保持完整性 致 密 、 浓 缩 、 染色 质聚 边 被非随机切成180bp片段 完整，无崩解 形 成 凋 亡 小 体 被邻 近细 胞 吞 噬 ， 不 引 起炎 症反 生理或非生理性刺激 应 数小时 涉及酶激活及酶促反应 新蛋白的合成与表达 能量依赖性 通 常 只 影 响 散 在单 个细 胞，组织结构不被破坏 溶解
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43
SYTOX Blue nucleic acid stain (S-11348)
44
SYTO Live-Cell Nucleic Acid Stain Sampler Kit #1 (S-7572)
The chromosomes were stained with DAPI (D-1306). The cytoskeleton was detected with anti– 45 bovine -tubulin, mouse monoclonal 236-10501, biotin-XX conjugate (A-21371), which was then visualized with red-fluorescent Alexa Fluor 568 streptavidin (S-11226)
细胞骨架
细胞形态支撑与形态建成 细胞内的转运或运动 膜相差的性质和功能 吞噬作用 细胞运动
23
化学荧光探针
膜荧光探针
细胞膜基本成分：磷脂、 脂肪酸和固醇， 膜探针：非极性探针、两 性探针、膜流动性探针、 荧光标记的磷脂、脂肪酸 和固醇探针。 用途：测量膜的扩散、监 测病毒－细胞的融合、观 察膜流动性和研究膜表面 的分子组成。
18
化学荧光探针
溶酶体和线粒体同染
19 LysoTracker Red DND-99 (L-7528) MitoTracker Green FM (M-7514)
化学荧光探针
内质网
粗面内质网和滑面内质网 主要功能： 蛋白质的合成、加工、修饰和转运， 脂类合成，糖类代谢，解毒作用。
20
ER-Tracker Blue-White DPX (E-12353)
33
化学荧光探针
Fluo3
可见光激发： Ex：490nm， Em：525nm； 荧光变化最大： 增强50－250倍， 对pH、Mg2＋等 相对不敏感；
34
化学荧光探针
35
化学荧光探针
海星卵受精诱导的钙波（5s）
36
Calcium Green-1 (C-3713)
化学荧光探针
pH探针
正常的情况下，胞浆为pH6.8～7.4， 溶酶体为pH4.5～6.0 胞内pH的影响：细胞代谢、细胞间通 讯 pH探针分为中性和偏酸性，均为疏水 性探针 中性探针：需使用其AM形式 偏酸性探针：细胞胞饮作用进入溶酶 体
37
化学荧光探针
活性氧探针
胞内活性氧影响细胞代谢 应用：毒理学 常用荧光探针有H2DCFDA ，荧 光强度与活性氧的浓度呈线性关 系。
38
化学荧光探针
免疫荧光探针
免疫荧光细胞组织化学是现代生物学中广 泛应用的技术之一。 特异性和敏性感。 FITC类：易光漂白，对pH值的变化较敏 感； Bodipy类：光稳定性好，发射带窄，易于 多重标记，pH稳定性好。
The cell cycle is an ordered series of events leading to the replication of cells
G0-G1 S # of Events
G2-M
Fluorescence Intensity
29
30
化学荧光探针
膜电位探针
快响应探针： 响应时间短于1ms；变化幅度：2％～10％/ 100mV；监测动 作电位传播过程中发生的快速变化 慢响应探针: 反应速度较慢，为1～20s；变化幅度:1～2%/ 1mV
15
化学荧光探针
线粒体
是负责有氧代谢的细胞器。 线粒体的丰度随细胞类型、代谢水 平、细胞所处状态的不同而有所差 异 用于标记线粒体活性、定位和丰 度，监测药理学试剂的药效
16
MitoTracker Red CMXRos (M-7512)
化学荧光探针
溶酶体
是一种由单层膜包被的小体，内 含各种糖苷酶、酸性磷酸酶、弹 性蛋白酶、羧肽酶、蛋白酶、组 织蛋白酶及多种蛋白酶。 大都是利用荧光底物标记水解酶 的活性和pH变化来标记的。
24
DiIC18(3) (DiI; D-282, D-3911)
化学荧光探针
细胞膜的流动性
主要方式：侧向扩散、旋转、伸缩 振动、翻转、摆动等。 侧向扩散的测量:荧光光漂白恢复 (FRAP) 旋转扩散的测量: 荧光偏振法
25
Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)
40
化学荧光探针
光解反应 激发光的强度和波长 消光系数和量子产率 激发态中间产物的寿命 光化学反应： 偶氮苯的光致同分异构作用 硝基甲苯的光致分解作用 根据生物活性分子的不同来分类：笼锁神 经递质、调质及配体；笼锁胞内第二信 使；笼锁钙；笼锁发光基团、笼锁酶。 应用：肌肉生理、递质释放、钙振荡、微 41 管和微丝动力学
RH 414 (T-1111) DM-BODIPY dihydropyridine (D-7443) Right: ratio of the middle image divided by 31 the left image
化学荧光探针
慢 响 应 探 针
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化学荧光探针
钙离子探针
定性探针：由单波长激光激发，通过荧光 变化直接测量细胞内钙离子动态变化 定量探针：是双波长激发探针，利用双波 长激发和比率技术，来定量测定 这些探针本生不能透过细胞膜，因而需要 使用其AM形式。
26
化学荧光探针
核酸探针
核酸是细胞生长、分化、 遗传的重要物质 用途：测定DNA和RNA的 形态和含量；研究细胞周 期和肿瘤的诊断、治疗和 预防
27
YOYO-1 (Y-3601)
化学荧光探针
人嗜中性粒细胞核染色
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SYTO 13 live-cell nucleic acid stain (S-7575)
48 anti–bovine -tubulin, mouse monoclonal 136-10501, biotin-XX conjugate (A-21371) and Alexa Fluor 568 streptavidin (S-11226)
Texas Red-X phalloidin (T-7471), which labels F-actin, 49 mouse monoclonal anti– -tubulin IgG and fluorescein goat anti–mouse IgG (F-2761), which label microtubules
17 LysoTracker Yellow HCK-123 (L-12491) LysoTracker Red DND-99 (L-7528)
化学荧光探针
Responsible for degrading
certain cell components material internalized from the extracellular environment