细胞培养基本技术学习资料
《细胞培养培训》课件
结
1 细胞培养中的安全问题
在进行细胞培养操作时需要注意一些安全问题，如在安全柜操作，穿戴实验外套和化、功能化和量化方向发展，国内企业正加紧提升技术水 平和产业化水平。
细胞培养培训
细胞培养是生物技术和医学研究中不可或缺的重要技术之一。在本次培训中， 我们将全面介绍细胞培养的基本概念、操作流程和常见问题解决方法。欢迎 大家踊跃参与！
介绍
1 定义
2 重要性
细胞培养是指通过在无菌 环境下加入合适的营养液， 使人类或动物细胞在体外 的人工环境中生长和繁殖 的技术。
细胞培养是研究生命科学 和药物研发不可缺少的技 术。它能够帮助我们理解 细胞的生长、分化、凋亡 和信号传导等基本生理过 程。
2
殖，以获得足够的细胞数量用于实验。 细胞传代技术可以使细胞连续繁殖多代
细胞凋亡是指由一系列信号调控的正常
并保持生物学特性。
细胞死亡程序。在细胞培养中凋亡的部
分或全部细胞可能会影响实验结果。因
此，细胞凋亡检测技术成为了细胞培养
3
细胞培养蛋白表达技术
的重要技术方法。
细胞培养蛋白表达技术是指通过转染外
源性质粒或病毒载体进入细胞，使细胞
3 应用场景
细胞培养技术广泛应用于 基础研究、药物筛选、生 物材料研究、环境毒理学 等领域。
细胞培养的基本概念
细胞种类
主要包括原代细胞、细胞株、酶处理细胞等。不 同种类的细胞具有不同的生长要求，因此对于细 胞的选择要根据科学研究的需要作出选择。
细胞培养的条件
温度、CO2浓度和通气等条件对于细胞培养的影 响非常大。合理的培养条件是保证细胞生长和繁 殖的前提。
细胞培养技术_第一讲
消化液
(1) 胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落
并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。
(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶
克隆培养（clone culture）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距 离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。
群体培养（左）和克隆培养（右）
原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集 落形成，细胞围绕中心漩涡状排列﹙×100﹚
原代培养第7天，多个集落形成并融合﹙×100﹚
细胞系：500元/每株
菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送 二次（周一，周五）。
二、细胞的生长条件 细胞的营养
碳水化合物、氨基酸和脂类三大类 也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素
细胞培养常用液体
水 平衡盐溶液 pH调节液 消化液 抗生素溶液 培养基
近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术， 各国建立细胞库
我国组织培养的发展
20世纪30年代传入我国。
20世纪50年代起步。
20世纪70年代，成为医学和生物学研究 中普遍应用的手段。
细胞培养的优点
1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、 生命活动。
2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素） 利用方法：研究技术、记录方法
常用培养器皿及清洗消毒
玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤
细胞培养技术
细胞培养重要名词
核型(Karyotype)：一个细胞全部染色体的组成和 所有特征。 合核体(Synkaryon)：两个细胞融合后形成的单核 杂种细胞。 活力(Viability)：以100个细胞中存活细胞数表示。
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细胞培养重要名词
接触抑制(Contact inhibition)：指细胞相互接触后 失去运动(移动)的现象。
上世纪初（1907年）美国科学家Harrison和Carrel创建 的、以淋巴液为培养基在试管内成功地培养了蛙胚神经 组织。50年代在培养容器、培养液及技术操作上都进行 了大的改进，使细胞培养进入一个突飞猛进的发展阶段。
70年代，随着遗传缺陷细胞株的培育，杂交瘤技术制备 单克隆抗体，癌基因转染及基因工程出现，使细胞培养 技术不仅用于研究生命科学，也成为生物工程、基因工 程和组织工程等学科的生产手段。
溶酶原激活剂；激素：EPO和促黄体生成素等；杀虫剂：杆状病 毒；肿瘤特异抗原；癌胚抗原；通过杂交瘤生产的各种单克隆 抗体；细胞本身（如干细胞）；皮肤重植等。
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三、对细胞培养的评价
（三）细胞培养技术的商业化 对于生物技术所使用的各种细胞株的价值，现 尚难作出评价。1998年，美国市场就达3.5-4亿美 元，而且每年还以6-8%的速度增长。美国细胞株供 应公司和机构及国内供应单位可在网上查询 。
Expession Systems 杆病毒细胞株的主要供应者
Life Tech
供应基础研究用的特异化细胞株
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三、对细胞培养的评价
（四）组织（细胞）培养的局限性 细胞（组织） 培养 ，包括器官培养终归是离体
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三、对细胞培养的评价
invitrogan 有关不同细胞株的用户 论坛ATCC 各种细胞株的主要供应者 提供 有关细胞株的筛选
实验室细胞培养基本知识
• 不耐热液体：过滤除菌；
• 不耐热物品：射线灭菌30min，70%乙醇擦拭。
灭菌方式的选择
项目 玻璃器皿 金属制品 带螺口盖的玻璃品 玻璃移液管 枪头 消毒方式 干热 干热 高压灭菌，将盖悬 松 干热 高压灭菌 高压灭菌 琼脂 蛋白胨 EDTA 甘油 过滤 氨基酸 抗生素 牛血清白蛋白 胶原酶
HEPES 甲基纤维素
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。
• 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
明确地选择出来，就成为一个细胞株。
细胞培养基本概念
• 有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后 就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这 种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞 系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生， 也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力 后，就成为连续细胞系。 • 培养条件：细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一 定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、 维生素、矿物质 )、生长因子、激素和气体 (O2、CO2)，并可调节其 物理化学环境 (pH、渗透压、温度)。
湿热灭菌121℃，20min（高速离心管尤其注意灭菌时要直立放
臵）； • 自然冷却后臵于烘箱中烘干。
水的制备和灭菌
• 细胞培养需要用超纯水（UPW）； • 第一：反向渗透或蒸馏；第二：碳过滤去除有机或无机胶 体（总有机碳TOC ≤10ug/L）；第三：去离子（电阻 ≥10MΩ/cm）； • 高压灭菌121℃，20min，自然冷却。
配置完全培养基
细胞培养的基本方法-细胞分离技术
细胞培养的基本方法-细胞分离技术细胞分离技术一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。
细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。
下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。
1. 胰蛋白酶（Trypsin）•在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。
让组织碎片沉淀，去除上清液。
重复清洗2到3次。
•将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。
加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。
•在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
•移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
•在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。
如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
•通过无菌不锈钢丝网（100〜200mm过滤，分散所有剩余组织。
计数和接种细胞，进行培养。
2. 胶原酶（Collagenase）•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片几次。
•加入胶原酶（50〜200单位/ml，溶解在HBSS中）。
•在37C孵育4到18小时。
加入3mM CaCI2增加解离效率。
•通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。
如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。
•通过离心在HBSS中清洗悬液几次。
•再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
3. Dis pase•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
•加入Dispase （0.6〜2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液）•在37C孵育20分钟到几个小时。
细胞培养基本技术
医学实验中心 闾宏伟
主要内容
细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养用液的配制 细胞培养的基本方法 培养细胞活力测定 细胞冻存和复苏 细胞培养的污染和检测
一、基本概念
细胞培养(cell culture)：在体外条件下，模 拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生 长与增殖的技术。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵 育，细胞自其周围移出并生长。 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出，置于体外生存、 生长并同时保持其一定的结构和功能特征。
血清解冻步骤
逐步解冻法
–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可 分装40～45 ml。
勿直接由–20℃至37℃解冻，因温度改变 太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
无机盐
CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、 NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性 及溶液的酸碱度都是必须的。
酶液等均采用滤过法除菌。
安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝
上，否则起不到过滤的作用。
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2 使用CO2培养箱应注意的问题：
。
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，
以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。 ③箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000 毫升，以保持箱内湿度。
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
细胞培养技术
细胞培养技术
细胞培养技术，是生物学研究中非常重要的一个实验技术。
通过细
胞培养技术，研究人员可以将细胞在体外进行培养、繁殖和实验操作，从而深入研究细胞的生理功能、生化特性和病理变化。
细胞培养技术
的应用范围非常广泛，涉及生物医学、药物研发、基因工程、毒理学
等多个领域。
一、细胞培养技术的基本原理
细胞培养技术是基于细胞的自身生存条件进行设计的。
细胞在体外
培养时，需要提供适当的生长环境，包括营养物质、生长因子、温度、湿度等条件。
在细胞培养中，通常会使用培养基来提供细胞所需的养
分和环境，培养基的种类和配方会根据不同的细胞类型和实验目的进
行选择。
二、细胞培养技术的应用领域
细胞培养技术在生物医学领域有着重要的应用，可以用于研究细胞
生长、细胞信号传导、细胞凋亡等生理过程，也可以用于筛选药物、
评估药效及毒性。
此外，在基因工程和生物技术领域，细胞培养技术
也扮演着关键角色，如基因转染、蛋白表达等方面均需要借助细胞培
养技术。
三、细胞培养技术的挑战和发展
随着科学技术的不断进步，细胞培养技术也在不断发展。
但是，细
胞培养中仍然存在一些挑战，如细胞的纯化、传代过程中的遗传变异
等问题，这些都对研究结果的准确性提出了挑战。
未来，细胞培养技术将继续向着更高效、更精准的方向发展，为生物学研究提供更多可能。
细胞培养技术作为生物学研究中不可或缺的一部分，其重要性不言而喻。
通过不断地探索和创新，相信细胞培养技术将会在更多领域展现出其巨大的应用潜力，为人类的健康和生活质量带来更多的改变和进步。
细胞培养基本知识基本技术
医学院 中心实验室 谷景义 85225841
主要内容： •1、细胞培养基本知识 •2、培养细胞生长环境 •3、细胞培养基本技术
•4、培养细胞质量控制
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
二、培养细胞生长环境
Cell Culture Environment
Substrate Gas Medium Serum Supplements
Glass ﹠ Plastic Culture Vessels ……
O2 CO2
……
pH Osmolality Temperature ……
Hormones FBS Growth factors NCS Antibiotic ……
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。 • 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。 • 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
细胞培养技术的特点及应用
优点：
1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
缺点：体外培养的细胞不能完全Байду номын сангаас同于体 内的细胞。
细胞培养基本知识技术
物质溶解其中。 • 4．大气的CO2溶解 （二）纯化水制备应注意事项： • 在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放置纯
化水的装置。 • 所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用
硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。
• CO2培养箱是培养细胞的专用设备. • CO2培养箱培养细胞必须满足细胞生长的
三个条件. • 稳定的温度. • 大于95%的相对湿度. • 稳定的CO2浓度 • 三气培养箱是从CO2培养箱基础上发展出来
的新品种,它可同时控制O2浓度.
注意事项
• 1 用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证 通气。但瓶口过松，易污染。
倒置显微镜
工作原理
一般情况下,人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮 度)发生变化时,才能看到被检测物体.但生活状态下的细胞 都呈无色透明,光线通过这些物体时波长和振幅并不发生 变化，因此用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。 相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折 射率有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射 率小的物体中前进的距离较短，此距离叫光程差，由于光 程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微 镜可使肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明 暗差），使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。
（三）纯化水的常用制备方法
• 1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合
• 水中含有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类， 以及O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换 树脂除去。
• 采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常使用强酸 性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂， 将水流通过离子交换柱即得纯净的去离子水。
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程细胞培养实验是指将动植物组织或细胞从体内分离并在无菌条件下培养的一种技术手段。
这种技术可以用于研究细胞的生物学特性、疾病的发生机制以及药物的筛选等方面。
以下是细胞培养实验的基本流程和无菌操作的相关知识。
一、细胞培养的基本知识1.细胞培养的种类：常用的细胞培养种类有原代细胞培养、细胞株的维持和传代培养以及细胞系的培养。
2.细胞培养的培养基：细胞培养的培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基。
其中，无血清培养基是通过添加一定的生长因子和营养物质来满足细胞生长的需要，而含血清培养基则是使用含有细胞生长因子和营养物质的胎牛血清来供养细胞。
3.传代培养的液氮保存：为了保持细胞株的可用性，可以将细胞株保存在液氮中，以备将来使用。
4.细胞培养中的无菌操作：细胞培养实验需要在无菌条件下进行操作，以防止细胞污染和外源性菌落的输入。
1.工作台和操作区域的消毒：操作前，需要用75％的酒精或其他合适的消毒剂彻底清洁工作台面、培养箱、玻璃器皿等操作区域。
2.培养器具的消毒：需要对培养器具如离心管、移液枪、显微镜等进行高温高压的无菌处理。
3.培养基的制备和滤过：制备培养基时需要将培养基溶液进行高温高压的杀菌处理，并使用0.22微米的滤膜滤过杂质。
4.无菌技术的掌握：在细胞培养实验中，需要学习和掌握无菌技术，如无菌操作台、细菌灯和无菌手套等的正确使用方法。
5.细胞的分离和悬浮：将组织样本放入消化液中，进行细胞的分离和悬浮，并通过离心和过滤的方式获得单个细胞悬浮液。
6.细胞培养的接种：将细胞悬浮液接种在含有培养基的培养皿或离心管中，放入培养箱中进行培养。
7.细胞传代的操作：当细胞达到一定密度后，需要进行细胞传代操作。
传代操作时，需要将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，并加入新的培养基进行细胞的维持和生长。
总之，细胞培养实验是生物学研究中不可或缺的一项实验技术，掌握细胞培养的基本知识和无菌操作流程对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
细胞培养基础知识
Anhui DeepBlue Medical Technology CO. LTD
新的玻璃器皿的清洗灭菌
自来水刷洗，除去灰尘。 烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅
、砷等物。 刷洗、烘干：泡酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲
洗干净后用烤箱烘干。 泡酸、清洗：用酸浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗10次，
我们进行体外细胞培养，实际是在细胞群体和个体的情况下考查细胞行为的。大部分细胞群体都由
分裂和不分裂两部细胞混合组成。而不分裂细胞又可分为两类：即保持再进入细胞周期能力的G0期
细胞（或叫静置细胞或休止细胞）及不分裂最终注定要死亡的终止分化细胞（或称之终端分化细胞
），他们不能再进入周期。进入周期内的细胞可以分为两个期：间期（G1+S+G2），M期（有丝分裂
单抗基本知识 细胞基本知识 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 细胞培养 细胞计数 冻存、复苏
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设备与器材准备、溶液配制
一、细胞常用设备和器材
超净工作台
二氧化塔摇床
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Anhui DeepBlue Medical Technology CO. LTD
细胞培养基本方法
细胞培养基本方法细胞培养是基于体外环境中的人工维持细胞生长和分裂的技术。
它是细胞生物学研究和生物医学领域的重要工具。
细胞培养的基本方法包括选择细胞系、培养细胞、传代细胞等步骤。
下面将详细介绍细胞培养的基本方法。
其次，培养细胞是细胞培养的核心步骤。
培养细胞需要提供适宜的培养基和生长因子。
培养基是细胞在培养过程中所需的营养物质和环境因素的混合物。
常用的培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute 1640 medium）等。
培养基中的营养物质包括碳水化合物、氨基酸、维生素、微量元素等，它们为细胞提供能量和构建细胞结构的物质。
生长因子是一类具有促进细胞增殖和分化的生物活性物质，如胰岛素样生长因子、表皮生长因子等。
在培养细胞时，需要将细胞放入含有培养基和生长因子的培养皿中，并提供适宜的培养条件（如37°C的恒温箱和5% CO2的培养箱）。
最后，传代细胞是细胞培养的重要步骤。
传代是指细胞在体外培养过程中不断进行细胞分裂和生长的过程。
细胞的传代可以扩增细胞数量，并保持细胞的稳定性。
传代细胞的方法一般有机械分离法和酶解法两种。
机械分离法是利用离心、剪切力或刮刀等方法将细胞从培养皿上分离下来，酶解法是将细胞培养在含有蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶的溶液中，使细胞与培养皿分离。
传代细胞的频率一般为1:3或1:4，即将细胞从一个培养皿传到3或4个新的培养皿中。
细胞培养的基本方法还包括细胞检测和培养条件的管理。
细胞检测是通过不同方法（如细胞计数、细胞活力检测、细胞形态观察等）对培养细胞的状态和生长情况进行监测。
培养条件的管理包括培养皿的清洁和消毒、培养基的配制和保存、培养箱和恒温箱的维护等。
总之，细胞培养是一项复杂而精细的实验技术，在细胞生物学和生物医学研究中具有重要的应用价值。
通过选择合适的细胞系、培养细胞、传代细胞等方法，可以成功地进行细胞培养实验，并获得可靠的实验结果。
细胞培养基本技术(3)
◆ 光照：光强、 光质、光照时间
3
一、 动植物细胞工程实验室通用仪器设备
超净工作台
n超净工作台的工作原理是 利用鼓风机驱动空气遁过高 效滤器除去空气中的尘埃颗 粒，使空气得到净化。净化 空气徐徐通过工作台面，使 工作台内构成无菌环境。
4
冰箱
■ 普通冰箱
（4℃，－20 ℃ ）
■ 低温冰箱（－20 ℃ ） ■ 超低温冰箱（－80 ℃ ）
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一、玻璃器皿的清洗
WHY?
◆ 浸泡 新瓶使用前用自来水简单刷洗，后用稀盐酸浸泡过夜。
使用过的器皿应立即浸入水中，避免干涸难洗
◆ 刷洗 软毛刷沾洗涤剂洗涤 ◆ 浸酸 关键一环。时间不少于于小6 时，一般过夜。清洁液变
绿应重新配制。
◆ 冲洗 洗涤装置与手工
◆ 烘干、包装、高压（15磅20分钟）或干热（160度2小时）
生物安全四级(BSL—4)：处理特别危险的传染源
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Summary：细胞培养的基本条件
无菌条件 ：净化工作室，高效过滤器 ，生物安全柜， 超净工作台， 紫外灯 ，电热干燥箱，滤器， 高压灭菌器，抗生素
细胞生长条件 ：纯水蒸馏器， 纯水仪，培养板，培养瓶， CO2培养箱， 培养基，血清
细胞检测条件 ：倒置显微镜， 酶标仪 ，微孔板震荡器， 高速离心机， 移液器
塑料 制品
橡胶 制品
＋
培养 用液
＋
布类 棉类
＋
干热
＋ ＋
＋
过滤
消毒剂
电离 辐射
＋＋
＋
＋＋
＋＋＋
＋＋＋
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重要概念
消毒与灭菌
1.消毒 2.灭菌 3.防腐
杀死物体上病原微生物的方法；并不一定能 杀死含芽胞的细菌或非病原微生物 杀死物体上所有微生物的方法。
细胞培养的基本原理和技术
细胞培养的基本原理和技术细胞培养是现代生物学研究中的重要技术之一，它可以为疾病的发现、药物的研发、细胞相互作用的探究等提供技术支持，因此在生命科学领域中有着广泛的应用。
在本文中，我们将会从细胞培养的基本原理及技术进行探讨，包括细胞培养的种类、基本原理、培养环境和培养技术。
1.细胞培养的种类细胞培养可以分为体外细胞培养和体内细胞培养两种。
体外细胞培养是指将细胞置于培养液中并在特定的温度、湿度、氧气浓度、pH值等条件下；通过培养皿、培养器等实验设备进行体外培养；而体内细胞培养则是将生物体内的细胞移植到另一个生物体内进行培养。
因为体内细胞培养的操作过于复杂，因此体外细胞培养被广泛应用于现代生物科学研究中。
2.细胞培养的基本原理细胞培养的基本原理可以归纳为两个方面，生理学基础和实验室技术。
生理学基础主要是指细胞是生命体系中的基本单位，对于其生理生化反应机制的深入理解可以为培养细胞提供一些基本的理论指导，具体可以理解为，细胞培养需要提供适合其生长发育的生长基质、培养液、气氛、营养等元素，同时理解细胞的生理学功能、生物化学反应机制有助于提供培养条件的优化。
而实验室技术则包括无菌操作、培养器具、培养液的制备等方面，是保证细胞培养成功的关键。
3.培养环境的设定细胞培养所需要的培养环境包括适合细胞生长的生长基质、培养液、气氛等因素，其中生长基质是细胞生长发育的基本支持物，可以理解为支架。
常见的生长基质有培养皿、网状物、凝胶等，它们都是在实验基础的条件下，为细胞提供生长空间和黏着面的特种物质。
培养液是细胞生长发育所需要的保证，它包括必需的氨基酸、营养素、菌落刺激因子等，在细胞培养中，常常需要通过修改培养液的成分达到生长优化的目的。
而氧气浓度、pH值等则是影响细胞生长和分化的关键因素，理解它们的含义并合理控制可以为培养细胞提供更优质的环境。
4.细胞培养的技术细胞培养技术可以分为无菌操作、细胞接种、细胞增殖、颜色检测、活体显微镜检测等步骤。
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（H）收集淡黄色的细胞滋养层细胞，清洗一次，接种 于涂有I型胶原的24孔培养板中，于37℃，95 ％空气和 5 ％CO2条件下培养。
（I）所得细胞经免疫荧光染色cytokeratin 7阳性， vimentin 阴性。本方法所获得细胞滋养层细胞纯度约 为95%左右。
• 3. 取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏 死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少
量培养液中；
原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有 75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入 超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取 出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠 胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
细胞培养基本技术
第一节 细胞原代培养
• 原代培养也叫初代培养，是从供体取得 组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养组织或细胞的特点：
• 1．组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生 很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反 映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实 验的很好对象；
• 2. 缺点是成分组成比较复杂，因而原代培养细 胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格 的对比性实验研究，还需对细胞进行短期传代 后进行。
（2）例如：滋养层细胞分离与培养：
（A）真空负压抽吸的早期绒毛组织在无菌条件下置于 冰浴PBS（含1 mM葡萄糖）中取回。
（B）在无菌条件下立即用无Ca2+和Mg2+的PBS漂洗 15-20次以除去血块。
（C）用解剖刀片从基膜上轻轻刮下绒毛，用剪刀剪碎 至1-2毫米左右。
（D）加入5 ％胰蛋白酶330μl(1：25)至10ml细胞悬液中， 4℃消化45min。勿动，静置，然后去上清。
（3）计数：
细胞浓度的计算：
Volume (体积) =長 x 寬 x 深度 = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm3 = 1 x 10-4 cm3 (ml)
细胞密度(个/mL) = 4个大方格的细胞总数/4 ÷10-4
=4个大方格的细胞总数/4 ×104
------培养室的消毒
• 培养室每天用0.2%的新洁尔灭或2%~5%的来苏儿 拖洗地面一次（拖布专用），30瓦紫外灯管照射消 毒30~50分钟。
-------超净工作台的消毒
2、无菌培养操作注意事项：
• （为保证无菌，除实验所需物品需预先消毒外， 实验中还需保持无菌操作）。
-----工作台面上的用品要布局合理，原则上是右 手使用的东西置右侧，左手使用的东西置左侧， 酒精灯置中央；
12
4.5
1～3
1×106
24孔板
24
2
0.5～2
5×105
48孔板
48
1
0.25～1
—
96孔板
96
1
0.05～0.1
—
Animal Cell Biotechnology —— College of Veterinary Medicine——MA Bao-hua
动物细胞工程的实验室基础
培养器皿特性
一、原代培养的方法
• (一)、消化培养法 • (二) 、组织块培养法 • （三）、其它（如机械方法）
(一)、消化培养法
1、培养前的准备
------培养用品的消毒
• 根据所要进行的具体培养对象如组织块贴壁原代培 养、末梢血白细胞培养、传代培养等，准备培养所 需器械和物品，清点无误后进行清洗、包装和消毒 灭菌。
-----实验前点燃酒精灯，一切操作如安装吸管帽、 打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧 灼进行。
3、常用消化试剂：
胰蛋白酶、胶原酶、蛋白水解酶、EDTA
4、原代细胞培养程序
• 1、取材 • 2、漂洗 • 3、剪切 • 4、消化 • 5、过滤 • 6、清洗 • 7、计数 • 8、接种
（1）、培养细胞的取材
培养器皿
培养物备份
每孔面积 /cm2
每孔推荐 液体量/ml
预计的HeLa细胞产量
动物细胞工程的实验室基础
培养器皿
培养器皿特性
培养物备份
每孔面积 /cm2
每孔推荐 液体量/ml
预计的HeLa细胞产量
多孔板
微量滴定板
96
0.32
0.1
l×105
微量滴定板
144
表表033.--333 培培2养养器器皿皿特特性性
0.1
1×105
4孔板
4
2
2
5×105ຫໍສະໝຸດ 6孔板69.6
2～4
2×106
12孔板
（E）重新加入消化液37℃消化10min。勿动，静置， 然后去一半上清。加等体积Ham’s F12:DMEM 1:1(FD) 培养液（内含10 ％胎牛血清、1 mM丙酮酸钠和2 mM 谷氨酰胺）终止消化，吹打细胞悬液。
（F）再加入终浓度为15 IU/ml的DNA酶Ⅰ37℃消化10 min。吹打细胞呈悬浮状，经80目和150目细胞筛过滤， 1,000×rpm离心10 min收集细胞。
切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科 手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块， 再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟， 使组织块自然沉淀到管底，弃去上清
消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍 量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔 几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细 胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧 化碳培养箱中培养
• 1. 取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡
于培养液内放置于冰浴或40C冰箱。若组织块很大，应先将其切成 1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24小时，因放置时间长 或组织块太大都易造成细胞的死亡；
• 2. 取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液
的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学 试剂及有害药物如碘、汞等。从消化道及周围有坏死组织等有污染因 素存在的区域取材时，为减少污染，可用含500~1000单位/ml的青、 链霉素BSS液漂洗5~10分钟，或用10% 达克宁注射液冲洗浸泡10分钟 再作培养；