分子生物学进化技术

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总 体 技 术 路 线

蛋白质工程
(Protein engineering)
实验应用:点突变体,组成型激活的突 变体,截短体等
定义:
在X衍射和晶体分析术了解蛋白质三维 空间结构和功能关系基础上,
借用计算机和分子设计辅助技术, 在DNA分 子水平上操作更换或改变其序列,
达到改变蛋白质分子氨基酸序列, 实现人为 改变蛋白质分子形状及功能, 使之具有新遗传
1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙 处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年 S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质 粒DNA。
琼脂糖凝胶电泳
1960s发明了琼脂糖凝胶电泳,可将不同 长度的DNA分离开。
DNA测序技术
•1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明 了DNA快速测序技术。
DNA Shuffling的内涵
DNA Shuffling:指DNA分子的体外重
组,是基因在分子水平上进行有性重组 (Sexual Recombination)。通过改变单 个基因(或基因家族,gene family)原有 的核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达 产物以新功能。
DNA Shuffling与常规定向进化的比较
核心:
蛋白质空间结构, DNA重组, 人工定向改 造蛋白质功能域构象, 使得功能改变。 这被称为是生物技术发展的第二浪, 如通过 增加或减少人工二硫键、置换氨基酸等修饰 技术, 提高或改变活性多肽 (激素、酶、细胞 因子)
分子进化工程
分子进化工程(molecular evolution engineering)是继蛋 白质工程之后的第三代工程,是达尔文的进化论在现代 科学研究领域中核酸、小分子多肽或蛋白质以及其它有 机物分子水平上的应用。
项目 进化速度 进化对象 进化 影响对象 突变效率 周期
常规定 向进化
缓慢进化 整个基因组
多年 完整基因组

DNA 快速进化 Shuffling
特定基因/ 操纵子/病毒
几天
部分基因组

DNA重组装原理图 (DNA shuffling)
1. DNaseI产生随机片段;2. 随机片段变性;3. 随机片段复性; 4. 延伸 反复重复2-4步后,可获得全长DNA片段
遗传密码
基因
转录
翻译
蛋白质三维结构
线性多肽链 (无功能活性)
生命活动的分子基础
❖ (4)中心法则和遗传密码
1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”
DNA
RNA
Protein
1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码
• (1). 限制性内切酶(restriction enzymes)
•细菌限制修饰系统的发现
W 型H嗜限e.rO血制n.杆Se酶mr菌i。At(hr和Hb.Weinrilf于oluxe1于n9z1a69e72)0-年1中9首发6次现8从年并流分发感离现,1968年分离到I
HindII限制酶。
•限制酶HindII的发现
Hin.fOl1u.9Se7mn8年ziatNheo)b和e中lW 生发理ilo或现x医并于学分1奖9离70H年in首dI次I限从制流酶感。嗜血杆菌(H.
基因工程的主要内容或步骤: 1. 从生物有机体基因组中,分离 出带有目的基因的DNA片段。 2. 将带有目的基因的外源DNA片 段连接到能够自我复制的并具有 选择记号的载体分子上,形成重 组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的 受体细胞(亦称寄主细胞)并与 之一起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中,筛 选出获得了重组DNA分子的受体 细胞,并筛选出已经得到扩增的 目的基因。 5. 将目的基因克隆到表达载体上, 导入寄主细胞,使之在新的遗传 背景下实现功能表达,产生出人 类所需要的物质。
Directed Evolution Targeted selection of created mutations
What happens after DNA shuffling
➢ Generation of a large library of novel genes (chimeras) ➢ Selection for improved/desired bio-functions
❖ 新基因的理性设计和人工合成
根据已有基因的序列和功能进行设计
❖ 基因的直接进化(directed
evolution) 可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题
基因直接进化的步骤
❖突变
基因突变库的建立
❖筛选
基因突变库的活体或离体筛选
❖基因复制与遗传
建立基因突变库的方法
③ 能源、资源问题: 生物电池、光合菌、乙醇生 产、石油采集菌、生物冶炼。
④ 环境污染: 石油、污水, 有害金属污染, 特嗜 菌的构建。
⑤ 医疗保健: 抗衰老、防治心血管病、疟疾、传 染病、遗传病(见下)。
⑥ 战争等灾害:生物战剂、生物恐怖。
获取新基因的方法
❖ 常规的基因工程方法
已知的生物、基因和功能
基因工程实验指导 一、质粒DNA的提取 二、琼脂糖凝胶电泳检测DNA 三、PCR扩增DNA片段 四、质粒DNA的酶切 五、试剂盒回收目的DNA片段 六、大肠杆菌感受态细胞的制备 七、DNA重组及重组质粒转化大肠杆菌 八、重组子的检出 九、SDS-PAGE检测外源蛋白

目的基因
基因载体

பைடு நூலகம்

重组体
转 筛
(1866~1945)
❖ (2) DNA是遗传物质 a、肺炎双球菌转化实验
b、噬菌体转染实验
1944年 Avery,确定了基因的分 1952年Alfred Hershy和Marsha 子载体是DNA,而不是蛋白质。 Chase进一步证明遗传物质是DNA。
1953年Watson 和Crick的DNA双螺旋学说破 天荒地用分子结构的特征解释生命现象的最基本 问题之一——基因复制的机理
❖ 进化结果:
基因多样性:为完成同一功能所表现出的----多个基因或同一个基因(同源性)
代谢途径的多样性:同样产物,多条途径 (如木糖 木酮糖)
代谢产物的多样性:同一底物,不同产物 生物多样性
人类对自然界的要求 认识——利用——再造——改造 ——创造
基因工程 分子克隆,转基因,基因敲除 自然界存在的基因产物
(1822-1884)
35年之后,即1900年才被荷兰的H.De Vries 、 德国的C.Correns 和奥地利 E.Tschermak等植 物学家重新发现。
❖ 1909,丹麦 W.Johannsen(约翰逊)根 据希腊文 “给予生命”之义创造了基
1857~1927因(gene)一词 1910, 美国T.H.Morgan(摩尔 根)创立了遗传的染色体理论
❖ PCR方法
1)易错PCR法 2)随机引物延伸法
❖ DNA重组装(DNA Shuffling)方法
1)外显子、单基因和基因家族的重组装 2)随机多重组PCR法(RM-PCR)
❖ 随机片段活体突变法
线状基因和随机片段共转化酵母细胞
易错PCR方法
Random-priming recombination(RPR)








交错延伸PCR突变法
DNA Shuffling技术
DNA Shuffling
DNA改组 DNA洗牌 DNA搅乱重排
1994年,Stemmer等,用DNA Shuffling技术体 外快速进化蛋白——有性PCR法
1997年 ,France Aronld研究组将DNA Shuffling技术做了改进——交错延伸法
抗结核菌药物:链霉素、雷米封、利福平 H1N1甲型流感病毒:耐药性及疫苗研制 工程酶分子改造:荧光蛋白基因、β-半乳糖苷酶
基因、头孢菌素酶
超级干扰素 、IL-1β
为解决人类面临的重大问题提供新途径, 带来了希望 (国外称之为六大危机):
① 人口问题: A) 节育: 药、疫苗, B)优生: 遗传病基因治疗。 ② 粮食问题: 绿色革命,高产、优质、抗病新品种 , 单细胞蛋白, 农药、肥料。
通过人工合成或生物表达手段人为制造大量突变,按 照研究需要和目的进行筛选,实现试管中分子水平上的 模拟进化。
分子进化工程包含了三个连续往复的化学过程,即扩 增、突变和选择。三个过程紧密相连,使那些被选择的 分子不断扩增,并不断引进变异,进而进行新的选择。
分子进化工程的种类
分子进化工程的应用
生物制药、疫苗研制、基因治疗、农业、石 油化工、生物治疗、兽药研究、营养、生 物武器的研究等
How DNA shuffling works - 2
Single gene shuffling
. .. . ....... library of point mutants
Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis
蛋白质工程 满足需求的蛋白分子如突变体等 可以创造出自然界不存在的蛋白
分子进化工程 表面展示,SELEX技术 通量定向筛选满足需要的分子
基因工程 (Gene engineering)
❖ 狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体 (供体)的基因与载体在体外进行拼接,然后转 入另一种生物体(受体)内,使之按照人们的意 愿遗传并表达出新的性状。又称DNA重组技术。
多重组和随机多重组PCR原理图
RM-PCR法构建 随机重组装库(A)和剪接库(B)
How DNA shuffling works - 1
How DNA shuffling is done in the tube
❖ Random fragmentation of a pool of related genes; ❖ Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers); ❖ PCR amplification with primers of reassembled products
•SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
H.O.Smith
D.Natha(2n)s. (DN19A7连1接年酶)(用lHigiansdeI)I绘制SV40的限制酶谱。
1967年发现了DNA连接酶。
载体(vector)
1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬 菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。
感受态体系
Family gene shuffling library of chimeras
分子直接进化技术
生化与分子生物学研究室 铁轶
进化含有连续变化的意思,而这种变
化又带有定向的成分,进化即朝一定方向 变化的趋势。
生物从共同祖先由低级到高级,由简
单到复杂逐步分化演变的过程叫进化 (evolution)。
生物进化
生物的自然进化
❖ 进化过程:
突变→自然选择→遗传后代
DNA Shuffling的内涵
What is DNA shuffling?
Darwinian Evolution Natural selection of existing mutations
❖ crossovers, ❖ deletions, ❖ insertions, ❖ inversions, ❖ point mutations
❖ 广义上讲,基因工程是指重组DNA技术的产业化设 计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部 分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设 计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及 到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物 的分离纯化过程。
(1)遗传因子
Gregor Mendel于1865年在“布隆自然历史学会”上宣读 了他的《植物杂交实验》论文,并于1866年发表于该会 的会议录上。
Paul Berg的开创性实验
•1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组 实验:将SV40的DNA片断与 噬菌体的DNA片断连接起来。
1980年Nobel化学奖
Boyer-Cohen实验
1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将携带卡那霉素抗 性基因的大肠杆菌质粒与携带 四环素抗性基因的另一种大肠 杆菌质粒pSC101连接成重组 质粒,具有双重抗药性。
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