植物组织培养必须的条件
植物组织培养的一些注意事项
植物组织培养的一些注意事项一、常用培养基主要特性1、高盐成分培养基包括MS、LS、BL、BM、ER 等培养基;其中MS 培养基应用最广泛,其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高, 微量元素种类齐全, 其养分数量及比例均比较合适, 广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养;LS、BM、ER 培养基由MS 培养基演变而来;2 、硝酸钾含量较高的培养基包括B5 、N6 、LH、GS 等培养基;①B5 培养基B5 培养基除含有较高的钾盐外, 还含有较低的铵态氮和较高的盐酸硫胺素, 较适合南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养;②N6 培养基N6 培养基朱至清等1975 系我国学者创造, 获国家发明二等奖, 适用于单子叶植物花药培养, 柑橘花药培养也适合, 在楸树、针叶树等的组织培养中使用效果也好;③SH 培养基是矿盐浓度较高的一种培养基, 其中铵与磷酸是由磷酸二氢铵NH4 H2 PO4 提供的, 这种培养基适合于某些单子叶及双子叶植物的培养;3 、中等无机盐含量的培养基①H 培养基本培养基大量元素约为MS 培养基的一半, 仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低, 微量元素种类减少, 而含量较MS 为高, 维生素种类比MS 多;适于花药培养;②尼奇培养基Niotsch 1969 此培养基与H 培养基成分基本相同, 仅生物素比H 培养基高10 倍;也适合于花药培养;③米勒培养基Miller 1963 此培养基和Blaydes1966 培养基二者成分完全相同;适合大豆愈伤组织培养和花药等培养用;4 、低无机盐培养基大多情况下用于生根培养基;有以下几种:①改良怀特培养基White 1963②WS 培养基Wolter & Skoog 1966③克诺普液 Knop 1965 花卉培养上用得多;④贝尔什劳特液Berthelot 1934⑤HB 培养基 Holley & Baker 1963 此培养基在花卉脱毒培养和木本植物的茎尖培养中效果良好;其成分是大量元素比1/ 2 克诺普 Knop 液稍多, 微量元素用贝尔什劳特液, 每升培养基中加0 . 5ml;二、与培养基有关的一些细节问题1、培养基所用药品应采用等级较高的化学纯CP三级及分极纯AR二级 , 以免杂质对培养物造成不利影响;2、调节PH也可用精密pH试纸应在干燥器中保存, 以免吸湿而失效;培养基过酸的可用1mol/ L 氢氧化钠 NaOH 来调节; 培养基过碱的可用1mol/ L 盐酸 HCl 来调节 1mol/ L NaOH 的配制方法是称40gNaOH, 溶解后加入蒸馏水, 定容到1 000ml 即可;1mol/ L HCl 的配制方法是量取12mol/ L HCl 84ml , 加水定容至1 000ml;经高压蒸汽灭菌后, 由于某些成分的分解如蔗糖的分解或氧化, 酸度会增加 pH 值一般可降低0 . 2 ;有时玻璃器皿质量较差, 其中一部分物质溶解, 也会影响酸度的变化;这些在调整pH 值时都要考虑进去;分装后应立即灭菌, 若因故不能及时灭菌, 最好放入冰箱中在24h 内完成灭菌工作;灭菌时压力表读数为0 . 8kg/ cm2 ～1 . 1kg/ cm2 , 121℃时保持15min～20min 即可;3、某些生长调节物质, 如吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等物质遇热不稳定, 因此不能进行高压灭菌, 而需用过滤方法灭菌, 经过滤灭菌的溶液, 可在琼脂培养基温度下降到大约40℃时加入到已高压灭菌的培养基中;4、配好的培养基可放到培养室中预培养3d ,若没有污染反应, 则证明是可靠的, 可以使用;暂时不用的培养基最好置于10℃下保存, 含有生长调节物质的培养基在4℃～5℃低温下保存则更理想;含吲哚乙酸或赤霉素的培养基应在配制一周内用完, 其他培养基至多也不能超过一个月;一般情况下, 两周内应用完, 以免干燥变质;三、培养材料及消毒1、取材季节的影响：大多数植物应在其生长开始的季节采样, 生长末期或已进入休眠期, 则外植体对诱导反应迟钝或无反应;2、器官的生理状态和发育年龄：沿植物的主轴, 越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短, 其生理年龄也越老, 越接近发育上的成熟, 越易形成花器官;反之, 越向下,其生理年龄越小;木本植物的组织培养中, 以幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条较好,下胚轴与具有3 对～4 对真叶的嫩茎段, 生长效果也较好 ;一般情况下, 幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力;3、材料大小的影响：材料越小成活率越低, 茎尖培养存活的临界大小应为一个茎尖分生组织带1 个～2 个叶原基, 约0 .2mm～0 .3mm 大小;叶片、花瓣等约为5mm2 , 茎段则长约0 .5mm;因此, 除非用于去除病毒否则不宜将外植体切的过小;但并不是说外植体越大越好, 外植体过大易造成污染, 有实验证明外植体越大污染率越高;4、材料的灭菌：一般是组织越大越易污染, 夏季比冬季带菌多,甚至不同年份污染的情况也有区别;取材最好选在中午或下午, 避开阴雨天取材可减少污染率;消毒是为了消灭病菌, 以保证无菌组织培养的进行;但不同植物及一株植物不同部位的组织, 其带菌程度不同, 它们对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样;最初所使用的消毒剂种类, 浓度及消毒时间的长短都要进行摸索, 以达到最佳的消毒效果;材料有绒毛最好在消毒液中加入几滴吐温- 80 ,对与难消毒的根及地下部位材料可将其浸入消毒液中进行抽气减压, 以帮助消毒液的渗入, 从而达到彻底灭菌的目的;潘学峰等 1998 报道, 12% 的双氧水+ 0 .1%的升汞混合液对南方地下茎生姜灭菌10min 的效果最好;四、材料的接种1、接种室的消毒：植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术, 做好接种室的消毒是至关重要的;污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子, 因此, 每次接种前应进行地面的清洁卫生工作, 并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降, 并用紫外线灯照射20min;接种前超净工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗,并定期清洗过滤膜, 以延长使用寿命;2、无菌操作要求：工作人员使用的工作服、帽子、口罩等, 要经常保持干净, 并定期进行消毒, 即将洗净、晾干的衣帽、口罩等用纸包好后与培养基一起进行高压灭菌;工作人员的头发、衣服、手指中都带有许多杂菌, 为此要穿上工作服, 戴上帽子, 也必须剪除指甲, 并用肥皂擦洗, 最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min , 接种操作前则用70%酒精擦洗;工作人员的呼吸所产生的污染, 主要是在接种时谈话或咳嗽所引起的, 因此, 在操作时应禁止谈话并应戴上口罩;3、材料的分离、切取和接种切割动作要快, 防止挤压使材料受损伤而招致培养失败, 也要避免使用生锈的刀片, 以防止氧化现象产生;接种时要防止交叉污染的发生,刀和镊子等接种工具使用一次应放入70% 或95%酒精中浸泡, 然后灼烧放凉备用;接种时轻轻取下封口纸, 动作要慢以免气流冲入瓶中造成污染;将瓶口靠近酒精灯火焰, 瓶口倾斜, 以免空气中的微生物落入瓶中,将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟, 将灰尘杂物等固定在原处, 然后用镊子将外植体送入瓶中, 材料在培养容器内的分布要均匀, 以保证必要的营养面积和光照条件;茎尖、茎段等基部插入固体培养基中, 叶片通常将叶背接触培养基, 这是由于叶背气孔多, 利于吸收水分和养分的缘故;五、材料的初代培养1、实验方案的设计1、单因子实验设计：单因子实验是组织培养中最常用的实验方法, 尤其在选择适当的激素种类和浓度配比上使用最多;2 、正交实验设计植物离体培养的成功是由多种因素决定的;正交设计是多因素分析的有力工具, 它可以很方便的从众多因素中选出主要影响因素及最佳水平, 因为它可以用较少的实验次数得到较多的信息;例如, 一个7 因素水平的实验, 若将各因素水平全部组合都做一遍, 需要27 = 128 次, 而正交设计只需做8 次实验就可以了, 虽然实验次数减少了, 但因为各因素水平搭配均匀, 8 次实验基本代表了全部实验的情况;正交实验的设计, 主要工具是正交表;大多数生物统计学书都列出了可供选择的正交表,如L4 23 , L827见表2 - 11 , 表2 - 12 ;字母L 右下角号码8 表示它有8 个实验要做,括号内的指数7 表示这张表所安排的实验最多可考察7 个因素也可安排2 个～6 个, 超过7 个要选择其他正交表 , 底数2 表示被考察的因素只要求两个水平;在进行实验前可根据要测试因素的多少及每种因素所考察的水平, 选择适合的正交表, 然后按表进行实验;现举一个例子来说明, 设影响某种植物试管苗生长的因素有光照时间、光照强度、pH 值、温度、蔗糖浓度、BA浓度、NAA 浓度7 个因素, 每个因素选择两个水平, 即, 光照时间 10h , 14h 、光照强度1000lx , 2000lx 、pH 值 5 . 5 , 5 . 8 、温度 20℃ , 25℃、BA 浓度 0 . 5 , 2 . 0 、NAA 浓度 0 . 5 ,1 . 0、蔗糖浓度2% , 4%;现根据因素和水平的多少选择一个适合本实验的正交表, 选L827最理想, 填表时, 因素水平对号入座, 见表 2 - 13 ;第一号实验是光照时间10h/ d、光照强度1000lx、pH 值5 . 5、BA 浓度2 .0、NAA 浓度0 . 5、蔗糖浓度4% , 其他实验依次类推;根据8 个实验结果, 如出苗数量、苗高、生根数、移栽成活率等, 综合考虑, 根据需要选取各最适培养条件;也可通过一定的计算方法参考统计学书 , 算出极差 R , 极差R 表示每个因素在实验中所起作用的大小, R 越大表示该因素的不同水平对实验结果的影响越大, 但若没有可计算的指标时, 还是选择单因子实验较好;2、初代培养物的建立1、保证无菌2、条件合适：首先, 一定要选择好合适的作物种类、品种及培养的部位; 其次,一定要选择合适的培养基, 激素及其他添加物; 还要注意掌握适宜的环境条件;所以在进行一种植物的组织培养之前, 应查找该种植物有关方面的资料, 根据这种植物过去所采用的培养部位、培养基、培养条件和培养技术等, 再决定自己的工作步骤;3、操作技术过关3、污染的防治1、植物材料的选择及防止污染通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多; 老的材料比幼嫩的材料带菌多; 田间生长的材料比温室生长的材料带菌多; 带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多;为此对于培养材料的取材就应很认真地加以选择, 以减少污染的发生;用茎尖作外植体时, 应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养;将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中, 使其发枝, 然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体, 便可大大减少材料的污染;或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养, 待抽出徒长的黄化枝条时取材, 也可明显地减少污染;对木本植物等难以消毒的材料可采用多次灭菌法;如将切好的外植体放入1 . 3%次氯酸盐溶液中商品漂白粉25%的溶液消毒30min , 然后用无菌水冲洗3 次, 再放在无菌条件下,次日用2 . 6%次氯酸钠灭菌30min , 然后用无菌水冲洗3 次;也可采用多种药液多次浸泡法,以加强灭菌效果;材料内部易感染病菌, 在这种情况下, 必须在培养基中加入抗生素类, 防止初代培养物污染;2）、人为污染的防止接种前应用肥皂将手仔细洗净后, 再用70%酒精擦洗双手, 并需及时剪除指甲;在工作中特别要注意避免交叉感染, 双手必须清洁, 工具则用一次即需消毒一次;工作人员呼吸所产生的污染, 主要是接种时说话或咳嗽所引起的, 因此, 操作时严禁谈话, 并应戴上口罩, 也应穿工作服, 戴工作帽;污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染, 这种细胞为芽孢杆菌;法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌Bacillus lenlus , 它外被荚膜, 耐高温, 一般消毒剂难以杀死;它可随培养材料、用具等传播; 它可出现在培养基表面, 或呈滴形云雾状存在于培养基内;若出现应严格灭菌, 清洗用具, 更换消毒酒精;4、防止外植体褐变1、褐变的影响因素褐变是由于组织中的多酚氧化酶被激活, 使细胞的代谢发生变化, 酚类物质被氧化后产生醌类物质, 这类物质呈棕褐色, 它们会逐渐扩散到培养基中, 抑制其他酶的活性, 毒害培养的材料;褐变的影响因素是复杂的, 随植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同而危害的程度也有区别;材料本身的生理状态不同, 接种后褐变的程度也不同;如在欧洲栗的培养中, 用幼年型的材料培养含醌类物质少, 而用成年型材料培养时含醌类物质多;而在卡德利亚兰的培养中, 较短的新生茎致褐物质含量高, 而较长的新生茎致褐物质含量低, 另外致褐物质的含量也因季节的不同而不同, 冬季褐变少, 夏秋季褐变最严重, 存活率最低;在枝条上取芽的时期及所取部位不同也有区别, 如欧洲栗取1 月后半月的芽培养则醌的形成少, 而在5 月～6 月取芽培养则醌类物质发生严重;在第一至第四个芽的生长期单宁类物质合成多, 因此, 接种后褐变也严重;油棕用幼嫩外植体如胚培养较少褐变, 而用高度分化的叶片接种后则容易褐变;总之, 分生部位接种后形成的醌类物质少, 而分化的部位则形成的醌类物质较多;培养基成分过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化;例如油棕用MS无机盐培养基容易引起外植体的褐变, 而用降低了无机盐浓度的改良MS 培养基时则可减轻褐变, 而且可获得愈伤组织和胚状体;激素使用不当时, 材料也容易褐变;细胞分裂素6 - 苄基氨基嘌呤或激动素有刺激多酚氧化酶活性提高的作用, 这在甘蔗的组织培养中表现十分明显;在外植体最适宜的脱分化条件下, 分生能力强的细胞大量增殖, 酚类的氧化会受到抑制;在芽旺盛增殖时, 褐变也被抑制;此外, 培养条件不适宜, 如温度过高或光照过强, 均可使多酚氧化酶的活性提高, 从而加速被培养组织的褐变;培养时间过长接种后材料培养时间过长, 未及时转移, 也会引起材料的褐变, 甚至导致全部死亡, 这在培养过程中是经常可见的;2）、褐变的防止选择适当的外植体和培养条件：选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要的手段;外植体应有较强的分生能力, 在最适宜的细胞脱分化和再分化的培养条件下, 使外植体处于旺盛的生长状态, 便可大大减轻褐变;抗氧化剂的作用：在培养基中加入抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮 PVP、半胱氨酸等抗氧化剂, 或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养, 可减轻醌类物质的毒害;连续转移：对于易褐变的材料, 进行连续转移, 可以减轻醌类物质对培养物的毒害作用;六、试管苗的增殖与继代培养一、加快试管苗的繁殖速度1、试管苗繁殖类型试管繁殖类型共有五种：微型扦插型、丛生芽增殖型、器官发生型、胚状体发生型、原球茎发生型,一定要注意其遗传稳定性, 前三种途径一般能保持遗传稳定性;2、试管繁殖速率及计算统计试管苗增殖速度, 有以苗为单位, 也有以芽或未生根的小茎作单位的, 以原球茎球状体或胚状体因难以统计, 则以瓶为单位;大多数以芽和苗作单位;试管苗理论上一年能繁殖多少, 可用下面的简单公式计算:Y = mX nY = 年繁殖数m = 无菌母株苗数X = 每个培养周期增殖的倍数n = 全年可增殖的周期次数例如月季每5 周转接一次, 甲品种每次增殖3 倍, 乙品种每次增殖5 倍, 丙品种每次增殖7 倍, 假定一开始都是一个芽, 那么这三个品种一年能繁殖多少呢根据公式可知: n =365d/35d= 10 .4 , 即每年可转接10 次, 那么这三个品种年繁殖率分别计算如下: 甲品种Y = 1×31 0 = 59 000 = 5 .9×104乙品种Y = 1×51 0 = 9 760 000 = 9 .76×106丙品种Y = 1×71 0 = 282 000 000 = 2 .82×108从上可知甲品种每5 周转接一次, 一年可繁殖出5 万多苗, 乙品种每周期增殖5 倍, 一年可得900 多万苗, 而丙品种每周期增殖7 倍, 一年可繁殖出2 亿苗来;不过实际值远比理论值为低;因为实践中要受到多种因素制约, 困难很多;但理论计算可以作为一个计算产量的指标, 提供参考, 有它的积极意义;3、提高繁殖速度的方法不仅试管苗的繁殖类型不同, 而且在试管内又受到基因型、外植体来源、年龄、部位、培养基种类、附加成分和培养环境等多种因素的影响, 应通过具体试验来摸索每种植物最快最好的繁殖方法;1、改进培养基：、不同的植物材料需要使用不同类型的培养基;、糖具有维持培养基渗透压的作用,在培养过程中植物组织不断地从培养基中吸收糖,糖浓度降低,当糖浓度不能维持正常渗透压时,材料要转移到新鲜培养基;培养基中的维生素绝大部分为B族维生素,它们一各种辅酶的形式参与植物代谢活动,影响形态发生、分化及试管苗的生长,为防植物缺乏,一般均加入;、植物生长调节物质在试管苗增殖中期决定性作用A、促进叶芽形成和生长的激素：细胞分裂素抑制了植物的顶端优势,使得叶芽不断分化和生长,逐渐形成芽丛,并促进芽丛生长;大多植物最适用量为~,一般用量~;应用最多的是6-BA,其次KT和2ip,ZT用的较少,因它的价格太贵;对于微型扦插型繁殖可不加细胞分裂素或加以下也可;除了细胞分裂素以外,还可加入低浓度的生长素,以促进叶芽的生长,但要防止愈伤组织化;常用的有NAA,IBA,IAA,浓度在~;在实际操作中高浓度细胞分裂素和低浓度生长素的配比,既能提高腋芽的增殖速度,也能保证腋芽健壮生长;如果细胞分裂素浓度过高生长素浓度过低,会形成过于细密的嫩芽,虽然提高了增殖速度,但苗多而弱,降低了芽的质量;但如果细胞分裂素过低,生长素过高,影响芽的增殖速度,甚至有时没有侧芽产生;B、诱导不定芽形成和生长的激素：除现有的芽之外, 任何器官上的, 通过器官发生重新形成的芽称为不定芽;促进外植体形成不定芽, 要使用一定量的细胞分裂素和生长素, 一般浓度不能过高;否则不但使器官分化能力降低, 而且也使遗传性难以稳定;诱导外植体形成不定芽时, 一般使用细胞分裂素的浓度高于生长素浓度的配比, 但也经常采用细胞分裂素和生长素浓度的比值接近于1 的配比;C、促进胚状体的形成和繁殖的激素：胚状体途径的优点是增殖率高, 而且同时具有胚根和胚芽, 可免去生根;现在胚状体发生还不普遍或产生的胚状体难以成株或成株率太低, 以及遗传性尚不稳定, 故仅在有限植物中应用;一般是在含有丰富还原氮的培养基上, 加有生长素, 特别是2 , 4 - D 以诱导胚状体的发生, 然后转移到降低浓度或没有生长素的培养基上使其成熟、萌发和生长;培养基中, 还可加入其他附加成分, 如氨基酸、水解乳蛋白 LH 300mg/ L～500mg/ L、水解酪蛋白CH 200mg/ L～500mg/ L, 以及腺嘌呤ADE 1mg/ L～80mg/ L 等, 以促进试管苗的生长;2）、改善培养条件:试管苗增殖与培养条件如温度、光照、湿度、培养器皿和培养基的pH值密切相关, 需要进行控制, 以促进繁殖;七、保持试管苗的继代培养1、试管苗的继代方法1）、液体培养2）、固体培养2、影响试管苗继代培养的因素及解决措施1）、驯化现象：有些植物在开始的继代培养中需要添加生长调节物质, 其后加入少量或不必加入生长调节物质就可以生长, 此现象就叫做“驯化”;2）、在长期的继代培养中, 材料自身内部要发生一系列的生理变化, 除了前面讲的“驯化”现象外, 还会出现形态发生能力的丧失;一般认为分化能力衰退主要有三个因素:第一、愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来的成器官中心分生组织,当重复继代则会逐渐减少或丧失,这意味着不能形成维管束,只能保持无组织的细胞团;第二、形态发生能力的减弱和丧失也可能与内源生长物质的减少或丧失有关;第三、也可能是细胞染色体出现畸变,数目增加或丢失;3、影响继代培养的其他因素1）、植物材料的影响不同种类植物,同种植物不同品种,同一植物不同器官或不同部位继代繁殖能力也不相同;一般是草本>木本；被子植物>裸子植物；年幼植物>老年植物；刚分离植物>已继代植物；胚>营养体植物；芽>胚状体>愈伤组织;2）、培养基及培养条件培养基及培养条件适当与否对能否继代培养影响颇大,故常改变培养基和培养条件来保持继代培养;3）、继代培养时间长短关于继代培养次数对繁殖率的影响的报道不一;有的材料长期继代可保持原来的再生能力；有的经过一定时间继代后才有分化再生能力；而有的随继代时间加长而分化再生能力降低;4）、季节的影响植物材料能否继代与季节有关;一般能达到每月继代3~10倍,即可用于大量繁殖,盲目追求过高增殖倍数一是所产小苗小而弱,给生根、移栽带来很大困难,二是会引起遗传性不稳定,造成灾难性后果;八、试管苗的生根与移栽（一）试管苗的生根1、试管内生根1）、根发生过程植物离体培养根的发生都来自不定根;根的形成从形成上可以分为两个阶段,即形成根源基和根源基的伸长及生长;前一阶段根源基的形成包括第一次、第二次细胞横分裂和第三次细胞纵分裂,细胞横分裂能够被生长素促进;根源基的启动和形成约历时48h,后一阶段为细胞快速伸长阶段,大约需24~48h;根源基的形成和生长素有关,根源基的伸长可以在没有外源生长素下实现;2）、影响试管内生根的因素（1）、植物材料不同植物、不同基因型、同一植株不同部位和不同年龄对分化根都有决定性因素;若试管里不生根不要完全从培养中去找原因,也应在取材时考虑;不同植物的一般生根规律是：木本比草本难,成年树比幼年树难,乔木比灌木难;（2）、基本培养基大多数使用低浓度的MS培养基,其中不少使用1/2MS或1/3MS培养基;+多可能不利于发根,生根需要P和K元素,但不宜太多；而Ca2+多数大量元素中有人认为NH4报道有利于根的形成于生长;微量元素对生根有利的是B和Fe;生根通常用1%~3%的蔗糖; （3）植物生长调节剂据报道单用一种生长素的占51..5%,生长素加激动素占%;a、愈伤组织分化根时使用NAA最多,浓度以~为多;使用IAA+激动素浓度范围以~和~居多;b、而胚轴、茎段、插枝、花梗等分化根时,使用IBA居首位,浓度以为多;可见生根培养多数使用。
第2章植物组织培养的设备与培养条件
试管——特别适合于用少量培养基及试验各种不同配方 时选用，在茎尖培养及花药和单子叶植物分化长苗培 养时更显方便。有圆底的和平底的两种。 三角瓶——是植物组织培养中最常用的培养器皿，适合 于各种培养，固体或液体、大规模或小规模都行。 其优点是：采光好、瓶口较小不易失水和污染。 L形管和T形管——为专用的旋转式液体培养试管。 培养皿——适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培 养和无菌发芽。 角形培养瓶和圆形培养瓶——适于液体培养用。 果酱瓶或罐头瓶——常用于试管苗大量繁殖，200ml500ml规格 太空玻璃杯——可机械化洗瓶，适于工厂化生产
（3）磨口瓶 用于存装试剂、分装母液。 （4）滴瓶 盛装酸液（1N盐酸和1N氢氧化钠） （5）锅具：配置和熬制培养基
2.2.1.3计量容器 （1）容量瓶：培养基配置时定容 （2）移液管和移液枪 （3）量筒、量杯
2.2.2器械用具 组织培养所需要的器械用具，可选 用医疗器械和微生物实验所用的 器具。常用的器械用具如图： （1）镊子：可用于接种和转移植 物材料 （2）剪刀：一般在转移植株时用。 （3）解剖刀： （4）显微接种工具：包括接种针、 接种钩及接种铲，用来接种花药 或转移植物组织。
（1）功能：植物材料的灭菌、接种以及培养 物的继代转接等。 （2）仪器设备及用品： 超净工作台，紫外灯、小推车、搁架、接种 工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通 剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌 过滤器等），紫外灯，换气扇，空调。
超净工作台
接种工具
无菌操作室消毒的方法： 照射灭菌： 紫外灯， 15—20分钟（接种前） 熏蒸灭菌 ：甲醛加高锰酸钾（定期）（一般 每立方米用甲醛2mL、高锰酸钾1g。 ） 超净工作台的消毒方法： 每次接种前，用70%酒精药棉擦拭台面。
植物组织培养的原理和程序
N、S、P、K、Ca、Mg 细胞分裂素
用合成有机物 (3)温度 无菌
生长素
(4)AaBb
无性生殖
考点二
花药离体培养
近几年高考对花药培养的考查较少，预计
考情 今后高考对本内容的考查将以简答题为主，花 解读 药离体培养技术的操作及与植物组织培养的区 别将是命题的主要方向。
[做一题]
[例2] 下图是花药培养产生花粉植株的两种途径，回答下 列相关问题：
培养基的灭菌最为重要；再分化阶段需要光照，因为叶绿 素的合成需要光照条件。(4)同一植株的所有细胞所含有的 遗传信息相同，但表达不同，故形态功能也存在差异。(5) 酒精灯火焰旁温度较高，可有效杀死空气中的细菌。
[答案]
(1)无机盐 分化
生长素
(2)植物细胞的全能性 芽发育成叶，叶肉细胞 (4)选择性表达 (5)接
一、菊花的组织培养 1．植物组织培养的原理和程序 (1)原理： 植物细胞的全能性 。
(2)程序：
2．植物组织培养的影响因素 (1)选材：不同植物组织或同一植物组织的不同部分，培 养的难易程度差别很大，菊花的组织培养，一般选择 未开花植株的茎上部新萌生的侧枝 。 (2)培养基：植物组织培养需要适宜的培养基，常用的是 MS培养基 ，在配制好的培养基中，常常需要添加
[关键一点]
其他条件对花药培养的影响
(1)光照：离体花药对光照的反应是不同的。一般认为， 花 药培养在诱导愈伤组织和胚状体期间进行暗培养或给 以散射光处理比较好。强光虽然有利于以后的绿苗分 化，但会抑制愈伤组织的形成，而弱的散射光既不影响 愈伤组织的形成，也有利于以后的绿苗分化。
(2) 温度：培养条件中最主要的是温度。离体花药对温度 比较敏感，是诱导小孢子发育的关键因素。
植物组织培养技术
2种激素5种浓度的实验组合 6-BA mg/L） 0 NAA 0 (mg/L) 0.5 2.5 5 10 0.5 1 6 11 16 21 2.5 2 7 12 17 22 3 8 13 18 23 5 4 9 14 19 24 10 5 10 15 20 25
• 完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的 精力、物力越多。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试 验信息，通常采用正交试验。例如，采用正交设计，在使用此表 时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试 验，其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多 因素搭配在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素 所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此，一次系统的试 验结果，就可以把问题分析得清清楚楚，用有限的时间取得成倍 的收获。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几 种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。
四、广谱实验法
• 在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无 机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、 细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高 (H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了 一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一 个可用4个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐， 低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有 机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段， 再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养 基的最佳配方。这是因为不同类型的生K素和细胞分裂 素对不同植物的活性有所不同。
• 不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的(表 2—1)，大多在5、6．5左右，一般培养基皆要求5.8， 这基本能适应大多植物培养的需要。 • pH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以 硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高 一些。一般来说当pH值高于6．5时，培养基全变硬； 低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低 pH值(约0.2—0.3个pH值)因此在配制时常提高pH值 0．2—0．3单位。pH值大小调整可用0．1M的NaOH和 0．IM的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高0．2单 位，lml的HCl可使pH值降低0．2单位。调节时一定要 充分搅拌均匀。
植物组织培养的基本原理
植物组织培养的基本原理植物组织培养是指将植物的其中一部分（如种子、茎、叶片等）无菌的放入含有合适培养基和激素的培养容器中，经过合适的条件下培养，使其细胞分裂、分化和发育，以获得较高的再生率和较好的生长状态。
植物组织培养的基本原理可以总结为以下几点：1. 细胞分裂与分化：组织培养的首要任务是获得大量再生植株，这需要通过控制培养基中激素的浓度来促进细胞分裂和分化。
激素可以刺激细胞增殖，不同的激素对于不同的植物种类有不同的效果。
例如，生长素（auxin）能够促进根系的形成，而细胞分裂素（cytokinin）则能促进茎、叶的生长。
2.培养基的营养成分：培养基是植物组织培养的重要基础，它提供了植物生长所需要的营养成分。
培养基中通常包含无机盐、有机物质、糖类和维生素等。
无机盐提供了植物生长所需的各种离子，有机物质提供了能量和碳源，糖类是能够被植物利用的碳源，而维生素则是植物生长所必需的辅助物质。
3.环境条件的控制：植物组织培养需要在无菌条件下进行，因此需要通过合适的培养器具和适宜的培养环境来保持无菌状态。
通常会在特定的培养室中进行操作，室内设置灯光、温度和湿度等环境条件。
光照是植物进行光合作用的必须条件，适宜的光照条件能够促进植物生长。
温度和湿度的控制对于植物的生长和发育也至关重要。
4.植物生长调节剂的使用：植物生长调节剂是植物组织培养中的重要工具，它们可以促进或抑制植物的生长和发育。
不同的激素在植物组织培养中起到不同的作用。
如前所述，生长素能促进根系的形成，而细胞分裂素则能促进茎、叶的生长。
通过合理地使用激素，可以控制植物在培养过程中的分化和形态。
5.植物的再生能力：不同植物种类的再生能力不同，一些植物种类具有较高的再生能力，可以较快地形成新的组织和器官。
而其他一些植物种类则需要通过调整培养条件和激素浓度等因素来提高再生率。
具体的培养方法需要根据不同的植物种类进行调整和改良。
总之，植物组织培养是通过控制培养基、营养成分、激素和环境条件等因素，促进植物细胞的分裂、分化和再生，从而实现植物的大规模繁殖和研究。
植物组织培养
植物组织培养植物组织培养：在无菌的条件下，将离体的植物材料包括器官，组织，细胞以及原生质体在人工培养基上进行培养，使其再生发育成完整植株的过程，又称植物离体培养。
细胞全能性：植物体的任何一个细胞都携带该物种的全部遗传信息，离体细胞在一定的条件下具有发育成完整植株的潜在能力。
外植体：植物组织培养中离体的植物材料，包括植物器官，胚胎、组织、细胞和原生质体。
细胞分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
脱分化：已分化成熟的植物组织或器官回复到分生状态，细胞开始分裂形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。
再分化：是指在一定条件下，脱分化形成的愈伤组织转变成为具有一定结构、执行一定生理功能的细胞团和组织、并进一步形成完整植株的过程，即从愈伤组织再生形成完整植株的过程。
愈伤组织：植物体受伤后的伤口处或在植物组织培养中外植体切口处产生的一团不定型的薄壁组织。
离体无性繁殖：根据植物细胞全能性原理，在无菌条件先短时间内形成大量植株。
玻璃化苗：在植物组培中，茎叶形成透明矮小肿胀的形态，生根能力差。
问答题：1、无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术，请根据自己的体会论述如何在植物组织培养过程中做到无菌？1〕取少菌的材料〔春夏，中午的幼芽〕 2〕严格灭菌3〕合理安排操作程序 4〕无菌保存 5〕操作标准2、组培在生产上的应用有哪些？学好植物组培的意义？1〕植物快速繁殖：增殖速度快，本钱低，易于批量生成和管理。
比方利用一小块叶片或一个茎尖，一年内可繁殖出1000-100000株幼苗2〕脱除病毒：植物在生长过程中几乎都要蒙受到病毒的危害，采用茎尖培养方法可以除去植物体内的病毒。
脱毒苗恢复了原有的优良种性，生长势明显增强，整齐一致。
3〕培养新品种：克服远缘杂交不亲合性；克服远缘杂交的不孕性；选择细胞突变体；单倍体育种；转基因育种。
4〕植物次生代谢产物生产：利用植物组织后细胞的大规模培养，可以生产一些天然有机化合物，这些次生代谢产物，往往具有一些特定的功能，对人类有重要的影响和作用。
植物组织培养(全)
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
植物组织培养技术
初代培养（ culture） 初代培养（primary culture）：指在组织 培养过程中，最初建立的外植体无菌培 养阶段。由于首批外植体来源复杂，携 带较多细菌，要对培养条件进行适应， 因此，初代培养一般比较困难。 继代培养（ subculture） 继代培养 （ subculture ） ： 在组织培养过 程中，当外植体被接种一段时间后，将 已经形成愈伤组织或已经分化根、茎、 叶、花等的培养物重新切割，转接到其 它培养基上以进一步扩大培养的过程称 为继代培养。
另一为药物和生物制品的工业生产，探索 天然药物生产工业化的途径是当前药物生产 的一个新方向，有可能用组织培养法来代替 全植物提取有效成分。组织培养应用在药学 方面的工作虽然历史不长，但发展很迅速， 它具有如下一些优点： 1．利用组织培养代替原植物的栽培以获得 所需的有效成分，达到产量高，成本低的目 的，还可节约土地。 2．除了应用于产生次生物质外，还可应用 于生物转化。例如烟草组织培养中蒂巴因去 甲基后可能生成吗啡。
目前中国已成功地将麦角菌、灵芝、猴 头菇等真菌进行工业化生产，高等植物组织 培养在工业化中的应用也正在研究。 总之，植物组织培养这一新技术在中草药 方面应用的前途是无限广阔的，它不仅有利 于探讨和阐明药用植物生理、遗传和成分生 物合成等一系列理论问题，而且一旦工业化 生产问题得到解决，将可以为防病治病做出 很大的贡献。
2 培养基的种类 MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基等等。 3 培养基的配制 （1）混和培养基中的各成分 （2）融化琼脂 （3）调整pH为5.8 （4）分装 （5）灭菌 （6）放置备用
二组织培养操作的一般流程
1 2 3 4 5 6 器皿的洗涤 培养基的配制和灭菌 接种室及用具消毒 材料灭菌：70％酒精、氯化汞 接种 无菌培养
植物组织培养具备的基本培养条件
植物组织培养具备的6大基本培养条件在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH 值、渗透压等各种化学环境条件都是影响组织培养育苗的生长和发育重要因素。
一、温度(temperature)因为温度是植物组织培养中的重要因素，所以植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养都是在23〜27 C之间进行，一般采用25±2C。
低于15C时培养，植物组织会表现生长停止，高于35C时对植物生长不利。
但是，不同植物培养的适温不同。
白鹤非的最适温度是20C、月季是25〜27C、番茄是28C。
温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。
如烟草芽的形成以28C为最好，在12C以下，33C以上形成率皆最低。
不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30 C以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率比在25%以下的高。
桃胚在2〜5C条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。
用35C处理草莓的茎尖分生组织3〜5d,可得到无病毒苗。
二、L ED 光照(light)组织培养中使用光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面：1、LED 光照强度(light intensity)光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。
一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。
2、L ED 光质(light wave)光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。
如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。
但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。
3、L ED 光周期(light period)试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。
植物组织培养
②影响细胞再分化因素： 从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种
类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是目前，还不 能使所有植物的活细胞都再生植株。主要原因是： （1）不同植物种类再分化的能力差异较大（遗传背景）； （2）对某些植物再生条件还没有完全掌握。
有不同的培养反应。 （6）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物
及裸子植物容易。
4、愈伤组织（Callus）培养
①愈伤组织生长过程
在脱分化的过程中，多形成Callus, 其细胞结构无明 显极性。
• （1）诱导期：细胞准备进行分裂， 细胞大小几乎不变，
生理生化变化大，迅速合成蛋白质和核酸。
• （2）分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成
小芯。细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。在原培养 基上，细胞会发生分化，及时转移，其可无限制地进行细 胞分裂，维持不分化状态。
• （3）分化期：细胞发生生理代谢变化，出现形态和功能
各异的细胞。
②愈伤组织的生长特性
（1）生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在受伤 组织表面形成一层愈伤组织， Callus的细胞数目迅速增 多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可 以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
组织培养的奠基人
细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是植株离 体再生的基础。
第三章 植物组织培养的培养条件
第三章植物组织培养的培养条件第一节植物组织培养的条件一、环境条件（一）温度培养温度对植物细胞生长及二次代谢产物生成有重要影响。
通常，植物细胞培养采用25℃。
1．离体培养条件下的温度控制原则温度控制主要依据植物种的起源和生态类型来确定。
将植物分为喜温性植物和冷凉性植物两大类。
喜温性植物培养温度一般控制在26~28℃比较适宜。
冷凉性植物通常培养温度控制在18~22℃或＜25℃较为适宜。
一般温度低于15℃，高于35℃对植物细胞的分裂、分化不利。
在细胞脱分化阶段（诱导期）和愈伤组织增殖期（分裂期），温度要求高一些，而在器官发生阶段（分化期）要求低些。
2．培养周期中的昼夜温差培养过程中采用恒温培养好，还是变温培养好呢？目前多数植物种，从器官到细胞培养均采用恒温培养。
国内有关小麦、水稻花药培养温度试验报道认为：在诱导花药形成愈伤组织时，昼夜恒温较好，在器官分化时，昼夜具有一定温差比较好，分化出的小植株也健壮。
3．低温预处理有报道，花药离体培养前，实行低温预处理，可以促进植物细胞脱分化和再分化，已成为一项有效的诱导措施。
特别在花药和花粉培养方面的研究报道相当多。
（二）光照光对植物有着特殊的作用。
光照射条件不仅通过光照周期、光的质量(即种类、波长)而且通过光照量(光强度)的调节来影响植物细胞的生理特性和培养特性。
研究表明，光调节着细胞中的关键酶的活性，有时光能大大促进代谢产物的生成，有时却起着阻害作用。
1．光照强度：离体培养条件下一般为1000~4000lx（勒克斯），离体培养中通常难以达到4000lx，一般光量在2000~3000 lx。
2．光质：不同的光质对植物的光合作用、色素形成、向光性、形态建成的诱导等影响是不同。
橙红光和蓝紫光是生理有效辐射，绿光很少被叶绿素吸收，属于生理无效辐射。
据报道，芽分化的有效光谱成分为蓝紫光，波长为419~540nm，波长为660nm的红光对芽分化无效。
根分化则和芽分化相反，根分化受红光600~680nm所刺激，而蓝光则无效。
植物组织培养
植物组织培养重点名词解释：1、植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。
又称为植物离体培养2、外植体（explant）：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞。
3、愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。
4、离体生态学（in vitro ecology）：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件。
5、植物细胞全能性（totipotency）：是指任何携带完整遗传信息的植物活细胞都具有表达其所有遗传信息的能力，能够发育成完整的植株。
胞需经过脱分化和再分化过程才能表现其全能性。
6、脱分化（dedifferentiation）：成熟细胞或分化细胞转变为分生状态（即形成愈伤组织）的过程。
7、再分化（redifferentiation）：成熟细胞或分化细胞脱分化转变为愈伤组织后重新分化成异质细胞的过程。
8、植物茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。
9、茎尖培养（shoot tip culture or apical meristem culture）是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。
10、叶培养的意义：研究叶形态建成、光合作用、叶绿体形成等；叶细胞全能性；原生质体融合；无性繁殖系；诱变育种。
11、离体叶组织发育途径：直接产生不定芽，由愈伤组织产生不定芽，胚状体和其他。
12、植物器官培养是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。
13、植物胚胎培养是指对植物的胚、胚乳、胚珠和子房等进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。
包括：胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。
14、胚乳培养是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术15、胚珠培养是将胚珠从母体分离出来，无菌条件下让其进一步生长发育，使其形成植株的技术。
植物组培室设备及培养条件全攻略
植物组培室设备及培养条件全攻略组培室建设首要考虑的问题就是组培室需要哪些设备条件和需要什么样的培养条件。
对这些有了全面了解以后，我们便可以因地制宜地新建或利用现有房屋建设实验室。
在设计组培室时，一般情况应按组培的流程来设计，同时考虑人物分流顺畅，空间合理利用。
植物组织培养要求严格的无菌的条件，需要一定专业仪器设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。
第一、实验室一个标准的组织培养实验室应当包括洗涤室、•配置室、接种室、培养室、观察室（冷却室）、灭菌室、洗苗室等。
在实际中可结合可行条件，合并一部分。
（一）洗涤室洗涤室完成玻璃器皿和其它仪器的清洗、干燥和贮存。
室内应配备大型水槽，用于培养器皿的洗涤，最好是内衬白瓷砖的水泥槽。
为防止碰坏玻璃器皿，可铺橡胶板，上下水道要畅通。
备有大型塑料筐，用于放置培养器皿。
可直接置于搁架上，以节约空间和便于运输工作。
备有空干架，以空干涮净的培养器皿。
（二）配置室、灭菌室（可分开）准备室要求明亮、通风。
在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。
如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。
洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。
为完成培养基的制备工作，准备室还应配备以下仪器设备：1．工作台。
其高度应方便配制工作。
2．药品柜。
用以放置常用药品。
3．普通冰箱。
主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。
4．电子分析天平和托盘天平。
电子分析天平精确度为0.001g，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品；托盘天平精确度为0.1g，用于称取用量较大的糖和琼脂等。
天平应放置在干燥、不受振动的固定操作台上。
5．纯水仪或电蒸馏水器。
纯水仪提供纯水，水质好。
电蒸馏水器，采用硬质玻璃或金属制成。
蒸馏水用于配制母液或培养基，配培养基可用自来水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。
植物组织培养技术
组织培养技术在无菌的条件下将活器官、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养而成的细胞、组织或个体。
这种技术已广泛应用于农业和生物、医药的研究。
美国在20世纪中期应用组培技术而获得的芹菜苗已成苗地取代了种子繁殖的传统方法。
我国目前在番茄、辣椒、马铃薯、生菜、人参和果品生产中也已广泛投产应用。
原理植物组织培养的原理是细胞全能性。
也就是说每个植物细胞里都含有一整套遗传物质，只不过在特定条件下不会表达。
组织培养基于此原理就可以将已处于分化终端或正在分化的植物组织脱分化，诱导形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成新的丛生芽。
培养条件1.愈伤组织的培养条件：必须无菌操作2.材料：刚生长不久，具有高度分裂能力的茎尖，芽尖，感染病毒的机会很小3.植物细胞全能性，确保组织能培养成植株。
4.在无菌操作室中完成接种工作，然后放于培养室[光照（日光灯照射），温度（30度）]中培养。
所以说完成操作后，在培养室中培养时就需要光照条件了。
改良（一）增加遗传变异性，改良作物单倍体育种：通过花药培养，从小孢子获得单倍体植株，染色体加倍后获得正常二倍体植株，这是一条育种的新途径。
单倍体育种可以缩短育种年限，节约人力物力，较快地获得优良品种，目前已有四十多种植物获得了单倍体植株。
我国在水稻、小麦、烟草、柏树、橡胶、辣椒等植物的单倍体育种的工作上，处于领先地位。
胚培养、子房培养、胚珠培养：为了克服远缘杂交的不亲和性，可采用胚、子房、胚珠培养和试管受精等手段。
最早成功的例子是两个栽培种亚麻的杂交胚发生败育，利有杂种胚培养克服了一些障碍，得到种子。
现在在棉花、黄麻上也获得成功。
从玉米的离体子房培养，经体外受粉可以得到种子。
突变体的选择和应用：由于植物的单细胞培养成功，可以用这个方法诱发单细胞进行突变，通过筛选所需要的突变体，然后使细胞分化成植株，再通过有性世代使遗传性稳定下来，这是从细胞水平来改造植物的一种途径。
除细胞外，愈伤组织、花药、原生质体都可诱发突变。
植物组织培养
绪论植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
外植体：愈伤组织：一、植物组织的主要特征：（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
三．植物组培的应用1.植物离体快繁。
2.无病毒苗木培养。
3.培育新品种或创制新物种。
4.次生代谢物生产。
5.植物种质资源的离体保存。
6.人工种子。
第一章1.）实验室包括：准备室，无菌操作室，培养室，温室。
2.）器具的灭菌：1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。
（1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150 ℃保温2小时，成本较高。
（2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120 ℃15－20分钟。
（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。
2、培养基灭菌：采用高压蒸汽灭菌。
植物组织培养(1)
0.1.3 植物组织培养的研究类型和任务
• 组织培养：分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组 织等。
• 器官培养：根、茎、叶、花、果实、种子。 • 胚胎培养：幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。 • 细胞培养：单细胞或较小细胞团，如性细胞、叶肉细胞、
1. Thimann和Wickson
• 1958年，他们发现腋芽（当顶芽存在时为休眠状态） 的生长，可以通过外源细胞分裂素的应用而启动。这 样，将茎段培养在含有细胞分裂素的培养基上，就可 以在一个具有完整顶芽的生长中的茎上诱导侧芽的形 成。这将消除顶端优势，得到大量不定芽。
Thimann
2. Morel－脱毒、快繁商业化
• 1922 年 ， 植 物 离 体 组 织 培 养 取 得 了 一 些 进 展 。 德 国 人 Kotte和美国人Robbins两人同时分别独立地将分生组织作 为外植体。Kotte研究切下的根尖，如豌豆、玉米根尖， 将它们放在含有Knop溶液盐成分、葡萄糖、含氮化合物 如天冬酰氨酸、丙氨酸以及肉汁的各种营养液中。Kotte 观察到根尖生长持续了2周，但他没有进行继代培养。另 一方面Robbins通过继代，将玉米根尖离体培养了更长的 时间，但随着时间延长，生长量减少，最后消失。
• 1952年， Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技 术，通过分离已被病毒感染的大丽花个体的根尖，并将其 离体培养，重新获得了无病毒的大丽花。
• 1960年，Morel利用兰花茎尖培养，实现了脱毒和快速繁殖 （rapid clone propagation）的两个目的。这一技术导致欧 洲、美洲和东南亚许多国家“兰花工业”的兴起。
0.2 植物组织培养的形成和发展
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1.2研究的目的和意义为什么要做这样的研究？？看前言棉花是我国主要的经济作物,随着世界经济的一体化,棉纤维出口量增加,对棉纤维质量和种类的要求也越来越高,但我国棉花主要推广品种的纤维品质中等,纤维强度偏低,绒长偏短且类型单一,纺高支纱的优质棉仍需大量进口[1]。
因而,在提高棉纤维产量的同时,改良棉纤维品质也成为棉花育种的主要目标。
海岛棉以优良的纤维品质著称于世,但产量较低;陆地棉产量高,但品质较差。
研究证明利用海陆种间杂交F1代优势是利用海岛棉优质纤维基因资源生产优质纤维的有效途径[2-4]。
这一工作亲本选择很重要,而亲本各性状配合力是指导亲本选配的重要依据[5,6]。
本文旨在通过对海陆种间杂交各亲本不同性状配合力研究,为海陆杂种优势利用亲本选配提供依据。
纤维品质是棉花生产的重要目标, 海岛棉棉纤维具有长细强等突出特点, 是纺织高支精梳纱和特种织物不可缺少的原料[ 7] 。
国内外对陆地棉配合力的研究已有较多报道[ 8 ] , 但有关海岛棉品种间配合力的研究目前还很少, 通过对海岛棉产量与品质性状的配合力及遗传组分进行分析, 为明确海岛棉杂种优势的利用和新品种选育提供依据。
二．本课题所涉及的问题在国内外研究现状及分析看摘要配合力是自交系的一种内在属性，受多种基因效应支配，为自交系组配杂交种的一种潜在能力。
配合力分为一般配合力（GCA)和特殊配合力(SCA)。
一般配合力是指一个被测自交系和其它自交系组配的系列杂交组合的产量(或其它性状)的平均表现，由基因的加性效应决定，是可以遗传的部分。
因此，一般配合力的高低是由自交系所含的有利基因位点的多少决定的。
一个自交系所含的有利基因的位点越多，其一般配合力越高;否则，一般配合力越低。
特殊配合力是在特定的组合中的F1产最(或其它性状)与双亲的一般配合力平均数的差数。
配合力作为描述亲本材料性状遗传特征的重要遗传参数，是育种工作亲本选配的主要依据之一。
大多数高产的杂交组合的两个亲本系都具有较高的一般配合力，双亲间又有较高的特殊配合力。
杂种优势(Heterosis)是指用两个具有不同性状和特点的亲本杂交，所产生的杂种后代，在生活力、生长势、繁殖力、抗逆性或产量、品质、对不良环境的适应性等方面有超过其双亲的现象。
在作物杂种优势利用实践中，以杂种一代(F1)表现的杂种优势较为常见。
虽然杂种优势的表现可能是多方面的，但在作物育种实践中，主要以提高产量、改良品质、增强抗性和提高经济效益为主要目标。
如果亲本性状优良，组合选配得当，则有可能获得高优势杂交组合，其某些性状会明显优于亲本。
随着经济发展和纺织工业技术进步，人们对高档纺织品的需求日益增长，海岛棉（33-35㎜）和超级海岛棉（＞35㎜）占世界棉花总产份额从20世纪初的3%上升到20世纪末的6%左右。
我国改革开放以来海岛棉已从过去用于纺织少数特种产品拓展到衬衣、内衣等高档民用织物，这对提高我国纺织产品档次，增强行业竞争力发挥了重要的作用。
新疆塔里木盆地和吐鲁番盆地是我国一年生海岛棉的重要基地。
据新疆年鉴统计1960-2001年共生产65余万吨，其中80%以上供应国内纺织企业使用，基本满足特纺工业对海岛棉纤维的需求，80年代中期到90年代初国产海岛棉一度几乎完全替代进口海岛棉。
我国海岛棉生产规模起伏剧烈，多数年份种植面积在1.3万-2.0万公顷，总产0.5万-1.5万吨，分别占全国同期棉花种植面积的0.5%和总产的0.3%，虽在我国植棉业中占比重很小，但填补了我国原来不能生产海岛棉的空白，丰富了棉花种植业结构，也为当地农村经济的发展发挥了重要作用。
世界海岛棉年总产量60万-100万吨，我国仅占1.5-5.0%，与埃及和美国等海岛棉主要出口国相比，我国海岛棉市场供应价格较低，纤维质量总体水平低于埃及吉扎45、吉扎70等优质超级海岛棉，而优于美国比马棉，有一定的竞争优势[33、36-38]。
我国海岛棉在满足国内要求的同时，1983年开始向日本及东欧等地出口，最大年出口量达2.0万吨，并良好的声誉。
本研究通过对不同海岛棉品种（系）的杂交组合品质性状进行一般配合力和特殊配合力分析，对杂交亲本的利用价值和强优组合的筛选提供理论依三．对课题所涉及的任务要求及实现预期目标的可行性分析。
3.1对课题所涉及的任务要求看结果与讨论3.1.1小区设计：杂交组合F1代和F2代以及亲本按随机区组种植。
施肥，灌溉等田间作业同一般大田（在测定的对象田中进行调查）.3.1.2取样点：在每个重复及对照中随机取样6-7株，重复三次并设置一个对照（ck）进行对比，样本带回实验室。
3.1.3测定杂交组合的品质性状。
3.2实现预期目标的可行性分析课题组老师对杂交育种有多年丰富的育种经验和理论基础。
还有较为充足的经费支持，并查阅了许多相关资料。
育种实验室有与研究相关的一切设备，为完成课题提供强有力的技术支撑。
四．本课题需要重点研究的，关键的问题及解决的思路。
4.1本课题需要重点研究的，关键的问题。
看结果与讨论重点研究海岛棉主要品质性状的遗传规律。
海陆杂种早期生长发育速率快,长势壮。
苗期在株高、现蕾节位和地上部干物质方面都有明显的超亲优势,其现蕾、开花均比亲本[18 ] 。
但是,海陆杂种的铃期长,因而平均成熟期并不早,一般早熟性介于双亲之间,比陆地棉迟,比海岛棉早。
Percy 和Turcotte (1988) [21 ]指出,选择细长的比马棉类型与粗短的陆地棉纤维类型杂交可获得最佳的种间品质优势。
配合力是杂交亲本(自交系)的一种内在属性，因通常受多种基因效应支配，其农艺性状好的亲本不一定就是配合力高，只有配合力高的亲本才有可能产生高优势杂交组合，故配合力是亲本组配杂交种的一种潜在能力。
在选择高一般配合力的基础上再筛选高特殊配合力才“有可能获得最优良的杂交组合”。
同时，同一性状不同亲本的一般配合力不同，同一亲本不同性状的配合力也不相同;同一性状的特殊配合力效应因组合不同而有明显差异。
我们在亲本选择是必须处理好品质性状之间的关系，以达到性状之间协调发展。
4.2解决的思路选配合适的亲本是杂交育种的关键。
根据配合力大小来选配亲本可提高预见性，同时根据聚类分析的结果进行杂交组合组配，也可大大减少育种的盲目性，提高育种效率。
配合力尤其是特殊配合力是为了区别品种间配出强优势组合的能力而建立的概念在株型方面,选择紧凑或零式果枝陆地棉与海岛棉配组,并利用生长调节剂来控制种间杂种株型,效果明显。
海陆杂种的正反交组合存在差异。
刁光中,黄滋康(1961) [3 ]报道:海陆杂交组合以陆地棉为母本产量较高、成熟较早。
另据中棉所的试验结果,以陆地棉为母本的杂交组合比以海岛棉为母本的杂交组合籽棉增产2113 %、皮棉增产1818 %、霜前花增加1616 %。
在纤维品质上,以海岛棉为母本的组合在纤维长度、细度、强度方面较以陆地棉为母本的组合稍有提高,但差异未达显著水平。
6.1完成本课题的工作方案看实验设计6.1.1研究内容配合力是杂交亲本(自交系)的一种内在属性，因通常受多种基因效应支配，其农艺性状好的亲本不一定就是配合力高，只有配合力高的亲本才有可能产生高优势杂交组合，故配合力是亲本组配杂交种的一种潜在能力。
在选择高一般配合力的基础上再筛选高特殊配合力才‘有可能获得最优良的杂交组合’。
同时，同一性状不同亲本的一般配合力不同，同一亲本不同性状的配合力也不相同;同一性状的特殊配合力效应因组合不同而有明显差异。
我们在亲本选择是必须处理好品质性状之间的关系，以达到性状之间协调发展。
6.1.2研究方法1、对配制好的杂交组合F1代和F2代以及亲本按随机区组种植。
2、对种植的杂交组合及亲本进行生育期、形态性状观察测定。
3、配制海岛棉杂交组合。
4、测定杂交组合及亲本的产量性状性状。
6.1.3研究步骤1，查资料：去图书馆查了相关书刊，在网上阅读了相关的资料，了解了海岛棉的生长发育和关于配合力的分析及研究方法。
2，田间试验：试验在十团的试验地进行。
1）小区设计：杂交组合F1代和F2代以及亲本按随机区组种植。
施肥，灌溉等田间作业同一般大田（在测定的对象田中进行调查）.2)取样点：在每个重复及对照中随机取样6-7株，重复三次并设置一个对照（ck）进行对比，样本带回实验室。
【1】海岛棉产量与品质性状的配合力及遗传分析2. 1 配合力方差分析2. 2 各亲本的一般配合力分析2. 3 各组合F1 的正、反交的特殊配合力分析2. 4 基因型方差和遗传参数分析【2】陆地棉杂交组合品质性状杂种优势及配合力分析2．1 棉花杂交组合品质性状杂种优势分析2．2 杂交组合品质性状配合力分析2．2．1 各亲本品质性状配合力效应方差分析2．2．2 配合力效应分析2．3 配合力效应与亲本及杂交一代表现相关性分析【3】海岛棉产量性状的遗传效应分析2 1 海岛棉产量性状的遗传效应分析2 2 亲本遗传效应的预测2 3 杂交组合显性效应的预测值【4】棉花海陆种间杂交品质性状杂种优势及配合力分析2.1 海陆杂交种品质性状杂种优势分析2.1.1 海陆亲本的品质性状2.1.2 海陆杂交种品质性状竞争优势2.2 海陆杂交种品质性状的配合力分析从出生到死亡唯一能够一直陪伴我们的只有我们自己！！！不要生气、不要失望、不要欣喜若狂，一切都会过去的！！！。