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1/4N，其中N=识别序列的长度
3、同裂酶和同尾酶
▪ 来源不同但可以识别切割相同的DNA序列， 产生相同的末端，这样的酶称为同裂酶。如： Mbo I和Sau3A I（5`-GATC -3`）
▪ 来源不同，识别切割的序列也不同，但产生 相同的粘性末端，称为同尾酶。如Sal I （5`GTCGAC）和Xho I（5`-C TCGAG-3`）。
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III类限制性核酸内切酶：与Ⅰ类酶相似，既有 内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识 别序列周围25-30bp（24-26bp）范围内，酶促 反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。
II类限制性核酸内切酶：只由一条肽链构成， 仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识 别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用 最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提 到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。
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三、限制性核酸内切酶的分类
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断 核酸的情况不同，分为三类：
Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同亚基构成， 具有修饰酶活性和内切酶活性，它能识别和结合 于特定位点，随机切断识别位点以外的DNA序 列 ， 通 常 在 识 别 位 点 周 围 400-700bp （ 10005000bp）。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲 硫氨酸及ATP。
原核基因组中重复序列不多，真核中则存在大 量重复序列
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2、真核生物基因调控的特点
真核基因表达调控的环节更多 真核基因转录与染色质的结构变化相关 真核基因表达以正性调控为主
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第五章 DNA重组与基因工程
前言
基因工程属于生物技术范畴，生物技术 （biotechnology）不是一个独立的学科而是 一套技术或手段。广义的生物技术指任何利 用活的生物体或其一部分生产产品或改良生 物品质的技术；狭义的生物技术是专指以 DNA重组技术和单克隆技术为标志发展起来 的新技术。
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一般认为生物技术包括基因工程、细胞工程、 酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生 物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是 生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发 酵工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方 面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系， 其中基因工程和细胞融合技术最为突出。
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演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
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二、限制性核酸内切酶的命名
按酶的来源的属、种名而定，取属名的 第一个字母与种名的头两个字母组成的三 个斜体字母作略语表示；如有株名，再加 上一个字母，其后再按发现的先后写上罗 马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株 （Haemophilus influenzae d）中先后分离 到 3 种 限 制 酶 ， 则 分 别 命 名 为 HindⅠ 、 HindⅡ和HindⅢ。
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EcoR I
Hind II I
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切割产生的末端有三种情况：
➢ 3`粘性末端，Pst I， 5`-CTGCAG-3` ➢ 5`粘性末端，EcoR I，5`-GAATTC-3` ➢ 平末端，Sma I，5`-CCCGGG-3`
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2、识别序列频率
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第一节 工具酶
DNA重组技术中对核酸的“精雕细刻”主 要用酶作为工具。分子生物学研究过程中 发现的酶，许多都用作工具。限制性核酸 内切酶（restriction endonuclease）在重组 DNA技术中有重要地位，在此做详细介绍。
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在乳糖操纵元中，调控基因1ac I位于P邻近，有 其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因 群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成 的调控蛋白R，在环境没有乳糖存在的情况下，R 形成分子量为152000的活性四聚体，能特异地与 操纵子o紧密结合，从而阻止结构基因的转录；当 环境中有足够的乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷酶作 用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R的空间构 像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异 性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用， 使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。在 这过程中乳糖(实际起作用的是别乳糖)就是诱导 剂。
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5、终止子
终止子(terminator，T)是给予RNA聚合酶转 录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至 少在结构基因群最后一个基因的后面有一个 终止子。
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说明：
在没有乳糖存在的情况下，乳糖操纵元并非完 全停止，还存在着本底组成型合成（background constitutive synthesis）。因为阻遏蛋白和操纵子 的结合并不是完全牢固的。也就是说，即使没有 乳糖存在，也会有少数几个结构基因群得以合成， 一旦有乳糖或者类似物存在，马上可以利用。
6、其他常用酶：甲基化酶、拓扑异构酶I、SSB
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二、限制性核酸内切酶的概念
很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分 解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸 内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同 时又伴随有特定的核酸修饰酶。最常见的是甲基 化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化, 从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的 甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞 就构成了限制--修饰体系。其功能就是保护自身的 DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信 息的稳定,这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。 这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概 念的由来。
一、工具酶种类
1、限制性内切酶：分I、II、III 三种
2、连接酶：DNA连接酶、 RNA连接酶
3、聚合酶：DNA聚合酶、RNA聚合酶
4、激酶、磷酸酶：碱性磷酸酶、T4多核苷酸激酶
5、核酸酶：核酸外切酶、核酸内切酶（S1）、脱 氧核糖核酸酶（DNaseI）、核糖核酸酶（RNase A、RNaseH、RNaseT1）
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四、真核生物的基因调控
1、真核生物基因组的特点
真核基因组比原核基因组大得多
真核生物主要的遗传物质在核膜内，核外还有 遗传成分，增加了调控的层次和复杂性
原核基本是单倍体，而真核是二倍体
原核编码序列绝大多数是连续的，而真核绝大 多数是不连续的
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X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一 种人工化学合成的半乳糖苷，可被β-半乳糖苷 酶水解产生兰色化合物，因此可以用作β-半乳 糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal被广泛应 用在基因工程的工作中。
这些替代物都不是真正的酶的底物，所以称 为安慰性诱导物（gratuitous inducer）。
和阻遏蛋白结合的是别乳糖，而不是乳糖。
β-半乳糖苷酶
乳糖+H2O
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别乳糖 葡萄糖+半乳糖
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事例
在研究诱导作用时，并不真正用乳糖进行，因为 它会被催化降解。实际上用的是一些化学合成的 乳糖类似物，例如异丙基硫代半乳糖苷 (isopropylthiogalactoside, IPTG)。它不受β-半乳糖 苷酶的催化分解，不被细胞代谢而十分稳定，但 能与R特异性结合，使R构象变化，诱导1ac操纵元 的开放。是很强的诱导剂。还有巯甲基半乳糖苷 （TMG）。
蛋白质工程则是在基因工程基础上综合蛋白质 化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识 和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意 愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称 为第二代基因工程。
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一般来说，基因工程是指在体外将核酸分子插 入质粒、病毒或其它的载体当中，形成遗传物 质的重新组合，使之进入到寄主细胞内，并且 在寄主细胞当中可以持续稳定地繁殖。基因工 程又叫做基因重组，DNA重组技术。
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四、限制性核酸内切酶的作用
1、切割方式
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具 有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’ 磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内 切酶识别和切割的特异性不同。
5`…GAATTC…3` 3`…CTTAAG…5`
5`…AAGCTT…3` 3`…TTCGAA…5`