影响测定反相高效液相色谱流动相pH值的因素

９６
Modem Scientific Instruments 2005 1
４ 小 结
要准确调节流动相 ｐ Ｈ 值必须注意以下几点： １） 不能忽略 ２．４．２ 步骤，要仔细测好溶液温度，将 温度电位器调节好。 ２ ）由于高效液相色谱对流动相溶液的要求很严， 要求每次在配制流动相时的用水都必须是当天新鲜制 备的双蒸水（水的质量是至关重要的，否则会给后面的 色谱分离带来干扰）。刚烧好的双蒸水水温较高，一般 会达到 ４５℃，如果未让它冷却到室温就调节流动相 ｐＨ 值，会造成流动相 ｐ Ｈ 值的较大偏离，从而导致整个 色谱分析实验的偏差甚至失败。因此，刚烧好的双蒸 水一定要冷却到室温后再进行 ｐ Ｈ 值的调节。 ３）复合电极经较长时间使用，如发现仪器反应迟钝， 测量数字长时间飘移，不能稳定测量，一般情况很可能是 电极老化， 须更换新电极。它的使用寿命一般为一年。
柱 温：３０℃； 检测器：二极管阵列检测器； 检测波长：２１４ｎｍ； 流动相：０．４ｍｏＬ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４ 溶液，Ｈ３ＰＯ４ 调 ｐＨ 值至 ２．４。 在上述色谱条件下九种有机酸得到有效分离（见图 ２）。 ２．４ 流动相 ｐＨ 值调节 １） 酸度计电极插拔去 Ｑ９ 短路插；接上复合电极， 用蒸馏水冲洗电极，然后浸入邻苯二甲酸氢钾缓冲溶 液（ＧＲ 邻苯二甲酸氢钾 ２．５５ 克，溶解于 ２５０ｍＬ 的重蒸 馏水中）。 ２） 将“斜率”电位器顺时针旋到底，“选择”开 关置“Ｔ ”，将“温度”电位器调到数显所显示的温度 值为实测的溶液温度值。 ３） 再将“选择”开关置“ｐＨ”档，调节“定位” 电位器，使数显所显示的 ｐ Ｈ 值为该温度下缓冲溶液 的标准值（见表 １），仪器标定结束，此时“定位”等 各个旋扭就都不能动了。
温度对 ｐ Ｈ 值测定结果的影响 温 度 ℃ ５．０ １０．０ １５．０ ２０．０ ２１．４ ２５．０ ３０．０ ３５．０ ４０．０ ４５．０ ５０．０ ５５．０ ６０．０ ｐ Ｈ 值 ２．１５ ２．２３ ２．３１ ２．３８ ２．４０ ２．４６ ２．５３ ２．６０ ２．６６ ２．７３ ２．７９ ２．８５ ２．９１
图 １ ｐ Ｈ 值为 ２ ． ２ ０ 时，９ 种有机酸的色谱图
图 ２ ｐＨ 值为 ２．４０ 时， ９ 种有机酸的பைடு நூலகம்谱图
３ ． ２ 影响调节流动相 ｐ Ｈ 值的因素 ３．２．１ “温度”电位器的调节对 ｐＨ 值测定结果的影响
文中 ２．４．２）步骤，是准确测定 ｐＨ 值的非常关键的 环节。我们考察了某一流动相的实测温度值为 ２１．４℃， 按照 ２．４ 步骤测得的 ｐＨ 值为 ２．４０。调节“温度”电位 器，使数显所显示的温度值分别为 ５．０、１０．０、１５．０、２０． ０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、５５．０、６０．０℃时， 测定相应的 ｐ Ｈ 值，测定结果见表 ２ 。
４） 在使用中，勿将复合电极顶部接触烧杯底部或其 它硬物，不使用时，应装在盛有 ３ｍｏＬＬ－１ＫＣＬ 溶液的塑料 套中。
５ ）仪器应避免在湿度较大的环境中使用。
参考文献
［１］ 郭根和，潘葳，苏德森，饶秋华，何志刚，陈涵贞． 反相高效液相色谱法测 定枇杷中的有机酸，福建农业学报，２００５，（已通过审稿 待发表）
流动相溶液温度（ ℃） ５．０ １０．０ １５．０ ２０．０ ２５．０ ３０．０ ３５．０ ４０．０ ４５．０ ５０．０ ５５．０ ６０．０
流动相 Ａ 实测 ｐ Ｈ 值 ２．２３ ２．２９ ２．２１ ２．１２ ２．０７ ２．０２ １．９６ １．９１ １．８６ １．８０ １．７５ １．７０
流动相 Ｂ 实测 ｐ Ｈ 值 ２．６１ ２．５２ ２．４８ ２．４０ ２．３８ ２．３２ ２．２８ ２．２４ ２．２０ ２．１５ ２．１１ ２．０７
３ 结果和讨论
３．１ 流动相 ｐＨ 值对九种有机酸测定结果的影响 磷酸盐缓冲液系统是在十八烷基柱中应用最广
的流动相，适于分析有机酸。本实验采用磷酸二氢钾 缓冲溶液作为流动相，考察了不同 ｐ Ｈ 值对有机酸分 析影响的试验，考察了 ２．２、２．４、２．５、２．６、２．８、３．０ 这 ６ 种 ｐＨ 的流动相，发现流动相的 ｐＨ 值对有机酸保留时 间的影响很大， 不同 ｐＨ 值下的有机酸的保留时间都不 同， ｐＨ 值为 ２．２０ 时，九种有机酸中丙酮酸与苹果酸、 乳酸与乙酸、柠檬酸与琥珀酸的色谱峰无法有效分离 （见图 １）；ｐＨ 值为 ２．４０ 时九种有机酸得到有效分离，且 峰形理想（见图 ２）；ｐＨ 值为＞ ２．６０ 时有机酸的分离不 够理想，且九种有机酸出峰的先后顺序会发生颠倒， 峰形也不理想。
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｔａｋｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ ｎｉｎｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ＲＰ－ＨＰＬＣ ａｓ ａｎ ｅｘａｍｐｌｅ ｔｏ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ｒｅｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｎｉｎｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ｃａｎ ｂｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｈａｐｅ ｏｆ ｐｅａｋ ｉｓ ｉｄｅａｌ ｗｈｅｎ ｐＨ＝２．４０， ｗｈｉｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｈａｖｅ ｇｒｅａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ． Ｔｈｅｙ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｃｈａｎｇｅ ｔｈｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｆａｉｌｉｎｇ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｔｈｅ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＲＰ－ＨＰＬＣ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｉｓ ｖｉｔａｌ ｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ， ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｈｅｌｐ ｕｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｏｕｒ ａｃｃｕｒａｃｙ ｉｎ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｗｏｒｋ．
收稿日期：２ ０ ０ ４ － １ ２ 作者简介：宋永康，男，１ ９ ６ ３ 年生，现为福建农业科学院实验师。 现代科学仪器 ２００５ １ ９５
［２］ 于世林． 高效液相色谱方法及应用，北京：化学工业出版社，２０００．８５ ［３］ 赵景婵，郭治安，常建华等．有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分
在室温下，实测得流动相 Ａ、Ｂ 溶液温度为 ２０．０℃， 按文中 ２．４ 步骤测定得到流动相 Ａ、Ｂ 的实测 ｐＨ 值分 别是：２．１２、２．４０。改变流动相 Ａ 和 Ｂ 的温度，不再调 节“温度”电位器，按文中 ２．４．４）步骤测定不同温度下 流动相的 ｐＨ 值，结果见表 ３。从表 ３ 可以看出温度对 ｐＨ 值的影响很大，例如：流动相溶液温度为 ４５．０℃时， 流动相 Ａ、Ｂ 的实测 ｐＨ 值分别是：１．８６、２．２０，与 ２０．０ ℃时偏差分别为 ０．２６、０．２０。从图 １、图 ２ 可以看到如 此大的偏差对色谱分离结果的影响是相当大的。
关键词 反相高效液相色谱；ｐＨ 值；酸度计 中图分类号 Ｏ６５７．７
The Factors of Affecting Determining pH Value of RP-HPLC Mobile Phase
Song Yongkang, Guo Jia, Pan Wei (Central Laboratory, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China)
表 １ 溶液 ｐ Ｈ 值与温度关系对照表 温度℃ ５ １０ １５ ２０ ２５ ３０ ３５ ４０ ４５ ５０ ５５ ６０ ｐ Ｈ 值 ４．０１ ４．００ ４．００ ４．０１ ４．０１ ４．０２ ４．０３ ４．０４ ４．０５ ４．０６ ４．０８ ４．１０
４） 将酸度计复合电极插入未知的被测溶液进行测量。
影响测定反相高效液相色谱流动相 ｐ Ｈ 值的因素
宋永康 郭 嘉 潘 葳 （福建省农业科学院中心实验室 福州 ３５０００３）
E-mail:songlibby@sohu.com
摘 要 以采用反相高效液相色谱法测定九种有机酸为例，探讨了流动相 ｐ Ｈ 值对分析结果的影响。实验结果表 明 ｐＨ＝２．４０ 时，九种有机酸得到有效分离，且峰形理想，而不同 ｐＨ 值对分析结果影响很大，不仅会大大改变各有机 酸的保留值，甚至会导致无法将各有机酸分离。本文分析了影响测定流动相 ｐ Ｈ 值的因素。
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； ｐＨ ｖａｌｕｅ； ａｃｉｄｉｍｅｔｅｒ
１ 引 言
应用反相高效液相色谱（ＲＰ－ＨＰＬＣ） 进行分析测定 时，常常采用离子抑制法即向含水流动相中加入酸、 碱或缓冲溶液等改性剂，以使流动相的 ｐ Ｈ 值控制一 定数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰 形，以提高分离的选择性［１］。例如在分析有机弱酸时， 常向流动相中加入磷酸（或乙酸、三氯乙酸、１％ 的甲 酸、硫酸），就可抑制溶质的离子化，获对称的色谱峰。 对于弱碱性样品，向流动相中加入 １ ％ 的三乙胺，也 可达到相同的效果［２￣６］。 虽然 ＲＰＣ 方法建立时最好选用 ｐＨ 微小改变不影响分离的流动相，但 ｐＨ 值的较大变 化往往会对分析结果产生很大影响，因此流动相 ｐＨ 值 的调节是分析过程中至关重要的一个环节，本文以反 相高效液相色谱法测定九种有机酸为例考察了不同流 动相 ｐ Ｈ 值对分析结果的影响，指出准确调节流动相 ｐ Ｈ 值的关键所在，有助于提高分析结果的准确性。
从表 ２ 可以看出“温度”电位器数显所显示的温 度值每相差 ５．０℃，测得的 ｐＨ 值则相差 ０．０６～０．０８，因 此准确调节“温度”电位器是非常重要的。 ３．２．２ 流动相溶液不同温度对 ｐＨ 值测定结果的影响
我们考察了不同温度的流动相溶液对 ｐ Ｈ 值的影 响：
表 ３ 流动相溶液不同温度对 ｐ Ｈ 值的影响
２ 实验部分
２ ． １ 仪器
仪器：ＰＨＳ－３Ｃ数字式酸度计，Ｗａｔｅｒｓ ２６９５型高效液 相色谱仪，Ｗａｔｅｒｓ ２９９６ 二极管阵列检测器， Ｅｍｐｏｗｅｒ 色谱工作站，超声波清洗器， ＸＷ－８０Ａ 旋涡混合器，微 量可调移液器。 ２．２ 试剂
磷酸、磷酸二氢钾、有机酸标准品均为分析纯。 ０．０４ｍｏＬ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４－Ｈ３ＰＯ４缓冲溶液：称取分析纯磷酸 二氢钾 ５．４４ｇ，用水溶解并定容至 １０００ｍＬ，用磷酸调至 ｐＨ２．４。然后用 ０．４５ μｍ 水相滤膜过滤，再经超声波脱 气后用作流动相。 九种有机酸标准溶液的配制：分别准确地称取草 酸 ３００ｍｇ，酒石酸 ７００ ｍｇ，丙酮酸 ２０ ｍｇ，苹果酸 １ｇ， 柠檬酸 ２ｇ，琥珀酸 ６ｇ，富马酸 ３０ ｍｇ，乳酸 ５ｇ，乙酸 ５ｇ，置于 １００ｍＬ 棕色容量瓶中，用流动相溶液溶解并 定容至刻度。上述溶液经不同浓度稀释后，上机并绘 制各种有机酸的标准曲线。溶液用前经 ０．４５ μ ｍ 样品 过滤器过滤． 配制试剂所用的水均为二次蒸馏水。 ２ ． ３ 色谱分析条件 色谱柱：μＢｏｎｄａｐａｋＴＭ Ｃ１８ ３．９ｍｍ（ｉ．ｄ．）× ３００ｍｍ， １０ μｍ （Ｗａｔｅｒｓ）； 流 速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；