分子生物学实验指导(精)
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导分子生物学实验指导（补充讲义）南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心二OO九年十二月目录实验总RNA的提取、定量与RT-PCR………………………………………………1实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7)实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13)附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19)附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19)实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR一、总RNA的提取与定量目的：从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。
原理：在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。
rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。
mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。
利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。
RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
目前常用的是Trizol法。
Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。
分子生物学实验指导
实验一RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等。
【试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆。
（2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。
（3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。
（4）4℃离心，12,000g×15min。
（5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。
（6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。
（7）4℃离心，12,000g×10min。
（8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。
（9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中。
一70℃保存备用。
二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度。
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。
例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm 鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm。
这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。
另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度。
DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。
分子生物学实验指导_图文(精)
分子生物学实验指导主编:于冰马春泉高传军杨峰山主审:李海英黑龙江大学生命科学学院2006 年 3月目录绪论分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备................................................... 1 实验一植物基因组 DNA 的分离.................................... 6 实验二 RNA 的分离................................................... 11 实验三 DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测.............................. 15 实验四 DNA/RNA浓度、纯度的测定及浓度的调整............ 21 实验五聚合酶链式反应(PCR .................................... 24 实验六随机扩增多态性 DNA 反应(RAPD ..................... 28实验七甜菜 M14品系 AFLP 分析.................................... 32 实验八生物信息学 (49)前言黑龙江大学生命科学学院自成立以来,相继成立了生物工程专业,生物技术专业,生物制药专业和食品科学与工程专业。
分子生物学是一门二十一世纪的前沿学科,而实验操作是分子生物学的一个重要组成部分。
我们结合了我院现有的仪器设备及材料情况,为本科生设立了八个分子生物学实验项目(包括一个综合性实验项目 ,以使学生掌握分子生物学领域中最基本的实验技能。
本书编写充分考虑了实验的系列操作性,比如从基因组 DNA 、总 RNA 的提取到琼脂糖凝胶检测,从 DNA 浓度的调整到 PCR 技术,从分子标记技术到生物信息学分析等,完全贯穿了分子生物学的基本实验技术。
对生命科学学院的本科生来说是一本很好的实验教材。
分子生物学实验指导书
分子生物学实验指导书本实验指导书包括三个紧密相关、前后衔接的实验，可供16-20学时的实验课教学使用。
实验内容均为分子生物学最常用的实验技术，希望同学们能熟练掌握。
实验体系已经多次尝试和优化，虽趋成熟但非尽善尽美，更非逢做必成。
随实验条件的变化，每次实验前的预实验是有必要的。
指导书如有不妥之处敬请指出，以便再次修订。
西北农林科技大学农学院柴守诚实验一植物总DNA的提取1.实验目的通过实验学习和掌握植物总DNA提取和纯化的原理和方法，并为后续的实验准备DNA样品。
2.实验原理2.1 DNA提取的原理植物组织中总DNA的提取首先要破碎细胞。
植物细胞具有坚硬的细胞壁，液氮冷冻和研磨是破碎植物细胞壁的有效方法。
而细胞膜、核膜等膜体系的破坏则通过加入提取缓冲液中的去污剂的处理来实现。
常用的去污剂有SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)，CTAB(cetyltrimlthylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵)等。
细胞壁、细胞膜及核膜破坏后，释放出细胞内含物至提取缓冲液，内含物中包括DNA、RNA和蛋白质等。
将其他组分除去或降解，然后回收DNA是常采用的一种提取和纯化DNA的技术路线。
磨碎的植物组织经提取缓冲液处理后通过离心可沉淀植物组织残渣至试管底部，取上清液、弃残渣，上清中加入苯酚和氯仿（三氯甲烷）处理后经离心蛋白质沉淀于有机相（下相）和水相（上相）的界面处。
水相中含有溶解的DNA和RNA,收集水相加入核糖核酸酶A(ribonuclease A ，RNaseA)则使RNA降解，而DNA仍完整。
加入乙醇或异丙醇可使DNA呈絮状沉淀析出，絮状沉淀可用玻棒或牙签缠绕挑出或通过离心收获，并重新溶解于适量的TE缓冲液中备用。
2.2 DNA提取的质量要求对DNA提取样品的基本质量要求是尽量保持DNA分子的完整性（即没有或很少降解）和样品的高纯度（即蛋白质和RNA等的污染程度低）。
分子生物学实验指导（精）
分⼦⽣物学实验指导（精）分⼦⽣物学实验指导⽣物技术教学室编宁夏⼤学⽣命科学学院2008年8⽉实验⼀分⼦⽣物学实验技术多媒体演⽰[⽬的要求]通过多媒体试验录像进⼀步掌握分⼦⽣物学基本操作技术。
[教学⽅式]多媒体光盘演⽰。
[实验内容]基本的分⼦⽣物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验⼆琼脂糖凝胶电泳检测DNA[⽬的要求]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的⽅法和技术[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA⽚段的常⽤⽅法。
DNA分⼦在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分⼦筛效应，DNA分⼦在⾼于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖磷酸⾻架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA⼏乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极⽅向移动。
不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp⾄50 kb的DNA⽚段。
在琼脂糖溶液中加⼊低浓度的溴化⼄锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。
琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分⼦⼤⼩在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数⽬的常⽤对数值成反⽐，分⼦越⼤迁移得越慢。
(2) 琼脂糖浓度⼀个特定⼤⼩的线形DNA分⼦,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。
(3) 电压低电压时，线状DNA⽚段迁移速率与所加电压成正⽐。
但是随着电场强度的增加，不同分⼦量DNA⽚段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩⼩。
要使⼤于2kb的DNA⽚段的分辨率达到最⼤，所加电压不得超过5v/cm。
(4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳⾏为受电泳时的温度影响不明显，不同⼤⼩的DNA⽚段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发⽣明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。
分子生物学实验指导
实验一、动、植物组织总RNA的提取一、材料、试剂和仪器材料：动物组织，一次性塑料手套，200 μl、1000 μl吸头。
试剂：TRIzol总RNA提取试剂，氯仿，异丙醇，0.1％DEPC，75％乙醇（用RNase-free 水配制），RNase-free水。
仪器：烘箱，超低温冰箱，高速冷冻离心机，普通离心机，高压灭菌锅，微量取样器，研钵二、提取操作步骤1、匀浆处理：a、动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。
取新鲜或-70'C冻存组织，大约10-30 mg组织加1m1 TRIquick，用一次性组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
b、单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIquick裂解细胞，每10cm2面积加1ml TRIquick。
用取样器吹打混匀。
c、细胞悬液：离心收集细胞。
每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1 ml TRIquick。
d、血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，8，000-10，000 rpm离心1分钟。
彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。
每100-200 μl 血液收集的白细胞沉淀加入1 ml TRIquick。
2、将匀浆样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。
如不连续进行实验，加入TRIquick的匀浆样品可在－70'C下保存1-2个月。
3、可选步骤：4℃12，000 rpm离心5-10分钟，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4、每使用1ml TRIquick向匀浆样品中加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟，使其自然分相。
如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2分钟代替。
5、4℃12，000 rpm离心10-15分钟。
分子生物学实验指导
北京化工大学分子生物学实验指导实验一 少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。
（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。
（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。
二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。
目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。
严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。
每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。
松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。
该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。
分子生物学实验指导
分子生物学实验教案第一部分茶树CBF基因的克隆实验一目标基因的5’-末端的PCR扩增、3’-末端的PCR扩增一、实验目的通过本实验学习和掌握用RACE方法扩增cDNA的5’-末端和3’-末端的方法和技术。
二、实验原理1. 聚合酶链反应的原理聚合酶链反应（the polymerase chain reaction, PCR）是一种在模拟DNA复制反应的基础上对一个DNA分子某一特定区域进行选择性扩增的方法。
DNA分子上任何一个区域，只要它两端的序列是已知的，都可以利用PCR进行特异性扩增，获得大量的扩增产物。
PCR反应体系包括：①模板：其上待扩增的序列称为靶序列；②一对特异性引物：它们是人工合成的10 ~ 30个核苷酸长的单链DNA片段，与靶序列的两端互补；③耐热DNA聚合酶：用于延伸引物合成DNA，PCR反应中常用的DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶；④四种脱氧核糖核苷三磷酸：dATP、dGTP、dCTP和dTTP是DNA合成的前体分子。
PCR实验的基本步骤如下：①高温变性：反应混合物被加热到94℃，在该温度下，DNA 双螺旋两条链之间的氢键被打断，DNA分子发生变性；②低温退火：当温度降低时，引物与单链模板杂交；③适温延伸：退火后，温度又被升高到了72℃，这是Taq DNA聚合酶的最适工作温度，Taq DNA聚合酶延伸引物合成与模板互补的新链。
这三步构成一个循环，接下来温度又被升到94℃，双链DNA分子又变性成为单链，于是便开始了第二轮变性－退火－延伸的循环（图1-1）。
由于每一次循环的产物都可以作为下一次循环反应的模板，通常经过25 ~ 30次后，被扩增的DNA片段可以达到几百万个拷贝。
2. RACE技术的原理以4℃处理24 h的茶树幼叶为材料，利用SMART cDNA synthesis Kit构建了SMART cDNA文库。
首先以3' SMART™ CDS Primer II A为引物，以RNA为模板合成第一链cDNA。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导第一节、实验室规则及安全防护一、实验室规则二、实验室安全防护第二节、分子生物学常用研究技术一、核酸分离纯化二、聚合酶链反应技术三、分子杂交技术四、分子克隆技术五、其它新技术第三节、常用仪器使用一、离心机二、分光光度计三、PCR仪第四节、如何撰写实验报告第五节核酸分离纯化技术实验一、基因组DNA的提取制备与检测实验二、总RNA的提取制备与检测实验三、质粒DNA的提取制备与检测第六节 PCR技术实验四、常规PCR技术实验五、定量PCR技术第七节分子克隆技术实验六、DNA的限制性酶切与电泳实验七、凝胶中DNA片断的纯化回收实验八、DNA连接实验实验九、感受态细胞的制备实验十、重组DNA转化与篮白斑筛选第八节分子杂交技术实验十一、Southern 印迹杂交实验十二、Northern印迹杂交实验十三、Western印迹实验十四、核酸原位杂交第九节综合性实验实验十五、蛋白质双向电泳实验十六、酵母双杂交实验实验十七、RNA干扰实验第一节、实验室规则及安全防护一、实验室规则1．每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。
2．实验前认真预习实验内容，熟悉本次实验的目的，基本原理，操作步骤，懂得每一步操作的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。
3．实验时要听从指导老师的指导，严格认真地按规程进行实验，并注意与同组同学的配合。
未经许可，不得乱动实验装置、仪器以及电器设备等。
4．实验数据和现象应随时记录在专用的实验记录本上。
实验结束时，实验记录必须送指导老师审阅后方可离开实验室；实验报告应该当堂完成或在下次实验开始前交给指导老师。
5．保持台面、地面、水槽内及室内整洁。
精心爱护各种仪器，要随时保持仪器的清洁。
如发生故障，应立即停止使用并报告指导老师。
完成实验后应将器材洗净，把器材、药品归放回原处，试管倒置于试管架中并排列整齐。
按规定处理好废物，废液，做好清洁卫生。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导分子生物学实验指导动植物检疫专业2012，2分子生物学实验注意事项1．课前要提前预习实验内容，了解实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。
2．由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。
3．实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。
实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在理论课上课期间完成。
4．实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！5．对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。
在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。
6．写作实验报告或实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻。
7．在实验室内不能大声喧哗。
8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地丢弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。
9．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。
10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。
11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。
实验一质粒DNA的提取1．目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
2．原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0 12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
分子生物学实验指导
《分子生物学》实验指导实验1 植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。
同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。
本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。
CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。
植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA 沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280≈，纯的RNA样品A260/280≈，并且1μg/ml DNA溶液A260=。
[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
《分子生物学》实验指导书
《分子生物学》实验指导书实验学时：32学时适用专业：生物科学、生物技术实验目录实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定 (1)实验二聚合酶链式反应扩增DNA片段 (3)实验三大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化 (4)实验四植物基因组DNA提取及电泳 (6)实验五植物基因组RNA提取及电泳 (7)实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定实验项目类型：综合性一、实验目的1. 学习质粒的相关基本知识，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。
2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。
二、实验原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。
在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。
当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。
三、实验仪器与材料1. 材料：含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。
2. 溶液或试剂：LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II（0.4mol/L NaOH、2%SDS用前等体积混合）、溶液Ⅲ、分离液：酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。
3. 仪器或其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇床、高压蒸汽灭菌锅、涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温培养箱、制冰机等。
四、操作步骤质粒DNA的提取步骤：1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平板上，保存菌种，并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
临床分子生物学检验技术实验指导
临床分子生物学检验技术实验指导简介临床分子生物学检验技术是一种在临床医学中应用的分子生物学技术，通过分析和检测个体的基因组、蛋白质组和代谢产物等分子级别的信息，以帮助诊断和治疗疾病。
本文档将指导您进行一系列临床分子生物学检验技术实验，包括基因扩增、基因测序和蛋白质分析等。
基因扩增实验实验材料•反应体系：DNA模板、引物、dNTPs、酶切酶、Taq聚合酶、缓冲液等•实验仪器：热循环仪、电泳仪等•实验耗材：离心管、PCR管、琼脂糖凝胶、电泳试剂等实验步骤1.准备反应体系：–将PCR管中添加所需的反应体系成分，包括DNA模板、引物、dNTPs、酶切酶、Taq聚合酶和缓冲液等，按照所需体积进行计量。
–将PCR管密封。
2.设置热循环仪参数：–根据扩增反应的需求，设置热循环仪的参数，如退火温度、延伸温度和循环次数等。
3.进行扩增反应：–将PCR管放入热循环仪中，开始扩增反应。
4.等待扩增反应结束：–根据所设定的循环次数，等待扩增反应结束。
5.进行电泳分析：–取出PCR管中的反应体系，加入加载缓冲液，并将其倒入琼脂糖凝胶槽中。
–以合适的电压和时间进行电泳分析。
6.结果分析：–通过电泳图，观察扩增产物带的大小和强度，判断扩增是否成功。
基因测序实验实验材料•反应体系：DNA样本、引物、dNTPs、酶切酶、DNA聚合酶、缓冲液等•实验仪器：测序仪•实验耗材：离心管、测序管等实验步骤1.提取DNA样本：–从待测样本中提取DNA，使用适当的提取试剂盒进行提取。
2.准备反应体系：–将测序反应所需的反应体系成分，包括DNA 样本、引物、dNTPs、酶切酶、DNA聚合酶和缓冲液等，按照所需体积进行计量。
–将反应体系混合均匀。
3.进行测序反应：–将反应体系转移到测序管中，加入测序仪所需的荧光探针。
–将测序管放入测序仪中，开始测序反应。
4.等待测序反应结束：–根据所设定的反应时间，等待测序反应结束。
5.结果分析：–通过测序仪输出的测序图谱，解读每个碱基的荧光信号，得到待测DNA序列。
《分子生物学检验技术》实验指导
《分子生物学检验技术》实验指导【实验目的】1、把握动物组织DNA提取的方法；2、把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。
【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。
因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。
较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。
DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。
本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K 可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。
而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。
【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。
3、试剂（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K（7）生理盐水，4℃贮存（8）无水乙醇、70%乙醇【操作步骤】1、制备肝匀浆迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导1. 实验背景分子生物学是研究生物大分子的结构、功能和相互作用的一门科学。
它包括DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的研究，以及研究它们在细胞内的功能和相互作用的方式。
分子生物学的发展对于理解生物现象、治疗疾病和推动基因工程等都起到了重要的作用。
在进行分子生物学实验之前，我们需要了解一些基本的实验原理和步骤，以确保实验的准确性和可重复性。
本文将介绍一系列分子生物学实验的指导，包括DNA提取、PCR、凝胶电泳等。
2. 实验材料•细菌培养基•细菌菌株•试剂盒（DNA提取、PCR、凝胶电泳）•离心管、PCR管、琼脂糖凝胶板等实验器材3. 实验步骤3.1 DNA提取1.取一定数量的细菌菌株，并将其转接到细菌培养基中。
2.在转接后的细菌培养基中培养一夜，使细菌得到充分生长。
3.将培养好的细菌菌液转移到离心管中，进行离心。
4.移除上清液，加入细菌细胞裂解液，并进行充分混合。
5.进行高速离心，将裂解后的细菌细胞碎片与上清液分离。
6.取得上清液，为DNA提取做好准备。
3.2 PCR1.准备PCR反应试剂盒，包括模板DNA、引物、dNTPs等。
2.处理PCR管，加载模板DNA、引物、dNTPs和酶。
3.设置PCR反应器的温度程序，包括变性、退火和延伸等步骤。
4.将PCR反应管放入PCR机中，进行PCR反应。
3.3 凝胶电泳1.准备琼脂糖凝胶板，根据需要调整琼脂糖浓度和凝胶浓度。
2.准备样本，将PCR反应产物与DNA标准样品一同加载到凝胶孔中。
3.加载电泳缓冲液，确保凝胶完全被浸泡。
4.打开电泳仪，进行凝胶电泳，设定一定的电流和时间。
4. 结果分析通过实验，我们可以获得一系列结果。
在DNA提取实验中，我们可以通过测量DNA的浓度和质量来评估提取的效果。
在PCR实验中，可以通过检测PCR产物的大小和数量来评估PCR反应的效果。
在凝胶电泳实验中，可以通过观察凝胶图像来判断PCR产物的大小和纯度。
5. 实验注意事项在进行分子生物学实验时，需要注意以下事项：•实验前要充分准备。
高中生物分子生物学实验指导
高中生物分子生物学实验指导实验简介在这个实验指导中，我们将学习和探索高中生物学领域中的分子生物学。
通过一系列实验，我们将了解分子组成和功能、基因表达和遗传变异等重要概念。
以下是一些实验项目，旨在帮助您更好地理解和应用这些概念。
实验1：DNA提取实验目的了解DNA的结构、提取方法以及其在生物体内的作用。
材料与设备•细胞样本（如水果、口腔拭子或草叶）•蛋白酶K溶液•盐溶液•乙醇•热水浴或振荡培养箱实验步骤1.收集细胞样本并切碎。
2.加入蛋白酶K溶液和盐溶液，并轻轻混合。
3.将混合物置于热水浴或振荡培养箱中加热一段时间。
4.加入冷乙醇，使DNA沉淀。
5.用小棒或管嘴捕捉DNA。
结果与讨论观察提取到的DNA样本，并讨论其外观、形状和特点。
探讨DNA在生物体内的重要作用，例如遗传信息的传递和基因表达。
实验2：凝胶电泳实验目的学习凝胶电泳技术，并了解它在分子生物学中的应用。
材料与设备•DNA样本（可以是已经提取好的或商购）•凝胶（如琼脂糖凝胶）•缓冲液•电泳槽•电源实验步骤1.准备凝胶并制定好缓冲液。
2.加载DNA样本到凝胶孔中。
3.打开电源，进行电泳过程。
4.观察DNA带移动情况，记录结果。
结果与讨论根据DNA样本在凝胶上移动的速度和距离，可以分析其大小和形态差异。
通过对结果进行分析，可以探讨DNA片段大小、测序技术等与人类遗传疾病相关问题。
实验3：PCR反应实验目的学习聚合酶链式反应（PCR）技术，并了解其在基因检测、遗传工程等领域的应用。
材料与设备•DNA样本•PCR试剂盒（含有聚合酶、引物和核苷酸）•PCR仪实验步骤1.配制PCR反应混合液。
2.加入DNA样本到PCR反应管中。
3.将管放置在PCR仪中，进行温度循环。
结果与讨论观察PCR反应后的结果，检测是否扩增了DNA片段。
讨论PCR技术在基因检测、基因工程等领域的重要性和应用。
总结通过这些实验，我们逐步了解了分子生物学的一些核心概念和实验技术。
我们不仅能够提取DNA并观察其特点，还能使用凝胶电泳和PCR反应来分析DNA片段以及进行基因检测。
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分子生物学实验指导生物技术教学室编宁夏大学生命科学学院2008年8月实验一分子生物学实验技术多媒体演示[目的要求]通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。
[教学方式]多媒体光盘演示。
[实验内容]基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA[目的要求]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。
在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。
琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。
(2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。
(3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
(4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。
(5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。
(6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。
在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。
[实验仪器与设备]1. 恒温培养箱2. 琼脂糖凝胶电泳系统3. 高压灭菌锅4. 紫外线透射仪[实验材料]1.三羟甲基氨基甲烷（Tris）2.硼酸3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.溴酚蓝5.蔗糖6.琼脂糖7.溴化乙锭 8.DNA marker9.DNA样品[实验步骤]1.缓冲液的配制①5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)配1000mL 5×TBE:Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20mLPh8.0②凝胶加样缓冲液(6×)溴酚蓝 0.25%蔗糖 40%③溴化乙锭溶液(EB) 0.5μg/mL2.制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。
可参照下表：琼脂糖凝胶浓度线性DNA的有效分离范围0.3% 5-60 kb0.6% 1-20 kb0.7% 0.8-10 kb0.9% 0.5-7 kb1.2% 0.4-6 kb1.5% 0.2-4 kb2.0% 0.1-3 kb3.胶板的制备(1) 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘（或电泳装置所皿备的塑料盘的开口）封住，形成一个胶膜（将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正）。
(2) 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液（1×TBE）。
准确称量的琼脂糖粉。
缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。
在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率。
(3) 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。
如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。
在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。
注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。
应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。
(4) 使溶液冷却至60℃。
加入溴化乙锭（用水配制成10mg/mL的贮存液）到终浓度为0.5ug/mL，充分混匀。
(5) 用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。
(6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。
凝胶的厚度在3-5mm之间。
检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。
(7)在凝胶完全凝固后（于室温放置30-45分钟），小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。
低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4℃，并在冷库中电泳。
(8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。
4．加样DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。
此时凝胶已浸没在缓冲液中。
每个孔的最大加样量，依据DNA的数量及大小而定，一般为20-30μL样品。
已知大小的DNA标准，应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。
确定未知DNA的大小。
测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。
5．电泳在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动速率不同。
因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。
为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。
当溴酚蓝指示剂移到距离胶板下沿约1-2cm处，停止电泳。
[作业]1．在波长为254nm的紫外灯下,观察染色后的电泳凝胶。
2．采用透射紫外光拍照，照相机镜头加近摄光圈和红色滤光片（580-600n m）,距离50-60cm。
采用全色胶卷，5.6光圈,10-20S。
（或采用凝胶成像系统，将图片以文件的形式保存）实验三 DNA的粗提取与鉴定[目的要求]学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。
[实验原理]DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的。
当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。
利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。
DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。
利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
[实验仪器与设备]1. 铁架台2. 玻璃棒(1个)3. 滤纸4. 量筒（100mL，1个）5. 烧杯(100mL1个, 50mL和500mL各2个 )6. 试管（20mL，2个）7. 漏斗(1个) 8. 试管夹(2个)9. 纱布(15块) 10.离心机(1台)[实验材料]1. 鸡血细胞液（5mL~10mL）2. 95%乙醇（预冷24h）3. 蒸馏水4. 柠檬酸钠(质量浓度0.1g/mL)5. 氯化钠(2mol/L和0.015mol/L)6. 二苯胺7. 高氯酸 8.乙醛9. 冰乙酸[实验步骤]实验前需要制备鸡血溶液，制备的方法是：取柠檬酸钠的质量浓度为0.1g/mL的溶液（抗凝剂）100mL，置于500mL烧杯中。
将宰杀活鸡流出的鸡血（约180mL）注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。
然后，将血液倒入离心管内，用1000rpm离心2min，此时血细胞沉淀于离心管底部。
实验时，用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液（如果没有离心机，可以将烧杯中的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀）。
1．提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液5mL~10mL，注入到50mL烧杯中。
向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。
然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL的烧杯中，取其滤液。
2．溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液40mL加入到滤液中，并摇动烧杯，使其混合均匀，这时DNA载溶液中呈溶解状态。
3．析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。
继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。
当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量的浓度相当于0.14mol/L）。
4．滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上。
5．将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液20mL。
用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。
6．过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。
取其滤液，DNA溶于滤液中。
7．提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95%的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含有杂质较少的丝状物。
用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。
这种丝状物的主要成分就是DNA。
注意观察丝状物是什么颜色。
8． DNA的鉴定取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015mol/L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。
然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。
混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。
将观察的结果填写在《实验报告册》上。
[作业]1.步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什么?将得出的结论填写在《实验报告册》上。
2．提取鸡血中的DNA时,为什么要除去血液中的上清液?3. 步骤1和步骤3中都需要加入蒸馏水,两次加入的作用相同吗?为什么?实验四质粒DNA的制备[实验目的]通过本实验，学习和掌握碱裂解法提取质粒。
[实验原理]碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。