生物制药工艺学实验
《生物制药工艺学》教学实践论文
浅谈《生物制药工艺学》的教学探索与实践摘要：生物制药工艺学是生物技术制药、制药工程等专业的重要专业课，是一门生命科学和工程技术理论与实践紧密结合的综合性制药工程学科。
笔者结合近几年的教学实践，从生物制药工艺学的教学方法、教学手段和实验教学几个方面进行了总结。
关键词：生物制药工艺学教学方法实践教学中图分类号：g633.91文献标识码：a 文章编号：1673-9795(2012)01(b)-0000-00生物制药工艺学是生物技术制药、制药工程等专业的重要专业课，是从事各类生物药物的研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。
该门课程的教学重点在于各类生物药物的制造原理以及操作工艺过程 [1]。
笔者结合近几年的教学实践，从生物制药工艺学的教学方法、教学手段和实验教学几个方面进行了总结。
1 改进教学方法，提高教学质量为了加强生物制药工艺学的教学效果，我们在课堂上常采用启发式教学法来实现教与学的互动，活跃课堂气氛，充分调动学生的学习积极性，培养学生分析问题和解决问题的能力。
所以我们在备课时，须根据教学内容的系统性和学生的认知状态认真备问，设计一些有启发性的问题、有承前启后作用的问题，或设计能体现教学重点难点的问题。
然后在课堂上适时提问，鼓励学生认真思索、相互讨论，请同学大胆发言，老师再对答案加以补充或修改，这样能唤起学生的学习兴趣和主动学习的愿望。
例如在氨基酸类药物生产方法的教学中，上课时播放制药厂车间生产某种氨基酸药物的电教片，其中展示了生产氨基酸药物的反应罐、工业用离心机、干燥装置等各种加工装置及整个加工过程，学生看完后会产生强烈的兴趣，然后给学生提出问题：电教片里播放的反应罐是用来干什么的？为什么加工氨基酸类药物要采用这样的工艺过程？是否可以采用别的生产方法？有什么理论根据？这些问题都需要学生将所学的知识前后联系起来，进行综合分析，才能得出相应的结论。
这样能充分激发学生的思维活动，引导学生自发地对以前学过的知识进行回顾和总结，引导学生从不同角度去分析解决问题，同时还可以提高学生的语言表达能力，这种方法还可使学生对这节课的教学内容有清晰深刻的印象，从而达到理想的教学效果。
《生物制药技术》实验
《生物制药技术》实验指导实验一金霉素链霉菌培养基的制备（验证型）实验目的：1、学会培养基的配制2、掌握灭菌方法。
实验原理：金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦称“金色链霉菌”，放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。
在固体培养基上产生金色色素，故名。
其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3～5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。
菌落开始为白色，长孢子后变青色。
在显微镜下可以看到短杆状的菌丝。
抗菌素工业上用以生产金霉素。
放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。
放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。
多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。
放线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。
因其生长具辐射状，故名放线菌。
放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。
但其菌落较小而致密，不易挑取。
不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病；有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶；有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。
四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制取的一类广谱抗生素。
抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。
品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。
器材：1ml移液枪；铝锅；电炉试剂：NaBr母液（100 g／L）KCl母液（100 g／L）M-促进剂母液（2.5 g／L）实验步骤：1．种子培养基种子培养基(g／L)：可溶性淀粉40，黄豆饼粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO34，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。
制药工艺实验讲义(改革)1
生物制药工艺实验讲义范一文吴晓英目录实验一庆大霉素的液体发酵 (1)实验二离子交换法分离提取庆大霉素 (4)实验一庆大霉素的液体发酵一、实验目的：学习利用液体发酵法制备庆大霉素的原理和操作方法。
二、实验原理：庆大霉素是由放线菌属小单孢菌发酵产生的氨基糖苷类广谱抗生素，对多种革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、沙门氏菌等)和金黄色葡萄球菌(包括β-内酰胺酶菌株)具有抗菌作用，在临床上具有广泛的应用。
本实验以紫色小单孢菌作为生产菌株，通过斜面孢子培养、种子液培养、发酵液培养，在优化的发酵条件下发酵生产庆大霉素。
该实验中，庆大霉素的含量测定采用的是磷钨酸钠紫外分光光度法。
磷钨酸钠溶液在紫外光谱的范围内有明显的吸收峰，而且其溶液的浓度在一定的范围内与其吸光度呈线性关系。
当把庆大霉素与已知过量的磷钨酸钠混合后，庆大霉素与磷钨酸钠发生反应生成白色沉淀，滤去沉淀测定其滤液的吸光度，可得未反应的磷钨酸钠量，从而确定庆大霉素的含量，建立标准曲线。
测定发酵液与磷钨酸钠反应后的滤液吸光度，则可从标准曲线上确定发酵液庆大霉素的含量。
三、实验材料与仪器1. 菌种：紫色小单孢菌、短小芽孢杆菌2. 培养基：（1）斜面培养基：高氏合成一号琼脂培养基。
（2）种子培养基（g/100ml)：可溶性淀粉 1.5，葡萄糖 0.5，蛋白胨 0.5，酵母粉 0.5，(NH4)2SO40.05，K2HPO4.3H2O 0.05，NaCl 0.05，MgSO4.7H2O 0.05，CaCO30.1，pH7.5， 121℃灭菌20min备用。
（3）发酵培养基（g/100ml)：可溶性淀粉 5.5，葡萄糖 0.5，黄豆饼粉 3.5，玉米粉 0.5，蛋白胨 0.3， KNO3 0.05，(NH4)2SO40.05，CaCO30.5，CoCl20.0006，甘氨酸 0.01，蛋氨酸 0.02，赖氨酸 0.015，酪氨酸 0.01,pH7.2， 121℃灭菌20min备用。
生物制药工艺试验
取 a 液 85mL 和 b 液 15mL 混匀，即得 pH＝7.5 磷酸盐缓冲溶液。 3、供试液的制备与测定：准确吸取待测溶液 1mL，将其稀释 1～25 倍，再 从稀释液中准确吸取 1mL，注入 25mL 的容量瓶中，加水 4mL 和酒石酸亚铁溶 液 5mL，充分混合，再加 pH＝7.5 的磷酸盐缓冲溶液至刻度，用 1cm 比色杯， 在波长 540nm 处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度。
双水相
生物制药工艺学实验报告——摸索双水相萃取酵母蔗糖酶的条件【实验目的】了解双水相萃取的原理；掌握蔗糖酶比活力测定的原理和方法。
【实验原理】一、双水相萃取1.定义：某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相系统。
溶液的分相不一定依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相（即双水相系统）甚至多相。
于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。
在这两相中水分都占很大比例，活性蛋白质或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了溶剂萃取中蛋白质容易失活和强亲水性蛋白质难溶于有机溶剂的问题。
对聚合物而言，由于相对分子质量较大，分子间作用力也较大；高聚物与高聚物形成两相是由于高聚物的不相溶性，聚合物分子量越高，相分离所需浓度越低；高聚物与无机盐溶液也能形成两相是由于盐析作用，盐浓度越高，越易分相。
2.相图：两水相的形成条件和定量关系，常用相图来表示，它是一条双结点线。
系线的长度是衡量两相间差别的尺度，系线越长两相间的性质差别越大，反之则越小。
系线的长度反映了两相密度的差异，两相密度差随着系线长度的增加而增加，相分离加快，但远离临界点的聚合物浓度高，粘度大，也会导致相分离困难，所以在中间组成时，分离速度最佳。
3.影响分配系数的主要因素：聚合物的相对分子质量：在聚合物浓度不变的前提下，当聚合物相对分子质量降低时，其疏水性下降，亲水性蛋白质易分配于富含该聚合物的相中。
聚合物的浓度：当双水相系统的总浓度增大时，两相性质的差别增大，蛋白质趋向一侧分配。
盐类的影响：盐的浓度影响蛋白质疏水性。
4.双水相萃取的优点：双水相系统含水量高，聚合物对蛋白质有稳定作用，为生物活性物质提供了温和的分离环境。
双水相系统界面张力低，蛋白质在两相间达到分配平衡时间短，重现性很好，故可直接放大。
二、蔗糖酶活力测定原理：蔗糖酶可作用于β－1，2糖苷键，将蔗糖水解为D－葡萄糖和D－果糖。
生物制药工艺学实验教学大纲
（供制药专业使用）
课程总学时数：184实验学时数50
面向专业（层次）：制药工程专业
应开实验时间：三年级第一、二学期
实验类别：专业
一、实验教学目标与基本要求
生物制药工艺学实验的主要目标是使学生掌握生物制药工艺学实验的基本技能，学会生物大分子化合物的提取制备、分离提纯与分析鉴定的方法；培养并强化学生的专业技能和专业素质，同时培养学生严谨的科学态度和良好的实验习惯。通过实验，增强学生对生物制药工艺学专业知识的理解、运用和运用所学理论解决实际问题的能力。
2、掌握SDS-PAGE电泳的基本原理和应用；
3、学习SDS-PAGE电泳操作方法：注意电泳槽的安装和胶配制；
4、学习电泳图谱的绘制和目的蛋白条带相对分子质量的分析。
综合
10
9
低分子量肝素的制备与测定
1、了解化学裂解法制备低分子量肝素的过程；
2、掌握乙醇沉淀法的基本操作及注意事项；
3、掌握生色底物法测定低分子量肝素活性的原理与方法。
综合
18
10
酵母RNA的制备和单核苷酸的分离
1、掌握利用稀碱法从酵母提取RNA的原理和操作技术；
2、掌握利用离子交换法分离单核苷酸的原理和操作技术。
综合
18
11
天然生物活性物质的发现研究
1、掌握多肽、蛋白质或多糖类物质的提取、分离、纯化的一般手段与方法；
2、掌握多肽、蛋白质或多糖类物质纯度检定的方法；
5、学习旋转蒸馏装置安装、检漏和拆卸。
综合
12
5
从黄连中提取黄连素
1、通过从黄连中提取黄连素，掌握回流提取的方法；
2、比较索氏提取器与回流提取器的优异点。
综合
教学课件 生物制药工艺学实验--张茵
树脂的预处理
1. 物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒； 2. 化学处理： ✓ 阳离子树脂 酸—碱—酸（氢型）； 碱—酸—碱（钠型）
树脂的再生
• 钠型阳树脂可用2~3M NaCl溶液再生； • 氢型阳树脂用强酸再生，如盐酸。 • 若有强吸附物则可用0.1N NaOH溶液洗树脂；若有脂溶
实验步骤
• 装填离子交换层析柱（重力沉降法） 1.固定层析柱，保持层析柱垂直； 2.将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，
当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱 下端的塑料管夹紧； 3.用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开 下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水 面高于树脂表面约2cm。 注意事项：
生物制药工艺学实验
南京师范大学生命科学学院
2015年3月
从蛋清中提取溶菌酶
实验流程
• 柱层析前的准备工作 • 离子交换层析法从蛋清中初步提取溶菌酶 • 超滤法进一步分离纯化溶菌酶和盐析法浓缩、透析法除
盐 • SDS-PAGE法检测溶菌酶的纯度 • 测定溶菌酶的活力和冷冻干燥溶菌酶
实验一、柱层析前的准备工作
背景知识
离子交换树脂结构
骨架：接有功能基团，本身是惰 性
功能基团：连接在骨架上，可与 相反离子结合
活性离子：与功能基团所带电荷 相反的可移动的离子
待交换分子：在吸附阶段可与活 性离子交换，与骨架上的功能基 团结合
实验原理
• 724型阳离子交换树脂
骨架：丙烯酸型； 功能基团：羧基；pK＝4.5； 适用的pH范围：pH5～14； 系弱酸性阳离子交换剂，所以 ①交换容量随缓冲液pH值的变化而变化，pH＝7时，交换 容量是8.0mmol/g； ②Na型树脂比H型树脂更容易与溶菌酶进行交换。
生物技术制药工艺学实验报告格式 (2)
4、液体电极需及时补充电解液，液面高度在注入口以下1—2cm.
DO电极：
1、每三个月对电极维护一次
2、每次更换膜或换电解液后，电极必须重新极化和校准，先极化（即连续通电7小时以上）后校准。
3、满度校正：发酵开始时进行
实消：
1、培养基灭菌过程中，蒸汽将会带入一定量的凝结水，使灭菌后培养基体积升高。同时，考虑接种时种子带入的液体体积，故培养基配制时须相应的减少水的加入量。因此母液加入罐内后应补水至所需培养液总量的70%，其余30%为蒸汽冷凝水和种子量。初次使用种子罐应适当减少配料时加入水的量，待明确实消过程增加的冷凝水的量后再调整配料体积。
2、按工艺要求配制培养基母液。关闭阀门P11、P12，将配好的培养基母液加入罐内，补水。开启机封冷却系统，开启控制系统电源。
3、升温：打开阀门D11，稍开S13，将夹套内残水排空，并对发酵液预热，温度达到90℃时关闭S13。
1）检查P1是否已经完全闭合
2）
4、罐温到达灭菌温度后，适当关小P11、A16的开度。调节S13、D11、A17使罐压保持在0.1~0.12MPa。计时灭菌30~50min
3、固定种子罐罐盖螺栓时，罐盖密封螺栓对称拧，螺栓和各接口螺母不可拧得太紧，牢靠即可，防止损坏螺栓和橡胶密封圈。
4、空消前一定要排尽种子罐夹套内存水，并保持D11打开状态，否则空消过程可能会将发酵罐内筒体压扁，造成设备损坏。
5、空消前一定要拔下尾气冷凝管两端软管，放出存水，否则在空消过程中会有过多回流冷凝水，并且灭菌不彻底。
2、检查种子罐的所有阀门是否都是关闭的，若是关闭的，
①排出夹套中残留的冷却水，操作如下：
②排出种子罐罐底的积水，操作如下：
中国药科大学生物制药工艺实验指导参考模板
第二部分生物药物制备实验第一节氨基酸及其衍生物类药物实验二十二固定化细胞法生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸注：此实验来自项目固定化细胞生产天冬氨酸，丙氨酸（国家攻关课题）的成果【实验目的】1．学习L-天冬氨酸和L-丙氨酸的制备方法。
2．了解酶法生产这两种氨基酸的原理和细胞固定化的原理及优点。
3．掌握固定化细胞的技术。
【实验原理】固定化细胞（Immobilized cell）技术，就是利用物理或化学手段将游离的微生物细胞、动物细胞，定位于限定的空间领域，并使其保持活性且能反复利用的一项技术。
固定化细胞的制备方法主要有以下几种：吸附法、共价交联法、絮凝法、包埋法；交联可以是细胞通过离子相互作用或共价连接到一个表面，也可以是细胞与细胞之间用过天然或化学试剂诱导产生连接；吸附法是细胞通过静电相互作用（范德华力、离子键和氢键）吸附到支持物表面，此法简单价廉，但经常发现有细胞泄露；絮凝法是利用某些微生物细胞具有絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法；包埋法是近年来发展迅速的一种新兴固定化细胞技术，它是将细胞捕获在一个保护性基质结构或胶囊中，减少了细胞泄露，因此具有操作简单，对细胞活性影响较小，效率高等特点，是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法之一。
L-天冬氨酸（L-Aspartic acid）是天然存在的重要氨基酸，在食品、医药、日用化工、纺织等行业有着广泛的应用。
L-天门冬氨酸钾、镁盐在细胞代谢中起着重要作用，是钾、镁的有效补充剂，适用于各种心脏病。
在食品方面，L-天冬氨酸作为食品添加剂可改善食品风味，L-天冬氨酸与D-丙氨酸可合成L-天冬酰-D-丙氨酸甲酯（其甜度为蔗糖的150倍），是一种新型甜味剂。
在化工方面，L-天冬氨酸还可以作为制造合成树脂的原料，其衍生物还可以合成量型表面活性剂以及制造化妆品。
工业上生产L-天冬氨酸以往采用化学合成法和微生物发酵法。
随着固定化酶和固定化细胞技术的不断完善和发展，人们开始改用含有天冬氨酸酶的固定化细胞直接将延胡索酸铵转化成L-天冬氨酸来实现工业化生产。
生物制药工艺学实验课件3讲义
透析示意图
实验步骤
1. 超滤分离（四组同学的溶菌酶洗脱液合并超滤）： 将溶菌酶洗脱液以合适的流速经过超滤膜（进口
南京师范大学生命科学学院 张茵
2015年4月
实验三 超滤法分离溶菌酶和盐析 浓缩溶菌酶
实验目的
掌握超滤分离技术的原理和操作； 掌握盐析的原理和操作。
实验流程
超滤法进一步分离溶菌酶 透过液盐析法沉淀溶菌酶 透析法除盐
实验材料
溶液：0.5M NaOH溶液 透析缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0） 其他材料：透析袋（8000~10000Da），超
压力不超过 2.0bar ），收集透过液，回流
液（吸取 200μL于dorf管中，标记为“6”）， 当透过液与回流液体积比约为3:1时，超滤可结 ✓束超。滤结束后，需要用50mM 磷酸缓冲液冲洗膜包；当透
过液与回流液体积比约为1:1时，冲洗即可结束。 ✓ 如果透过液流速减慢，需要用0.5M NaOH溶液清洗膜包，
滤膜（30kD），固体硫酸铵，研钵，捣杵 等。
实验原理
超滤分离技术
1. 原理：它是一种膜分离技术，它的 特点是使用不对称多孔膜，根据分 子的大小来分离溶液中的大分子物 质与小分子物质。它是一种流体切 向流动和压力驱动的过滤过程。
2、分离方式：切向流过滤
切向流过滤：溶液沿与超滤 膜平行的方向流动，可避免 浓差极化，提高超滤速度。
封头过滤：溶液流动方向与 过滤方向一致，随着过滤的 进行，膜表面形成的滤饼层 厚度逐渐增大，流速逐渐降 低。
3、超滤分离过程示意图
4、选择超滤膜
制药工艺综合实验报告-第二组
一、 透析袋的处理
1. 剪取适当长度的透析袋，放入大体积的 2%（w/v）Na2CO3 和 1M EDTA （pH8.0）中煮沸 10min；
2. 用去离子水彻底清洗后，放入 1M EDTA（pH8.0）中煮沸 10min； 3. 冷却后，存放于 4 度，使用时，戴手套取出透析袋，用去离子水清洗干 净。
小时）。（准备好种子培养基及平板菌种，第一天晚上 11 点接种。） 4. 上罐准备：
(1) 发酵罐于 121℃空消 20-30min。（早上过来即做，整个灭菌过程约 90min！） (2) 校正 pH 及溶氧电极。 (3) 发酵罐准备：装有培养基的发酵罐，插入 pH、溶氧电极，装上空气过滤 膜，包扎好后放入灭菌锅中，同时放入 TES、消泡剂、磷酸、NaOH 等溶液，枪 头、离心管等耗材，于 121℃灭菌 20min。 (4)待灭菌结束后，将发酵罐放在冷却底座上，开启发酵罐控制系统，联接好 冷凝水、空气线路，调节进气阀使罐内保持正压。（第一天结束） 5. 发酵取样 (1) 控制 pH=7.2，温度 37℃，转速 600r/m、通气量 1.5vvm（4.5L/min），标 定 D.O.为 100％，校准 pH 电极。 (2) 在超净工作台上，将 3ml Amp 母液加入到装有 TESM 的三角瓶中，当培 养基温度控制到 37℃后，接入制备好的种子、TESM，自动控制发酵罐上发酵 20 小时左右。
kDa
116.0 66.2
45.0
25.0 35.0 18.4 14.4
Marker 0h
2h
4h
6h
8h 10h 12h 14h 16h
第二部分
rhIFNα-2b 复性和纯化
rhIFNα-2b 的提取流程：
107707-生物制药工艺学实验6
南京师范大学生命科学学院 张茵 2015.5.
酵母细胞中海藻糖的提取和鉴定
实验目的
掌握从酵母中提取海藻糖的方法； 掌握旋转薄膜蒸发器的原理和操作； 掌握薄层层析的原理和操作。
实验材料
试剂：60%乙醇溶液； 固体试剂：粉末状活性炭； 树脂：717强碱性阴离子交换树脂，732强酸
收集海藻糖
5000rpm离心15min，收集沉淀，沉淀用约3mL蒸馏水溶解。 薄层层析 ✓ 配制展开剂：正丁醇：乙醇：水=2：1：1（v：v：v），混合均
匀后，倒入层析缸，让蒸汽充满层析缸。 ✓ 用毛细管点样
样品：提取的海藻糖溶液，1.5mg/mL标准海藻糖溶液， 2.0mg/mL标准海藻糖溶液 ✓ 待溶剂前沿至薄层板边缘约1cm后，停止层析。 ✓ 取出薄层板，吹干，均匀地喷15%硫酸溶液，置烘箱80度显色。
性阳离子交换树脂。 仪器：旋转薄膜蒸发仪
背景知识
✓ 海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩 合而成的非还原性双糖，它的分子式为 C12H22O11·2H2O，相对分子质量约为378。
✓ 海藻糖易溶于水，热乙醇，不溶于丙酮； ✓ 海藻糖广泛存在于自然界，尤其在酵母等真菌
中含量较高； ✓ 海藻糖对酸、热较稳定; ✓ 海藻糖作为一种应激代谢物，能够保护生物体
抵抗恶劣环境，在体外也可以保护生物大分子。
旋转薄膜蒸发
工作原理：水泵或者油泵将系 统的压力降低，恒速旋转的蒸 发瓶在加热槽（水浴）中恒温 加热， 瓶内的液体随着蒸发瓶的旋转 在瓶内壁形成薄膜，不仅使液 体受热均匀，而且增大了蒸发 面积，提高了蒸发效率。
应用：适用于在常压浓缩时未 达溶剂的沸点，即已受热分解、 氧化或聚合的溶质。
✓ 用薄层色谱扫描仪在480nm下扫描薄层板，通过比较标准品和样 品的积分面积，计算海藻糖的浓度。
中国药科大学生物制药工艺学实验设计
将涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB培养基上，为每个克隆编号。平板37°C温箱中过夜，待菌落形成后用灭菌牙签逐个挑选少量菌体，移入预先加有0.1mmol/L硼酸缓冲液（ph 8.4）50ul的酶标板反应孔里，待菌体分散后每孔加入0.04mmol/L天门冬酰胺底物溶液50ul，37°C保温15min，加入奈氏试剂50ul，呈深红棕色孔内相应的单菌落即为阳性转化子。
实验材料:
CPU 210009菌体，1% TrioX-100，2mmol/LTris-HCl PH8.5，2mmol/L EDTA，引物E1E2， Mgcl2, dNTP,Taq DNA聚合酶
pET28a载体，Ncol, Hind I ,ddH2O,T4DNA连接酶，Taq酶，CaCl2,
溶菌酶，硫酸铵，50mmol/L,ph7.0磷酸缓冲液，ph7.6的磷酸缓冲液，50mmol/L，ph5.2的磷酸缓冲液，0.1mol/L硼酸缓冲液,奈氏试剂，蒸馏水等
3.4发酵培养：
配制培养基：
牛肉膏5g
蛋白胨10g
NaCl5g
琼脂15-20g
水1000ml
PH7.41
高压蒸汽灭菌20分钟
筛选后呈阳性的重组工程菌于斜面培养基上培养24h,温度保持37℃。
菌种经过斜面培养后，接种到液体培养基中，于37℃、250r/min下摇瓶培养16h。
4.重组酶的分离纯化：
4．1蔗糖溶液抽提
酶活力（µ/ml）=【样品的氨浓度（mol/ml）- 对照的氨浓度（mol/ml）】/（3*10^3）
参考文献
[1]吴晓英，吴振强，林影，夏枫耿.L-天冬酞胺酶的研究进展[J] 广东药学2003年第13卷第6期
生物制药工艺学实验5
两相区
系线
双结点线
均相区
临界点
例如： M点，两相有不同的组成和密度，上相（T）主要含PEG， 下相（B）主要含葡聚糖。直线TMB称为系线，所有在该系线上 的点，其上、下相组成均与T和B点相同，但体积比不同。
当系线长度趋于零时，即C点，两相差别消失，C点称为临界点 （critical point）。
原理：蔗糖酶可作用于β－1，2糖苷键，将蔗糖水解为D－ 葡萄糖和D－果糖。 葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与3，5－二 硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还 原糖的量和反应液的颜色强度成正比关系； 蔗糖酶的活力通过其水解产生的还原糖量来反映。
实验步骤
1. 研磨法破碎酵母细胞
5.蛋白质含量测定
试剂
空白组
粗酶液组
萃取组
相应组别的溶液
—
0.1
0.1
（mL）
蒸馏水（mL）
0.1
—
—
考马斯亮蓝G-250 5
5
5
（mL）
混匀，然后以空白组调零，测定各组OD595nm
6.制作蛋白质标准曲线
管号
0
123
4
5
6
标准牛血清白蛋白溶液（1.5mg/mL） 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
组别
体积（mL） 比活力
粗酶液
萃取相（上 相）
萃取相（下 相）
纯化倍数 —
回收率 —
8
பைடு நூலகம் 单因素实验
一、考察PEG种类对蔗糖酶分配的影响 条件：硫酸铵浓度为15%，PEG浓度为18% PEG种类：PEG1500，PEG6000，PEG20000
生物制药工艺学实验
3. 打孔注入无菌滤液
用直径为6毫米的无菌打孔器在平板上打4个孔 （呈十字排列），其中 2 孔注入无菌滤液，另 两孔注入空白培养基（经过于发酵液相同的处
理）。
4. 培养并测定抑菌圈直径
将平板置于37℃的培养箱，24小时后观察抑菌
效果，并测量抑菌圈直径。
四、实验作业
1、简述本实验的实验原理及流程。 2、简述本实验中有哪些无菌操作步骤。 3、实验结果及分析。
生物制药工艺学实验
一、实验目的
1. 掌握产抗生素微生物的培养流程。 2. 掌握抗生素抑菌活性测定方法。
二、实验材料
1.实验菌种：Bacillus oceanisediminis
平板照片
2.LB 培养基 （ Bacillus oceanisediminis 斜面和平板，
作液体种子培养基时不加琼脂即可 ） 胰蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 10.0g 5.0g 10.0g
蒸馏水
pHபைடு நூலகம்
1.0 L
7.０
3.PDB培养基（Bacillus oceanisediminis 发酵培养基）
200g马铃薯切成小块，煮沸20分钟后过滤，加入20g 葡萄糖，补水至1L，调pH至中性。
4.沙堡氏培养基配方（培养白色念珠菌用，液体培
养基不加琼脂） 蛋白胨 10g 葡萄糖 40g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调pH值至5.4～5.8，高压蒸汽灭菌115℃，30min。
5.无菌器具
平板、离心管、滤膜、打孔器等。
三、实验内容
培养基的制备 斜面的制备 发酵液的制备 发酵液预处理 抑菌活性测定 结果分析
培养基的制备
斜面培养基 种子培养基 发酵培养基 按照 配方 称量 分装 锥形瓶
生物制药实验(1)
实验一芦丁的提取精制与鉴定芦丁（Rutin）亦称芸香苷（Rutinoside），在植物界广泛存在，其中以槐米、荞麦叶、蒲公英和烟叶中含量较多，可作为提取芦丁的原料。
槐花米系豆科植物Sophora japonica 的未开放花蕾，具有调节毛细血管渗透性之作用，临床用作毛细血管止血药，如复方芦丁，也作为高血压的辅助治疗药物。
除此之外，还可作为制药原料，用于制造槲皮素（Quercetin）、羧乙基槲皮素、羧乙基芦丁、二羧丙基芦丁、β-乙基吗啡芦丁、6-而乙基氨基芦丁等。
槐花米中芦丁的含量高达12%~16%,另含少量皂苷。
芦丁水解后得到槲皮素，皂苷水解后可得到白桦酯醇（Betulin）及槐花二醇（Sophoradiol）。
芦丁为淡黄色细小针状结晶，含三个结晶水，熔点177~178℃。
；芦丁溶于热水（1:200），难容于冷水（1:8000）；溶于热甲醇（1:7），冷甲醇（1:100）；热乙醇（1:30），冷乙醇（1:300），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、三氯甲烷、乙醚及石油醚等溶剂。
易溶于碱液中呈黄色，酸化后又析出。
其结构如下图：一、实验目的1、通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。
2、通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法二、实验原理芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水。
溶解度：冷水1:10000；热水1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。
微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。
芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。
利用芦丁易溶于热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。
三、实验器材研钵，500mL烧杯，广泛试纸，四层纱布，滤纸，漏斗，10mL试管，5mL移液管，波棒，洗耳球，温控烘箱石灰乳，浓盐酸，镁粉，10%α-萘酚乙醇溶液，浓硫酸，乙醇，2%二氯氧锆甲醇溶液，2%柠檬酸甲醇溶液四、实验流程pH8～9滤液药渣10分钟，维持pH8～9×）pH至4～560℃）干燥，称重。
生物制药工艺学实验
生物制药工艺学实验指导（12个实验，36学时）焦飞生物技术教研室实验一健胃消食片配方及片剂的制备一、实验目的1.掌握压片机压片的方法及影响片剂成型的主要因素；2.学会片剂处方的调配。
二、实验材料和仪器太子参，陈皮，山药，麦芽（炒），山楂，蔗糖粉，糊精，硬脂酸镁，粉碎机，干燥箱，制片机三、实验原理健胃消食片为内科伤食类非处方药品，主治健胃消食，用于脾胃虚弱，消化不良，脾胃虚弱所致的食积，症见不思饮食，暖腐酸臭，脘腹胀痛。
健胃消食片的配方如下，太子参228.6g，陈皮22.9g，山药171.4g，麦芽（炒）171.4g，山楂114.3g，蔗糖糊精适量，值得片剂为淡棕黄色的片或薄薄膜片，气略香，味微甜，酸。
制作方法：太子参半量与山药粉碎成细粉，其余陈皮三味药及剩余的太子参置于烧杯，加3倍量水，煎煮1小时，滤过，合并两次煎液，减压浓缩至浸膏，干燥。
将蔗糖粉糊精和生药粉以3：1：1的混合粉与浸膏混合制成软材，软材的软硬应适当，以“手握成团，轻压则散”为宜。
采用挤出制粒的方法制成颗粒，颗粒在60-80摄氏度干燥，干燥时应逐渐升温，以免因颗粒表面干燥过快结成硬壳而影响内部水分的蒸发。
颗粒整粒后加入1％硬脂酸镁混合后压片。
四、实验步骤1.称取太子参22.8g，陈皮2.3g，山药17.1g，山药17.1g，麦芽17.1g，山楂11.4g2.太子参山药用粉碎机粉成细粉。
3.将上述药材放入烧杯中，加入3倍量的水，煎煮半小时，重复两次，将上清液合并，减压浓缩至浸膏，将所得浸膏放入烘箱中80度干燥。
4.将蔗糖粉糊精和干燥后的粉末以3：1：1的比例混合制成颗粒软材，将软材放入烘箱中逐渐升温干燥。
5.干燥后的软材加入1％硬脂酸镁放入压片机中压片。
实验二溶菌酶结晶的制备一、实验目的1.掌握盐析法提取蛋白质的原理和过程；2.学会溶菌酶的结晶和精制方法。
二、实验材料与仪器新鲜鸡蛋，氯化钠，1 mol/L 氢氧化钠溶液，醋酸缓冲液，烧杯，玻璃棒，布氏漏斗，干燥箱。
生物制药工艺学实验
发酵液制备
1. 从斜面上挑取1环Bacillus oceanisediminis菌，在平
板上划线培养，置于37℃培养箱生长24小时。
2. 挑 3 环 平 板 上 活 化 好 的 菌 ， 接 到 种 子 培 养 基 中
（ 250mL 三角瓶， 50mL 装液量），于 37℃ 、 200
转/分钟摇床培养24小时。 3. 取4mL 种子液，接入到发酵培养基中（500mL摇 瓶， 200mL 装液量），于 37℃ 、 200 转 / 分钟摇床 培养24小时。
3. 打孔注入无菌滤液
用直径为6毫米的无菌打孔器在平板上打4个孔 （呈十字排列），其中 2 孔注入无菌滤液，另 两孔注入空白培养基（经过于发酵液相同的处
理）。
4. 培养并测定抑菌圈直径
将平板置于37℃的培养箱，24小时后观察抑菌
效果，并测量抑菌圈直径。
四、实验作业
1、简述本实验的实验原理及流程。 2、简述本实验中有哪些无菌操作步骤。 3、实验结果及分析。
发酵液处理
1. 离心：取 40mL发酵液，平衡后于 4000转/分钟 离心20分钟，得上清。 2. 无菌滤膜过滤：用不含针头注射器吸取5mL上 述滤液，反转注射器（针头朝上），取出无菌滤 器并将其安在注射器顶端。将无菌滤膜和注射器
放在无菌离心管上，挤压注射器，收集无菌滤液，
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纤维素酶在一定温度和条件下， 将纤维素底物 (滤纸 )水解，释 放出还原糖。在碱性、 煮沸条件下， 3,5-二硝基水杨酸 (试剂 )与还 原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖 (以葡萄糖计 )含量成 正比。通过在 540 测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出 纤维素酶的滤纸酶活力。 滤纸酶活力 ()指 固体酶 (或 1 液体酶 )， 在(50 士 0.1) ℃ , 指定条件下(酸性纤维素酶 4.8，中性纤维素酶 6.0), 水解滤纸底物， 产生出相当于 l 葡萄糖的还原糖量， 为 1 个酶活 力单位，以 (或)表示。 三、实验器材和试剂
生物制药工艺学实验指导
（ 12 个实验， 36 学时）
焦飞 生物技术教研室
实验一 健胃消食片配方及片剂的制备
一、实验目的
1. 掌握压片机压片的方法及影响片剂成型的主要因素；
2. 学会片剂处方的调配。
二、实验材料和仪器
太子参，陈皮，山药，麦芽（炒），山楂，蔗糖粉，糊精，硬脂
酸镁，粉碎机，干燥箱，制片机
二、实验原理 纤维素酶是一种多组分酶， 包括 4 种组分： 内切 β-1,4-葡聚糖
酶、外切 β-1,4-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和纤维二糖酶（又称 β-葡聚糖苷酶）。在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素， 使之变成纤维寡糖、 纤维二糖和葡萄糖等还原糖。 这些还原糖能 将碱性条件下的 3,5-二硝基水杨酸（）还原，生成红棕色的氨基 化合物，在 540 波长处有最大光吸收， 在一定范围内还原糖的量 与反应液的颜色强度呈比例关系。 利用比色法测定其还原糖的量 就可测定纤维素酶的活力。
新鲜鸡蛋，氯化钠， 1 氢氧化钠溶液，醋酸缓冲液，烧杯， 玻璃棒，布氏漏斗，干燥箱。 三、实验原理
溶菌酶又称细胞壁质酶或 N —乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一 种国内外很紧销的生化物质， 广泛应用于医学临床。 具有多种药 理作用，能抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等，有抗菌 的作用，常用于五官科多种粘膜炎症，皮肤带状疮疹等疾病。是
（2）加入氯化钠 按每 100 蛋清溶液加入 2g.氯化钠的比例， 白蛋清溶液中慢慢加入氯化钠细粉， 边加边搅拌， 促使氯化钠细 粉及时溶解， 以避免局部浓度过高或沉淀于容器底部， 否则会引 起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。
（3） 粗制溶菌酶 加完氯化钠细粉后， 再用 1 的氢氧化钠 溶液小心地将上述蛋清溶液的值调节到 10.8。在用氢氧化钠溶液 调节蛋清溶液值时， 用胶头滴管将其逐渐滴入并不断搅拌以免局 部过碱而导致蛋白质的变性， 从而影响溶菌酶的得率和质量。 为 加速溶菌酶的结晶过程， 可再加入适量的溶菌酶结晶体作为晶种。 低温下静置数天，溶菌酶结晶将慢慢析出，于 72~96h 达到最高 产率。待结晶完全后，倾去上清液并用布氏漏斗滤出结晶，即可 得到粗制的溶菌酶晶体。
三、实验原理
健胃消食片为内科伤食类非处方药品，主治健胃消食，用于
脾胃虚弱，消化不良，脾胃虚弱所致的食积，症见不思饮食，暖
腐酸臭，脘腹胀痛。健胃消食片的配方如下，太子参 228.6g，陈
皮 22.9g，山药 171.4g，麦芽（炒） 171.4g，山楂 114.3g，蔗糖糊
精适量，值得片剂为淡棕黄色的片或薄薄膜片， 气略香，味微甜，
两次，将上清液合并，减压浓缩至浸膏，将所得浸膏放入烘 箱中 80 度干燥。 4. 将蔗糖粉糊精和干燥后的粉末以 3：1：1 的比例混合制成颗粒 软材，将软材放入烘箱中逐渐升温干燥。 5. 干燥后的软材加入 1％硬脂酸镁放入压片机中压片。
实验二 溶菌酶结晶的制备 一、实验目的 1. 掌握盐析法提取蛋白质的原理和过程； 2. 学会溶菌酶的结晶和精制方法。 二、实验材料与仪器
酸。制作方法：太子参半量与山药粉碎成细粉，其余陈皮三味药
及剩余的太子参置于烧杯，加 3 倍量水，煎煮 1 小时，滤过，合
并两次煎液，减压浓缩至浸膏，干燥。将蔗糖粉糊精和生药粉以
3： 1： 1 的混合粉与浸膏混合制成软材，软材的软硬应适当，以
“手握成团，轻压则散”为宜。采用挤出制粒的方法制成颗粒，
颗粒在 60-80 摄氏度干燥，干燥时应逐渐升温，以免因颗粒表面
（4）精制溶菌酶 将制得的粗结晶用值 4.6 的醋酸溶解， 然后
让酶液静置 2h，接着过滤除去不溶物，收集滤液并量出体积，
按 100 滤液加 5g 氯化钠的比例加入（加入方法与第二步加入氯
化钠的方法相同） 。然后用 1 的氢氧化钠溶液缓慢地将其值调节
到 10.8 后，低温下静置结晶。为加速结晶过程可向酶液中加入
优良的天然防腐剂， 可用于食品的防腐保鲜。 尤其重要的是近年 来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶。 四、实验步骤
（1）收集鸡蛋清将新鲜鸡蛋两端各敲一个小洞， 使蛋清流出 （最好是新生的鸡蛋、值不得低于 8，否则不能使用），按其体 积的两倍量加入水，轻轻搅拌 5，使蛋清溶液的稠度均匀，注意 在搅拌过程中不能起泡，搅拌不宜过快、搅拌棒应光滑等，以防 蛋白质变性而影响溶菌酶产品的得率及质量， 最后用双层细纱布 滤除蛋清溶液中的脐带块及碎蛋壳等。
干燥过快结成硬壳而影响内部水分的蒸发。颗粒整粒后加入
1％
硬脂酸镁混合后压片。
四、实验步骤
1. 称取太子参 22.8g，陈皮 2.3g，山药 17.1g，山药 17.1g，麦芽 17.1g，山楂 11.4g
2. 太子参山药用粉碎机粉成细粉。 3. 将上述药材放入烧杯中， 加入 3 倍量的水， 煎煮半小时， 重复
溶菌酶晶种， 待结晶完全后再倾去上清液， 用布氏漏斗过滤可得
溶菌酶结晶，如纯度不够，可重复操作提纯，直至达到所需要的
纯度为止，结晶于 30~40 ° : 烘干后即得溶菌酶产品。
（5）包装存贮 产品应装于玻璃或陶瓷容器中， 置于阴冷处
保存，以免溶菌酶受热后失去活性。
注意事项
（1）整个过程只能在玻璃或陶瓷容器中进行， 不可用金属容
器，以免酶失活而影响产品的得率及质量。
（ 2）操作的全过程要在低温下进行（
10 °以下），防止原料
变质和酶失活。
（ 3）第三步中加入溶菌酶晶种的具体操作是将溶菌酶晶体均
匀地悬浮于少量的值为 10.8，浓度为 5%氯化钠溶液中，取几滴
加入到调好的值和氯化钠浓度的蛋清液内，再置低温处结晶。
实验三 纤维素酶活力的测定 一、实验目的 1. 了解纤维素酶的种类和测定原理，以及纤维素酶的作用特性； 2. 掌握 3,5-二硝基水杨酸（）法测定纤维素酶活力的原理和方法。