细胞培养基本技术学习资料
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《细胞培养培训》课件
细胞培养过程中产生的废液和 废弃物不可随意处理。实验室 应该制定废物处理计划并妥善 处理、处置，确保环保。
结
1 细胞培养中的安全问题
在进行细胞培养操作时需要注意一些安全问题，如在安全柜操作，穿戴实验外套和化、功能化和量化方向发展，国内企业正加紧提升技术水 平和产业化水平。
细胞培养培训
细胞培养是生物技术和医学研究中不可或缺的重要技术之一。在本次培训中， 我们将全面介绍细胞培养的基本概念、操作流程和常见问题解决方法。欢迎 大家踊跃参与！
介绍
1 定义
2 重要性
细胞培养是指通过在无菌 环境下加入合适的营养液， 使人类或动物细胞在体外 的人工环境中生长和繁殖 的技术。
细胞培养是研究生命科学 和药物研发不可缺少的技 术。它能够帮助我们理解 细胞的生长、分化、凋亡 和信号传导等基本生理过 程。
2
殖，以获得足够的细胞数量用于实验。 细胞传代技术可以使细胞连续繁殖多代
细胞凋亡是指由一系列信号调控的正常
并保持生物学特性。
细胞死亡程序。在细胞培养中凋亡的部
分或全部细胞可能会影响实验结果。因
此，细胞凋亡检测技术成为了细胞培养
3
细胞培养蛋白表达技术
的重要技术方法。
细胞培养蛋白表达技术是指通过转染外
源性质粒或病毒载体进入细胞，使细胞
3 应用场景
细胞培养技术广泛应用于 基础研究、药物筛选、生 物材料研究、环境毒理学 等领域。
细胞培养的基本概念
细胞种类
主要包括原代细胞、细胞株、酶处理细胞等。不 同种类的细胞具有不同的生长要求，因此对于细 胞的选择要根据科学研究的需要作出选择。
细胞培养的条件
温度、CO2浓度和通气等条件对于细胞培养的影 响非常大。合理的培养条件是保证细胞生长和繁 殖的前提。
结
1 细胞培养中的安全问题
在进行细胞培养操作时需要注意一些安全问题，如在安全柜操作，穿戴实验外套和化、功能化和量化方向发展，国内企业正加紧提升技术水 平和产业化水平。
细胞培养培训
细胞培养是生物技术和医学研究中不可或缺的重要技术之一。在本次培训中， 我们将全面介绍细胞培养的基本概念、操作流程和常见问题解决方法。欢迎 大家踊跃参与！
介绍
1 定义
2 重要性
细胞培养是指通过在无菌 环境下加入合适的营养液， 使人类或动物细胞在体外 的人工环境中生长和繁殖 的技术。
细胞培养是研究生命科学 和药物研发不可缺少的技 术。它能够帮助我们理解 细胞的生长、分化、凋亡 和信号传导等基本生理过 程。
2
殖，以获得足够的细胞数量用于实验。 细胞传代技术可以使细胞连续繁殖多代
细胞凋亡是指由一系列信号调控的正常
并保持生物学特性。
细胞死亡程序。在细胞培养中凋亡的部
分或全部细胞可能会影响实验结果。因
此，细胞凋亡检测技术成为了细胞培养
3
细胞培养蛋白表达技术
的重要技术方法。
细胞培养蛋白表达技术是指通过转染外
源性质粒或病毒载体进入细胞，使细胞
3 应用场景
细胞培养技术广泛应用于 基础研究、药物筛选、生 物材料研究、环境毒理学 等领域。
细胞培养的基本概念
细胞种类
主要包括原代细胞、细胞株、酶处理细胞等。不 同种类的细胞具有不同的生长要求，因此对于细 胞的选择要根据科学研究的需要作出选择。
细胞培养的条件
温度、CO2浓度和通气等条件对于细胞培养的影 响非常大。合理的培养条件是保证细胞生长和繁 殖的前提。
细胞培养技术_第一讲
消化液
(1) 胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落
并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。
(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶
克隆培养（clone culture）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距 离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。
群体培养（左）和克隆培养（右）
原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集 落形成，细胞围绕中心漩涡状排列﹙×100﹚
原代培养第7天，多个集落形成并融合﹙×100﹚
细胞系：500元/每株
菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送 二次（周一，周五）。
二、细胞的生长条件 细胞的营养
碳水化合物、氨基酸和脂类三大类 也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素
细胞培养常用液体
水 平衡盐溶液 pH调节液 消化液 抗生素溶液 培养基
近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术， 各国建立细胞库
我国组织培养的发展
20世纪30年代传入我国。
20世纪50年代起步。
20世纪70年代，成为医学和生物学研究 中普遍应用的手段。
细胞培养的优点
1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、 生命活动。
2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素） 利用方法：研究技术、记录方法
常用培养器皿及清洗消毒
玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤
细胞培养技术
细胞培养重要名词
核型(Karyotype)：一个细胞全部染色体的组成和 所有特征。 合核体(Synkaryon)：两个细胞融合后形成的单核 杂种细胞。 活力(Viability)：以100个细胞中存活细胞数表示。
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细胞培养重要名词
接触抑制(Contact inhibition)：指细胞相互接触后 失去运动(移动)的现象。
上世纪初（1907年）美国科学家Harrison和Carrel创建 的、以淋巴液为培养基在试管内成功地培养了蛙胚神经 组织。50年代在培养容器、培养液及技术操作上都进行 了大的改进，使细胞培养进入一个突飞猛进的发展阶段。
70年代，随着遗传缺陷细胞株的培育，杂交瘤技术制备 单克隆抗体，癌基因转染及基因工程出现，使细胞培养 技术不仅用于研究生命科学，也成为生物工程、基因工 程和组织工程等学科的生产手段。
溶酶原激活剂；激素：EPO和促黄体生成素等；杀虫剂：杆状病 毒；肿瘤特异抗原；癌胚抗原；通过杂交瘤生产的各种单克隆 抗体；细胞本身（如干细胞）；皮肤重植等。
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三、对细胞培养的评价
（三）细胞培养技术的商业化 对于生物技术所使用的各种细胞株的价值，现 尚难作出评价。1998年，美国市场就达3.5-4亿美 元，而且每年还以6-8%的速度增长。美国细胞株供 应公司和机构及国内供应单位可在网上查询 。
Expession Systems 杆病毒细胞株的主要供应者
Life Tech
供应基础研究用的特异化细胞株
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三、对细胞培养的评价
（四）组织（细胞）培养的局限性 细胞（组织） 培养 ，包括器官培养终归是离体
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三、对细胞培养的评价
invitrogan 有关不同细胞株的用户 论坛ATCC 各种细胞株的主要供应者 提供 有关细胞株的筛选
实验室细胞培养基本知识
• 不耐热液体：过滤除菌；
• 不耐热物品：射线灭菌30min，70%乙醇擦拭。
灭菌方式的选择
项目 玻璃器皿 金属制品 带螺口盖的玻璃品 玻璃移液管 枪头 消毒方式 干热 干热 高压灭菌，将盖悬 松 干热 高压灭菌 高压灭菌 琼脂 蛋白胨 EDTA 甘油 过滤 氨基酸 抗生素 牛血清白蛋白 胶原酶
HEPES 甲基纤维素
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。
• 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
明确地选择出来，就成为一个细胞株。
细胞培养基本概念
• 有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后 就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这 种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞 系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生， 也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力 后，就成为连续细胞系。 • 培养条件：细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一 定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、 维生素、矿物质 )、生长因子、激素和气体 (O2、CO2)，并可调节其 物理化学环境 (pH、渗透压、温度)。
湿热灭菌121℃，20min（高速离心管尤其注意灭菌时要直立放
臵）； • 自然冷却后臵于烘箱中烘干。
水的制备和灭菌
• 细胞培养需要用超纯水（UPW）； • 第一：反向渗透或蒸馏；第二：碳过滤去除有机或无机胶 体（总有机碳TOC ≤10ug/L）；第三：去离子（电阻 ≥10MΩ/cm）； • 高压灭菌121℃，20min，自然冷却。
配置完全培养基
细胞培养的基本方法-细胞分离技术
细胞培养的基本方法-细胞分离技术细胞分离技术一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。
细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。
下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。
1. 胰蛋白酶（Trypsin）•在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。
让组织碎片沉淀，去除上清液。
重复清洗2到3次。
•将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。
加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。
•在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
•移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
•在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。
如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
•通过无菌不锈钢丝网（100〜200mm过滤，分散所有剩余组织。
计数和接种细胞，进行培养。
2. 胶原酶（Collagenase）•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片几次。
•加入胶原酶（50〜200单位/ml，溶解在HBSS中）。
•在37C孵育4到18小时。
加入3mM CaCI2增加解离效率。
•通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。
如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。
•通过离心在HBSS中清洗悬液几次。
•再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
3. Dis pase•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
•加入Dispase （0.6〜2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液）•在37C孵育20分钟到几个小时。
细胞培养基本技术
研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识
医学实验中心 闾宏伟
主要内容
细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养用液的配制 细胞培养的基本方法 培养细胞活力测定 细胞冻存和复苏 细胞培养的污染和检测
一、基本概念
细胞培养(cell culture)：在体外条件下，模 拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生 长与增殖的技术。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵 育，细胞自其周围移出并生长。 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出，置于体外生存、 生长并同时保持其一定的结构和功能特征。
血清解冻步骤
逐步解冻法
–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可 分装40～45 ml。
勿直接由–20℃至37℃解冻，因温度改变 太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
无机盐
CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、 NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性 及溶液的酸碱度都是必须的。
酶液等均采用滤过法除菌。
安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝
上，否则起不到过滤的作用。
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2 使用CO2培养箱应注意的问题：
。
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，
以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。 ③箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000 毫升，以保持箱内湿度。
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
医学实验中心 闾宏伟
主要内容
细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养用液的配制 细胞培养的基本方法 培养细胞活力测定 细胞冻存和复苏 细胞培养的污染和检测
一、基本概念
细胞培养(cell culture)：在体外条件下，模 拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生 长与增殖的技术。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵 育，细胞自其周围移出并生长。 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出，置于体外生存、 生长并同时保持其一定的结构和功能特征。
血清解冻步骤
逐步解冻法
–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可 分装40～45 ml。
勿直接由–20℃至37℃解冻，因温度改变 太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
无机盐
CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、 NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性 及溶液的酸碱度都是必须的。
酶液等均采用滤过法除菌。
安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝
上，否则起不到过滤的作用。
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2 使用CO2培养箱应注意的问题：
。
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，
以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。 ③箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000 毫升，以保持箱内湿度。
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
细胞培养技术
细胞培养技术
细胞培养技术，是生物学研究中非常重要的一个实验技术。
通过细
胞培养技术，研究人员可以将细胞在体外进行培养、繁殖和实验操作，从而深入研究细胞的生理功能、生化特性和病理变化。
细胞培养技术
的应用范围非常广泛，涉及生物医学、药物研发、基因工程、毒理学
等多个领域。
一、细胞培养技术的基本原理
细胞培养技术是基于细胞的自身生存条件进行设计的。
细胞在体外
培养时，需要提供适当的生长环境，包括营养物质、生长因子、温度、湿度等条件。
在细胞培养中，通常会使用培养基来提供细胞所需的养
分和环境，培养基的种类和配方会根据不同的细胞类型和实验目的进
行选择。
二、细胞培养技术的应用领域
细胞培养技术在生物医学领域有着重要的应用，可以用于研究细胞
生长、细胞信号传导、细胞凋亡等生理过程，也可以用于筛选药物、
评估药效及毒性。
此外，在基因工程和生物技术领域，细胞培养技术
也扮演着关键角色，如基因转染、蛋白表达等方面均需要借助细胞培
养技术。
三、细胞培养技术的挑战和发展
随着科学技术的不断进步，细胞培养技术也在不断发展。
但是，细
胞培养中仍然存在一些挑战，如细胞的纯化、传代过程中的遗传变异
等问题，这些都对研究结果的准确性提出了挑战。
未来，细胞培养技术将继续向着更高效、更精准的方向发展，为生物学研究提供更多可能。
细胞培养技术作为生物学研究中不可或缺的一部分，其重要性不言而喻。
通过不断地探索和创新，相信细胞培养技术将会在更多领域展现出其巨大的应用潜力，为人类的健康和生活质量带来更多的改变和进步。
细胞培养基本知识基本技术
细胞培养的基本知识、 基本技术
医学院 中心实验室 谷景义 85225841
主要内容： •1、细胞培养基本知识 •2、培养细胞生长环境 •3、细胞培养基本技术
•4、培养细胞质量控制
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
二、培养细胞生长环境
Cell Culture Environment
Substrate Gas Medium Serum Supplements
Glass ﹠ Plastic Culture Vessels ……
O2 CO2
……
pH Osmolality Temperature ……
Hormones FBS Growth factors NCS Antibiotic ……
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。 • 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。 • 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
细胞培养技术的特点及应用
优点：
1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
缺点：体外培养的细胞不能完全Байду номын сангаас同于体 内的细胞。
医学院 中心实验室 谷景义 85225841
主要内容： •1、细胞培养基本知识 •2、培养细胞生长环境 •3、细胞培养基本技术
•4、培养细胞质量控制
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
二、培养细胞生长环境
Cell Culture Environment
Substrate Gas Medium Serum Supplements
Glass ﹠ Plastic Culture Vessels ……
O2 CO2
……
pH Osmolality Temperature ……
Hormones FBS Growth factors NCS Antibiotic ……
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。 • 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。 • 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
细胞培养技术的特点及应用
优点：
1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
缺点：体外培养的细胞不能完全Байду номын сангаас同于体 内的细胞。
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（G）重复离心洗涤二次，再次重悬细胞，细胞悬液经 1.25-2.5％BSA（FD配制）的密度梯度沉降1 h。
（H）收集淡黄色的细胞滋养层细胞，清洗一次，接种 于涂有I型胶原的24孔培养板中，于37℃，95 ％空气和 5 ％CO2条件下培养。
（I）所得细胞经免疫荧光染色cytokeratin 7阳性， vimentin 阴性。本方法所获得细胞滋养层细胞纯度约 为95%左右。
• 3. 取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏 死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少
量培养液中；
原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有 75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入 超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取 出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠 胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
细胞培养基本技术
第一节 细胞原代培养
• 原代培养也叫初代培养，是从供体取得 组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养组织或细胞的特点：
• 1．组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生 很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反 映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实 验的很好对象；
• 2. 缺点是成分组成比较复杂，因而原代培养细 胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格 的对比性实验研究，还需对细胞进行短期传代 后进行。
（2）例如：滋养层细胞分离与培养：
（A）真空负压抽吸的早期绒毛组织在无菌条件下置于 冰浴PBS（含1 mM葡萄糖）中取回。
（B）在无菌条件下立即用无Ca2+和Mg2+的PBS漂洗 15-20次以除去血块。
（C）用解剖刀片从基膜上轻轻刮下绒毛，用剪刀剪碎 至1-2毫米左右。
（D）加入5 ％胰蛋白酶330μl(1：25)至10ml细胞悬液中， 4℃消化45min。勿动，静置，然后去上清。
（3）计数：
细胞浓度的计算：
Volume (体积) =長 x 寬 x 深度 = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm3 = 1 x 10-4 cm3 (ml)
细胞密度(个/mL) = 4个大方格的细胞总数/4 ÷10-4
=4个大方格的细胞总数/4 ×104
------培养室的消毒
• 培养室每天用0.2%的新洁尔灭或2%~5%的来苏儿 拖洗地面一次（拖布专用），30瓦紫外灯管照射消 毒30~50分钟。
-------超净工作台的消毒
2、无菌培养操作注意事项：
• （为保证无菌，除实验所需物品需预先消毒外， 实验中还需保持无菌操作）。
-----工作台面上的用品要布局合理，原则上是右 手使用的东西置右侧，左手使用的东西置左侧， 酒精灯置中央；
12
4.5
1～3
1×106
24孔板
24
2
0.5～2
5×105
48孔板
48
1
0.25～1
—
96孔板
96
1
0.05～0.1
—
Animal Cell Biotechnology —— College of Veterinary Medicine——MA Bao-hua
动物细胞工程的实验室基础
培养器皿特性
一、原代培养的方法
• (一)、消化培养法 • (二) 、组织块培养法 • （三）、其它（如机械方法）
(一)、消化培养法
1、培养前的准备
------培养用品的消毒
• 根据所要进行的具体培养对象如组织块贴壁原代培 养、末梢血白细胞培养、传代培养等，准备培养所 需器械和物品，清点无误后进行清洗、包装和消毒 灭菌。
-----实验前点燃酒精灯，一切操作如安装吸管帽、 打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧 灼进行。
3、常用消化试剂：
胰蛋白酶、胶原酶、蛋白水解酶、EDTA
4、原代细胞培养程序
• 1、取材 • 2、漂洗 • 3、剪切 • 4、消化 • 5、过滤 • 6、清洗 • 7、计数 • 8、接种
（1）、培养细胞的取材
培养器皿
培养物备份
每孔面积 /cm2
每孔推荐 液体量/ml
预计的HeLa细胞产量
动物细胞工程的实验室基础
培养器皿
培养器皿特性
培养物备份
每孔面积 /cm2
每孔推荐 液体量/ml
预计的HeLa细胞产量
多孔板
微量滴定板
96
0.32
0.1
l×105
微量滴定板
144
表表033.--333 培培2养养器器皿皿特特性性
0.1
1×105
4孔板
4
2
2
5×105ຫໍສະໝຸດ 6孔板69.6
2～4
2×106
12孔板
（E）重新加入消化液37℃消化10min。勿动，静置， 然后去一半上清。加等体积Ham’s F12:DMEM 1:1(FD) 培养液（内含10 ％胎牛血清、1 mM丙酮酸钠和2 mM 谷氨酰胺）终止消化，吹打细胞悬液。
（F）再加入终浓度为15 IU/ml的DNA酶Ⅰ37℃消化10 min。吹打细胞呈悬浮状，经80目和150目细胞筛过滤， 1,000×rpm离心10 min收集细胞。
切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科 手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块， 再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟， 使组织块自然沉淀到管底，弃去上清
消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍 量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔 几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细 胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧 化碳培养箱中培养
• 1. 取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡
于培养液内放置于冰浴或40C冰箱。若组织块很大，应先将其切成 1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24小时，因放置时间长 或组织块太大都易造成细胞的死亡；
• 2. 取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液
的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学 试剂及有害药物如碘、汞等。从消化道及周围有坏死组织等有污染因 素存在的区域取材时，为减少污染，可用含500~1000单位/ml的青、 链霉素BSS液漂洗5~10分钟，或用10% 达克宁注射液冲洗浸泡10分钟 再作培养；
（H）收集淡黄色的细胞滋养层细胞，清洗一次，接种 于涂有I型胶原的24孔培养板中，于37℃，95 ％空气和 5 ％CO2条件下培养。
（I）所得细胞经免疫荧光染色cytokeratin 7阳性， vimentin 阴性。本方法所获得细胞滋养层细胞纯度约 为95%左右。
• 3. 取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏 死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少
量培养液中；
原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有 75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入 超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取 出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠 胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
细胞培养基本技术
第一节 细胞原代培养
• 原代培养也叫初代培养，是从供体取得 组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养组织或细胞的特点：
• 1．组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生 很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反 映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实 验的很好对象；
• 2. 缺点是成分组成比较复杂，因而原代培养细 胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格 的对比性实验研究，还需对细胞进行短期传代 后进行。
（2）例如：滋养层细胞分离与培养：
（A）真空负压抽吸的早期绒毛组织在无菌条件下置于 冰浴PBS（含1 mM葡萄糖）中取回。
（B）在无菌条件下立即用无Ca2+和Mg2+的PBS漂洗 15-20次以除去血块。
（C）用解剖刀片从基膜上轻轻刮下绒毛，用剪刀剪碎 至1-2毫米左右。
（D）加入5 ％胰蛋白酶330μl(1：25)至10ml细胞悬液中， 4℃消化45min。勿动，静置，然后去上清。
（3）计数：
细胞浓度的计算：
Volume (体积) =長 x 寬 x 深度 = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm3 = 1 x 10-4 cm3 (ml)
细胞密度(个/mL) = 4个大方格的细胞总数/4 ÷10-4
=4个大方格的细胞总数/4 ×104
------培养室的消毒
• 培养室每天用0.2%的新洁尔灭或2%~5%的来苏儿 拖洗地面一次（拖布专用），30瓦紫外灯管照射消 毒30~50分钟。
-------超净工作台的消毒
2、无菌培养操作注意事项：
• （为保证无菌，除实验所需物品需预先消毒外， 实验中还需保持无菌操作）。
-----工作台面上的用品要布局合理，原则上是右 手使用的东西置右侧，左手使用的东西置左侧， 酒精灯置中央；
12
4.5
1～3
1×106
24孔板
24
2
0.5～2
5×105
48孔板
48
1
0.25～1
—
96孔板
96
1
0.05～0.1
—
Animal Cell Biotechnology —— College of Veterinary Medicine——MA Bao-hua
动物细胞工程的实验室基础
培养器皿特性
一、原代培养的方法
• (一)、消化培养法 • (二) 、组织块培养法 • （三）、其它（如机械方法）
(一)、消化培养法
1、培养前的准备
------培养用品的消毒
• 根据所要进行的具体培养对象如组织块贴壁原代培 养、末梢血白细胞培养、传代培养等，准备培养所 需器械和物品，清点无误后进行清洗、包装和消毒 灭菌。
-----实验前点燃酒精灯，一切操作如安装吸管帽、 打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧 灼进行。
3、常用消化试剂：
胰蛋白酶、胶原酶、蛋白水解酶、EDTA
4、原代细胞培养程序
• 1、取材 • 2、漂洗 • 3、剪切 • 4、消化 • 5、过滤 • 6、清洗 • 7、计数 • 8、接种
（1）、培养细胞的取材
培养器皿
培养物备份
每孔面积 /cm2
每孔推荐 液体量/ml
预计的HeLa细胞产量
动物细胞工程的实验室基础
培养器皿
培养器皿特性
培养物备份
每孔面积 /cm2
每孔推荐 液体量/ml
预计的HeLa细胞产量
多孔板
微量滴定板
96
0.32
0.1
l×105
微量滴定板
144
表表033.--333 培培2养养器器皿皿特特性性
0.1
1×105
4孔板
4
2
2
5×105ຫໍສະໝຸດ 6孔板69.6
2～4
2×106
12孔板
（E）重新加入消化液37℃消化10min。勿动，静置， 然后去一半上清。加等体积Ham’s F12:DMEM 1:1(FD) 培养液（内含10 ％胎牛血清、1 mM丙酮酸钠和2 mM 谷氨酰胺）终止消化，吹打细胞悬液。
（F）再加入终浓度为15 IU/ml的DNA酶Ⅰ37℃消化10 min。吹打细胞呈悬浮状，经80目和150目细胞筛过滤， 1,000×rpm离心10 min收集细胞。
切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科 手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块， 再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟， 使组织块自然沉淀到管底，弃去上清
消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍 量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔 几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细 胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧 化碳培养箱中培养
• 1. 取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡
于培养液内放置于冰浴或40C冰箱。若组织块很大，应先将其切成 1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24小时，因放置时间长 或组织块太大都易造成细胞的死亡；
• 2. 取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液
的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学 试剂及有害药物如碘、汞等。从消化道及周围有坏死组织等有污染因 素存在的区域取材时，为减少污染，可用含500~1000单位/ml的青、 链霉素BSS液漂洗5~10分钟，或用10% 达克宁注射液冲洗浸泡10分钟 再作培养；