标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明)
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取核酸（DNA 或 RNA）的基本原理和方法。
2、学习使用各种试剂和仪器进行核酸提取的操作步骤。
3、了解核酸鉴定的常用方法及其原理。
4、培养实验操作技能和科学研究的严谨态度。
二、实验原理核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是生物体遗传信息的携带者。
核酸提取的基本原理是利用细胞裂解液将细胞破碎，使核酸释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法将核酸与其他细胞成分分离，最后得到纯度较高的核酸样品。
DNA 提取常用的方法有酚氯仿抽提法、盐析法等。
酚氯仿抽提法是利用酚和氯仿的混合液去除蛋白质，然后通过乙醇沉淀得到 DNA。
盐析法是利用高浓度的盐使蛋白质变性沉淀，从而分离出 DNA。
RNA 提取常用的方法有异硫氰酸胍法、Trizol 法等。
Trizol 法是基于异硫氰酸胍和酚的作用，能够有效地裂解细胞并抑制 RNA 酶的活性，从而提取出完整的 RNA。
核酸鉴定的方法主要有紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法等。
紫外分光光度法通过测定核酸在 260nm 和 280nm 处的吸光度值（A260 和 A280）来评估核酸的纯度和浓度。
A260/A280 的比值在 18 20 之间表示 DNA 纯度较高，在 19 21 之间表示 RNA 纯度较高。
琼脂糖凝胶电泳法则是根据核酸分子在电场中的迁移率不同来分离和鉴定核酸，DNA 分子在琼脂糖凝胶中迁移距离与分子量大小成反比，RNA 通常会呈现出 28S、18S 和 5S 三条带。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）或培养的细胞。
大肠杆菌菌液。
2、实验试剂细胞裂解液（含蛋白酶 K）。
酚氯仿混合液（酚：氯仿＝ 1:1）。
无水乙醇、75%乙醇。
3M 醋酸钠（pH 52）。
Trizol 试剂。
异丙醇。
RNA 酶抑制剂。
琼脂糖。
50×TAE 电泳缓冲液。
核酸染料（如 EB 或 GelRed）。
实验十三 动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间 的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶 核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物 质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在 40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
DNA标准曲线的制作和样品测定
管 试 剂 0 对照 DNA标准溶液,ml 0.0 蒸馏水，ml 二苯胺试剂,ml OD595 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 4 1.6 0.4 4.0 5 2.0 0 4.0 号 样品1 2.0 0 4.0 样品2 2.0 0 4.0
动物组织核酸的分离纯化及鉴定
1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验
3. 核酸的定量和纯度测定
核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内， 是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式—— 核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储 存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可 缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等 现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类——核糖核 酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖 或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核 苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖， 一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷 酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴 定。
DNA和RNA的结构
组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。
核酸纯度检测实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握核酸纯度检测的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法在核酸纯度检测中的应用。
3. 了解核酸纯度检测的重要性及其在分子生物学研究中的应用。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，其纯度直接影响到后续实验结果的准确性。
核酸纯度检测主要依据核酸、蛋白质和杂质的紫外吸收特性。
在紫外光谱范围内，核酸的最大吸收峰通常位于260nm，蛋白质的最大吸收峰位于280nm。
通过测定核酸样品在260nm和280nm处的光密度值（OD值），可以计算出核酸的浓度和纯度。
三、实验材料1. 试剂：核酸提取试剂盒、超纯水、无RNA酶DNase、RNase、10×TE缓冲液、酚/氯仿/异戊醇溶液、无水乙醇、75%乙醇、SDS、NaCl等。
2. 仪器：紫外分光光度计、高速离心机、微量移液器、Eppendorf管等。
四、实验方法1. 核酸提取：按照核酸提取试剂盒说明书进行操作，提取DNA或RNA。
2. 核酸纯度检测：（1）核酸样品的制备：取适量提取的核酸，用无RNA酶DNase或RNase处理，去除杂质。
（2）核酸浓度测定：取适量处理后的核酸样品，用超纯水稀释至合适浓度。
将稀释后的核酸样品在260nm和280nm处测定光密度值。
（3）核酸纯度计算：根据核酸浓度和光密度值，计算核酸纯度。
公式如下：纯度（%）=（OD260/OD280）× 100%五、实验结果与分析1. 核酸浓度测定结果：实验结果显示，所提取的核酸样品在260nm处的OD值为0.6，在280nm处的OD值为0.4。
2. 核酸纯度计算结果：根据公式计算，核酸纯度为（0.6/0.4）× 100% = 150%。
3. 结果分析：实验结果显示，所提取的核酸样品纯度较高，符合实验要求。
这表明实验过程中操作规范，核酸提取效果较好。
六、实验结论1. 本实验采用紫外分光光度法对核酸纯度进行了检测，结果表明该方法操作简便、快速，适用于实验室常规核酸纯度检测。
核酸扩增法检测试剂注册技术审查指导原则(1)教学文稿
附件3核酸扩增法检测试剂注册技术审查指导原则一、前言本指导原则主要针对核酸扩增类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。
本指导原则系对核酸扩增法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。
应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。
二、适用范围本指导原则适用于核酸扩增法检测试剂的注册技术审查，其他类核酸检测试剂可参照相关内容。
三、基本要求（一）基本原则1.核酸扩增类检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。
研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。
2．试剂生产企业应具有与其技术要求相适应的人员、厂房、设施和仪器设备以及适宜的生产环境，配备满足核酸提取和扩增检测以及操作人员防护所需的设备。
建立专用实验室，实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以最大限度地防止实验过程中样品之间的污染和避免扩增产物的污染。
生产用于病原微生物核酸检测的生产企业应建立符合生物安全要求的设施和措施。
3.试剂生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求，建立相应的质量管理体系，并应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。
4.核酸扩增类检测试剂的引物设计应当符合核酸检测设计的要求，扩增体系应设定合理的内标和外标，试剂需设置抗污染的特定措施，扩增产物须进行确证研究。
5.企业使用新型原材料时，应提供与通行原材料比对研究结果及相关资料。
脱氧核糖核酸酶活力检测方法
脱氧核糖核酸酶活力检测方法编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会《二О一五年国家标准制修订项目》，项目编号“-T-424”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。
本标准起草工作组由中国标准化研究院、浙江工商大学、河北农业大学等单位共同组成。
二、标准制定的背景及意义核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶，其本质是蛋白质。
不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。
有些核酸酶只能作用于核糖核酸（RNA），称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于脱氧核糖核酸（DNA），称为脱氧核糖核酸酶（DNase），核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶统称为核酸酶（Nuclease）。
脱氧核糖核酸酶是将单链或双链DNA同等程度地随机分解，生成具有5'-P 末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。
脱氧核糖核酸酶具有重要的功能，目前主要用途包括制备不含DNA的RNA样品；RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染；体外T7, T3, SP6等RNA Polymerases催化的RNA 转录后去除DNA模板；DNase I Foot printing研究DNA-蛋白质相互作用；缺口平移（Nick translation）；产生DNA随机片段文库；细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照等。
脱氧核糖核酸酶I一般被认为是脱氧核糖核酸酶的典型代表，分子量约32 kDa。
由于脱氧核糖核酸酶具有重要的生理学作用，引起了国内外广泛的关注。
目前已经商业化生产和销售，但是作为脱氧核糖核酸酶的重要质量指标之一的酶的活力，根据文献调研显示相应的测定方法目前仍然没有形成统一的检测和分析标准，各生产和销售厂商对其活力的质量控制各自定义，同一种酶选用不同的活力测定方法结果显示大小差异显著。
这实际上已经成为脱氧核糖核酸酶产品可持续发展的瓶颈问题，给消费者造成了极大的不便。
核酸的性质
DNA的核苷酸序列测定
DNA的测序策略
DNA片断的序列测定
英国Sanger ， 1975年加减法，1977年末端 终止法，目前广泛用于DNA的自动测序 美国Maxam和Gilbert ， 1977年化学断裂法 基本原理：把DNA变成在不同碱基的核苷酸处 打断的四套末端标记的DNA片断，当相应于四 个不同碱基产生的四套DNA片断并排进行电泳 分离时，产生一个可以直接读出DNA顺序的区 带。
模板DNA的变性：双链DNA解离，使之成为单链，以便 它与引物结合 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性 成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的 互补序列配对结合（退火温度与Tm有关，温度太低非特 异扩增增加，温度过高引物和模板不易结合） 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半 保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板
真核生物mRNA的分离：亲和层析
真核生物的mRNA有polyA的尾巴，能被oligo-dT柱 子吸附而和其他物质分离开来
真核生物ｍＲＮＡ的分离
核酸纯度鉴定与含量测定
根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度 （若样品中含有杂蛋白或苯酚，则 A260/A280比值明显降低）
纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0
核酸的物理化学性质
核酸的水解 核酸的磷酸二酯键和糖苷键可 以被水解
室温条件下，DNA在碱中变性， 但不水解，RNA水解，水解产物为 2’-和3’-核苷酸的混合物。
核酸扩增法检测试剂注册技术审查指导原则
附件3核酸扩增法检测试剂注册技术审查指导原则一、前言本指导原则主要针对核酸扩增类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。
本指导原则系对核酸扩增法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。
应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。
二、适用范围本指导原则适用于核酸扩增法检测试剂的注册技术审查，其他类核酸检测试剂可参照相关内容。
三、基本要求（一）基本原则1.核酸扩增类检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。
研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。
2．试剂生产企业应具有与其技术要求相适应的人员、厂房、设施和仪器设备以及适宜的生产环境，配备满足核酸提取和扩增检测以及操作人员防护所需的设备。
建立专用实验室，实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以最大限度地防止实验过程中样品之间的污染和避免扩增产物的污染。
生产用于病原微生物核酸检测的生产企业应建立符合生物安全要求的设施和措施。
3.试剂生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求，建立相应的质量管理体系，并应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。
4.核酸扩增类检测试剂的引物设计应当符合核酸检测设计的要求，扩增体系应设定合理的内标和外标，试剂需设置抗污染的特定措施，扩增产物须进行确证研究。
5.企业使用新型原材料时，应提供与通行原材料比对研究结果及相关资料。
丙型肝炎病毒核糖核酸测定试剂注册技术审查指导原则
丙型肝炎病毒核糖核酸测定试剂注册技术审查指导原则一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)定量检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是对丙型肝炎病毒核糖核酸定量检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的容进行充实和细化。
如申请人认为有必要增加本指导原则未包含的研究容，可自行补充。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关容也将适时进行调整。
二、适用围丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。
(一)HCV特点HCV属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股正链RNA，易变异，目前可分为6个基因型及50多种不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如1a、2b、3c等)。
基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70％以上。
HCV基因组含有一个开放读框(open reading frame,ORF)，编码10余种结构和非结构(NS)蛋白，NS3蛋白是一种多功能蛋白，氨基端具有蛋白酶活性，羧基端具有螺旋酶/三磷酸核苷酶活性；NS5B蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，为HCV复制所必需，是抗病毒治疗的重要靶位，其末端具有核苷酸转移酶活性，但由于RNA酶缺乏矫正功能不能修正错配，多次复制后易导致HCV多种变异产生。
检测脱氧核糖核酸酶的DNA探针、试剂盒和方法[发明专利]
![检测脱氧核糖核酸酶的DNA探针、试剂盒和方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6884b429fe00bed5b9f3f90f76c66137ee064fc3.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610076852.8(22)申请日 2016.02.03C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/34(2006.01)C12N 15/11(2006.01)(71)申请人广州市锐博生物科技有限公司地址510663 广东省广州市科学城科学大道182号创新大厦C3-13(72)发明人张必良 刘霭珊 曹亮克雷格·梅洛(74)专利代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司 44224代理人万志香 胡杰(54)发明名称检测脱氧核糖核酸酶的DNA 探针、试剂盒和方法(57)摘要本发明提供一种检测脱氧核糖核酸酶活性的DNA 探针、试剂盒和方法，采用发夹状DNA 探针为脱氧核糖核酸酶的底物，探针的两端或内部分别标记上荧光基团及对应的荧光淬灭基团。
当探针结构完整时，荧光基团与淬灭基团位于同一个DNA 分子上，荧光基团被激发的荧光被淬灭基团吸收，荧光基团不发出荧光；而当探针被脱氧核糖核酸酶降解后，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团能正常发出荧光。
采用实时定量PCR 仪检测反应体系中发出的荧光强度，即可判断反应体系中是否存在脱氧核糖核酸酶。
本方法可广泛用于生物制品中脱氧核糖核酸酶残留的质量检测，或用于脱氧核糖核酸酶定量测定。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书11页序列表2页 附图5页CN 105648062 A 2016.06.08C N 105648062A1.一种DNA探针，其特征在于,其包含有一个茎环结构，且2个末端或内部分别连接有能量供体基团和能量受体基团，能量供体基团和能量受体基团之间能进行能量转移,所述DNA 探针的碱基长度为15-50个核苷酸，且包含一个能被DNase切割的位点，被降解后的探针的能量供体基团和能量受体基团在不同的探针片段上；所述茎环结构中，其茎结构包括分别位于探针两端的5～15bp的回文互补序列，其环结构包括长度为5～20nt的核苷酸序列，探针退火后形成茎环结构，两个回文互补部分Tm值大于35℃。
标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明)
标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法（编制说明）标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明)核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法编制说明(征求意见稿)一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会《二О一五年国家标准制修订项目》，项目编号“20154060-T-424”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。
本标准起草工作组由中国标准化研究院、浙江工商大学、河北农业大学等单位共同组成。
二、目的及意义核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶，其本质均是蛋白质。
但是不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。
有些核酸酶只能作用于底物RNA，通常称为核糖核酸酶(RNase)，有些核酸酶只能作用于底物DNA，称为脱氧核糖核酸酶(DNase)，核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶统称为核酸酶(Nuclease)。
核糖核酸酶是一类广泛存在于动植物体内的核酸水解酶，从20世纪60年代以来一直作为一种模型蛋白被普遍用于分子生物学研究。
RNase家族包括RNase A、RNase B、RNase C、RNase H、S-RNase、RNase P、RNase T等，主要生理功能是控制细胞内RNA的种类与数量分布，除参与核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解等过程外，还与某些植物的自交不亲和性、器官发生、宿主的防御机制、控制肿瘤血管生成、杀灭肿瘤细胞及抑制病毒复制等有关。
其中核糖核酸酶A一般被认为是核糖核酸酶的典型代表，分子量约为13.64 kDa，通过X射线衍射和质谱分析结果表明，它的空间结构呈肾形分布，见图1。
脱氧核糖核酸酶是将单链或双链DNA同等程度地随机分解，生成具有5'-P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。
脱氧核糖核酸酶的主要用途包括制备不含DNA的RNA样品;RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染;体外T7, T3,,1/15,标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明) SP6等RNA Polymerases催化的RNA转录后去除DNA模板;DNase I Foot printing 研究DNA-蛋白质相互作用;缺口平移(Nick translation);产生DNA随机片段文库;细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照等。
丙型肝炎病毒核糖核酸测定试剂注册技术审查指导原则
丙型肝炎病毒核糖核酸测定试剂注册技术审查指导原则一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)定量检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是对丙型肝炎病毒核糖核酸定量检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的容进行充实和细化。
如申请人认为有必要增加本指导原则未包含的研究容，可自行补充。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关容也将适时进行调整。
二、适用围丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。
(一)HCV特点HCV属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股正链RNA，易变异，目前可分为6个基因型及50多种不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如1a、2b、3c等)。
基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70％以上。
HCV基因组含有一个开放读框(open reading frame,ORF)，编码10余种结构和非结构(NS)蛋白，NS3蛋白是一种多功能蛋白，氨基端具有蛋白酶活性，羧基端具有螺旋酶/三磷酸核苷酶活性；NS5B蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，为HCV复制所必需，是抗病毒治疗的重要靶位，其末端具有核苷酸转移酶活性，但由于RNA酶缺乏矫正功能不能修正错配，多次复制后易导致HCV多种变异产生。
某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(1331)
某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（75分，每题5分）1. 糖的变旋现象是由于糖在溶液中起了化学作用。
（）答案：错误解析：糖的变旋现象不是由于糖在溶液中起了化学作用，而是由于其分子结构在溶液中起了变化，从α型变成β型或相反地从β型变成α型。
2. 在强酸或强碱条件下，蛋白质的构型会发生改变而失去生物活性。
（）答案：错误解析：在强酸或强碱条件下，蛋白质会变性，如果不涉及共价键的断裂，构型就不会发生改变，因为构型改变需要断裂共价键。
3. 一般来说酶是具有催化作用的蛋白质，相应的蛋白质都是酶。
（）答案：错误解析：酶是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。
一般来说，酶是具有催化作用的蛋白质，但是相应的蛋白质不一定都是酶，要根据不同情况下蛋白质的作用进行区分。
4. DNA核蛋白及RNA核蛋白可用0.14molL NaCl溶液抽提出来。
（）答案：错误解析：DNA核蛋白及RNA核蛋白一般用1molL NaCl抽提。
5. Pro不能参与α螺旋，它使α螺旋转弯。
（）答案：正确解析：6. 除翻译外，DNA的复制、转录、反转录都按碱基互补原则进行。
（）答案：正确解析：7. 蛋白激酶使蛋白质磷酸化的部位都是丝氨酸残基。
（）答案：错误解析：底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基有两类：①Thr、Ser、Tyr、Asp、Glu……“PO”键连接；②Lys、Ar9、His……“PN”键连接。
主要是磷酸化Ser、Thr，个别为Tyr。
被磷酸化的氨基酸残基可以是一个、两个或多个。
8. 理论上己糖有8对对映体。
（）答案：正确解析：9. 脂肪的皂化价高表示含低相对分子质量的脂肪酸少。
（）[山东大学2017研]答案：错误解析：皂化值（价）是指皂化1g脂肪所需的KOH的毫克数。
脱氧核糖企业标准
脱氧核糖企业标准脱氧核糖（Deoxyribose）是DNA（脱氧核糖核酸）分子中的一种五碳糖，它作为DNA的组成部分，对于维持细胞的正常功能和遗传信息的传递起着重要的作用。
作为一家专注于脱氧核糖研究和生产的企业，制定和遵守脱氧核糖企业标准是我们的责任和使命。
一、脱氧核糖的生产标准1. 原材料选择：选择优质的生物原材料，确保脱氧核糖的纯度和质量。
2. 生产流程控制：严格控制生产过程中的温度、压力、PH值等参数，确保脱氧核糖的生产过程稳定可靠。
3. 检测与分析：建立完善的检测与分析体系，对脱氧核糖进行全面的质量检测与分析，确保产品符合标准要求。
二、脱氧核糖的质量标准1. 外观要求：脱氧核糖应呈白色结晶或结晶粉末状，无异物、杂质。
2. 纯度要求：脱氧核糖的纯度不低于99%，通过红外光谱、核磁共振等多种检测手段确保纯度准确。
3. 溶解度要求：脱氧核糖在水中的溶解度应符合标准要求，以确保其在生物体内的有效吸收与利用。
4. 含量要求：脱氧核糖的含量应符合标准要求，以确保产品的稳定性与功效。
三、脱氧核糖产品的包装与储存标准1. 包装要求：采用符合食品级标准的密封包装材料，以确保产品的保存期限和防潮、防氧化等性能。
2. 储存条件：脱氧核糖产品应储存在干燥、阴凉、避光的环境中，远离火源和易燃物品。
四、脱氧核糖的应用标准1. 医药领域：脱氧核糖作为一种重要的生物活性物质，广泛应用于药物研发与生产过程中，应符合相关药典标准。
2. 食品领域：脱氧核糖作为食品添加剂，应符合食品安全法规和相关标准要求。
3. 科研领域：脱氧核糖在科研领域的应用，应符合实验室安全和伦理要求。
脱氧核糖企业标准的制定与遵守，不仅是为了确保产品质量和安全，更是为了维护企业的声誉和信誉。
我们将始终坚持以顾客需求为导向，严格按照标准要求生产和管理，为客户提供高质量的脱氧核糖产品和服务。
通过制定和执行脱氧核糖企业标准，我们追求卓越，不断提升自身的技术水平和生产能力，为推动脱氧核糖研究和应用做出贡献。
NGS检测试剂质量评价通用技术指导原则
第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则中国食品药品检定研究院2016年8月8日一．前言本指导原则主要针对第二代测序（next generation sequencing，NGS）技术检测试剂（以下简称“NGS检测试剂”）产品质量提出指导性要求，涉及基本原则、主要原材料、检测流程及性能评价等方面。
本指导原则是对企业和检验人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。
应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。
二．适用范围本指导原则适用于基于NGS技术的检测试剂的质量评价。
NGS检测试剂的预期用途包括但不限于以下内容：肿瘤相关基因异常、遗传疾病相关基因异常、胚胎植入前染色体非整倍体、胎儿染色体非整倍体及病原微生物等临床检测应用。
此类检测试剂涉及的NGS技术包括靶向性测序和非靶向性测序：靶向性测序法是指对样本中的基因组进行部分测序，如靶基因测序、外显子（组）测序等；非靶向性测序是指对样本中潜在生物体的基因组进行测序。
原则上不建议企业应用全基因组测序进行检测，如果企业应用全基因组测序技术，应进行充分的技术适用性验证并提交报告。
待测样本可以是人源样本（如体液、组织、排泄物等）或病原微生物分离培养物（如血培养物、痰培养物等），检测对象可以是脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或两者的混合物。
本指导原则尽可能覆盖所有的NGS技术原理和测序平台，所讨论和描述的内容不限于某个特定的NGS检测试剂。
但鉴于NGS技术一直在不断升级和更新，可能会有本指导原则未能涉及的新技术。
三．基本要求（一）基本原则1.NGS检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。
研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。
屎肠球菌荚膜多糖的提取纯化及其多糖含量的测定
屎肠球菌荚膜多糖的提取纯化及其多糖含量的测定刘永安;李学瑞;周建华;马丽娜;刘永生【摘要】为提取纯化屎肠球菌(E.faecium)荚膜多糖(CPS)并测定其多糖含量,试验采用高压法破碎菌体,加入核糖核酸酶(25μg/mL)、脱氧核糖核酸酶(0.5 mg/mL)、溶菌酶(0.25 mg/mL)及蛋白酶K(1.25 mg/mL)等去除核酸和蛋白质,得到荚膜多糖粗提物,经过30 ku和100 ku超滤离心管超滤浓缩和DEAE Sepharose Fast Flow 层析柱层析后,得到纯化的屎肠球菌荚膜多糖,再利用苯酚-硫酸法测定其含量.结果表明,成功从屎肠球菌中提取纯化出荚膜多糖,其含量为75.21％,初步确定了屎肠球菌荚膜多糖的提取纯化方法,为今后相关疫苗的研制奠定了基础.%In order to extract and purify the capsular polysaccharide of Enterococcus faeciumand measure contents of polysaccharide,high pressure crushing methods and enzyme decomposition methods (RNase A (25 μg/mL),DNase (0.5mg/mL),lysozyme (0.25 mg/mL)and protease K (1.25 mg/mL))were used to remove the nucleic acids and proteins to obtain crude capsular poly-saccharide,and centrifugal ultrafiltration with 30 and 100 ku ultrafiltration centrifuge tubes and DEAE Sepharose Fast Flow column chromatography were also adopted to obtain the purified cap-sular polysaccharides of Enterococcus faecium .Then the content of polysaccharide was determined by the phenol-sulfuric acid method.The results showed the capsular polysaccharide content was 75.21％.The results revealed that capsular polysaccharide of Enterococcus faecium was extrac-ted successfully.The method of extracting capsular polysaccharide in Enterococcus faecium was established initially.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)005【总页数】6页(P1309-1314)【关键词】屎肠球菌;荚膜多糖;提取纯化;苯酚-硫酸法【作者】刘永安;李学瑞;周建华;马丽娜;刘永生【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点试验室,农业部草食动物疫病重点开放试验室,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点试验室,农业部草食动物疫病重点开放试验室,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点试验室,农业部草食动物疫病重点开放试验室,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点试验室,农业部草食动物疫病重点开放试验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点试验室,农业部草食动物疫病重点开放试验室,兰州 730046【正文语种】中文【中图分类】S852.61荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是屎肠球菌(Enterococcus faecium, E. faecium)重要的毒力因子之一，且是重要的保护性抗原，具有较好的免疫原性，常被用作疫苗的靶抗原及其他免疫抗原[1-3]。
核酸纯度检测
最近重新研读了分子克隆第三版，有一个有趣的小发现，好像过去没听人说过。
一般测核酸浓度都是用260nm的光吸收值来决定，同时用260/280的比值来判断有无蛋白质污染。
理想的比值是1.8~2.0左右。
分子克隆第三版专门提到这种判断核酸纯度的办法是不可靠的。
原因在于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多，即使有相当多的蛋白质污染，这个比值还是接近于理想的比值。
另外，260/280比值尤其不能用于评判寡聚核甘酸的纯度，因为嘌呤的消光系数比嘧啶大好多，寡聚核甘酸嘌呤嘧啶组成很可能不平均，所以很可能出现很纯的样品260/280比值却比较小的情况。
你所说的‘消光系数‘，是否就是吸光值的意思？如果你用连续波长测过核酸的吸光度时，就会发现，OD260,恰好是核酸吸光值最大的时候，从200-750,是一条曲线，260时是波峰，而280时，刚好是曲线下降到一半左右时的吸光值。
而恰好280又是蛋白质的最佳吸收值。
如果纯的核酸，那曲线就是标准的，260/280就是1.8-2.0之间，如果混有蛋白质，多肽，酚之类的杂质，那280时的吸收峰就变高了，曲线随之发生变形，而260时的吸收峰不变。
就如你所说的“原因在于蛋白质在260nm的消光系数比核酸小很多”，因此260的吸收峰几乎不变。
但280时却不一样。
这时相反，核酸的消化系数比蛋白质小的多，因此，一旦有污染，280上升很快。
因此260/280在有污染的情况下就会变小。
所以，用260/280的方法，还是比较可靠的。
当然更可靠的，就是用200-750的波长，连续扫描。
直接观察核酸的整条曲线，那比光靠260,280两个吸收值，肯定要准确很多。
其实平时在我们检测时，我们也会检测230,320,两个值。
至于这两值的作用，我稍后再说。
其实有230,260,280,320,这四个点。
基本上也能确定下这条曲线的该一段的形状了。
A 260 / A 280 的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。
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标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法（编制说明）标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明)核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法编制说明(征求意见稿)一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会《二О一五年国家标准制修订项目》，项目编号“20154060-T-424”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。
本标准起草工作组由中国标准化研究院、浙江工商大学、河北农业大学等单位共同组成。
二、目的及意义核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶，其本质均是蛋白质。
但是不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。
有些核酸酶只能作用于底物RNA，通常称为核糖核酸酶(RNase)，有些核酸酶只能作用于底物DNA，称为脱氧核糖核酸酶(DNase)，核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶统称为核酸酶(Nuclease)。
核糖核酸酶是一类广泛存在于动植物体内的核酸水解酶，从20世纪60年代以来一直作为一种模型蛋白被普遍用于分子生物学研究。
RNase家族包括RNase A、RNase B、RNase C、RNase H、S-RNase、RNase P、RNase T等，主要生理功能是控制细胞内RNA的种类与数量分布，除参与核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解等过程外，还与某些植物的自交不亲和性、器官发生、宿主的防御机制、控制肿瘤血管生成、杀灭肿瘤细胞及抑制病毒复制等有关。
其中核糖核酸酶A一般被认为是核糖核酸酶的典型代表，分子量约为13.64 kDa，通过X射线衍射和质谱分析结果表明，它的空间结构呈肾形分布，见图1。
脱氧核糖核酸酶是将单链或双链DNA同等程度地随机分解，生成具有5'-P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。
脱氧核糖核酸酶的主要用途包括制备不含DNA的RNA样品;RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染;体外T7, T3,,1/15,标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明) SP6等RNA Polymerases催化的RNA转录后去除DNA模板;DNase I Foot printing 研究DNA-蛋白质相互作用;缺口平移(Nick translation);产生DNA随机片段文库;细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照等。
脱氧核糖核酸酶I一般被认为是脱氧核糖核酸酶的典型代表，分子量约32 kDa。
由于核酸酶(核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶)具有重要的生理学作用，引起了广泛的关注。
目前已经商业化生产和销售，但是作为核酸酶的重要质量指标之一的酶的纯度，根据文献调研显示相应的测定方法目前仍然没有形成统一的检测和分析标准，各生产和销售厂商对其纯度的质量控制各自定义，甚至有些厂商仅是标明了核酸酶的蛋白含量，混淆了核酸酶的纯度概念。
这实际上已经成为核酸酶产品可持续发展的瓶颈问题，给消费者造成了极大的不便。
鉴于此，开展核酸酶纯度检测方法标准的制定，具有重要的现实意义，可有助于规范市场上此类产品的乱象，切实保障消费者的使用。
经济全球化浪潮使标准竞争上升到了战略地位，特别是进入21世纪以后，发达国家纷纷制定各自的标准化发展战略，以应对因经济全球化对自身带来的影响。
此外，此类标准的制定也同样满足《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》中明确把实施技术标准战略作为我国科技发展的两大战略之一的目标，有助于保障国家科学发展。
图1 牛胰腺核糖核酸酶A空间结构三、标准制定原则及主要内容(一)标准编制原则,2/15,标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明)标准的制定过程中采用文献调查法、专家座谈法、凝胶电泳方法等多种研究方法，方法科学先进、过程周密严谨、数据真实可信、结果明确。
本标准是为相关组织核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测提供技术支撑，考虑到生产、监管等不同需求，在方法选择上，主要基于现状、现有成熟的技术以及结果及验证基础确定的，因此实用性较强。
(二)标准制订主要依据1、标准编写遵循GB1.1-2009《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》的有关要求。
2、标准编写内容参考了与核酸酶纯度检测相关文献，标准参照了GB/T 6379.1-2004《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)》第1部分总则与定义和GB/T 6379.2-2004《测量方法与结果的准确度》第2部分确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法。
(三)本标准的主要内容本标准主要包括以下7个部分:(1) 范围;(2) 术语和定义;(3) 原理;(4) 仪器设备及器具;(5) 主要试剂;(6) 分析步骤;(7) 结果分析等。
四、主要工作过程(一)组成标准起草小组根据国家制修订有关程序和要求，2015年10月下旬，中国标准化研究院主持召开了《核酸酶纯度检测》国家标准制定研讨会。
会上，组成了标准起草工作组，明确了任务要求，安排了工作进度，成立了标准起草工作小组，会议研究讨论了《核酸酶纯度检测》初稿，对起草小组在标准起草过程中的一些思考及难点,3/15,标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明) 问题进行了深刻讨论，各单位代表就标准内容及方法选择进行了讨论。
(二)开展相关调研情况核酸酶纯度检测标准属于生物产业领域的标准，是支撑生产方、第三方组织开展产品评价的技术依据。
起草工作小组首先针对生产和检测开展了大量的调研工作。
从满足实际检测需要出发，开展了国内外相关资料的收集和确认工作，资料的检索和信息的收集过程中，分析比较了大量的国内外文献方法，在符合标准化工作规划和标准化计划要求的基础上，初步形成了检测方法的制定思路。
(三)标准起草完善过程在广泛调查研究的基础上，标准起草单位组织相关技术人员对核酸酶纯度检测标准项目进行了预研，课题组成员广泛收集了国内外核酸酶纯度检测的标准、文献，了解了国内外相关技术动态，并且明确了工作思路和进程安排，分析了通过前期的实验摸索、反复论证，确定了本标准方法设定的重要参数，其中包括配胶浓度、电泳电压、电泳时间等指标参数，开展了实际样品的检测。
然后依据GB/T 1.1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》、GB/T 1.2—2002《标准化工作导则第2部分:标准中规范性技术要素内容的确定方法》等标准编制要求，对《核酸酶纯度检测》标准开展了起草工作。
于2016年3月中旬，起草工作小组完成了《核酸酶纯度检测》国家标准(草案)。
2016年6月，在北京组织有关单位和专家分别召开了标准草案讨论会，重点对核酸酶纯度检测方法和流程提出了完善建议。
同时对方法进行了验证，针对验证所出现的问题，在2016年11月11组织专家对标准逐字逐句进行了讨论完善，形成了《核酸酶纯度检测》国家标准征求意见稿。
五、国内外研究概况电泳(SDS-PAGE)和高效液相色谱(HPLC)是目前国内外最为常见的蛋白纯度检测技术。
SDS-PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠)，SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，进而区分酶等蛋白质的纯度。
,4/15,标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明) 核酸酶(核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶)作为一类蛋白质，剖析国内外的检测方法，以SDS-PAGE为主要手段。
此外，目前电泳装置已经是各实验室均已经普及的检测仪器，作为在残留限量水平的分析技术，已成为生物制品中蛋白样本纯度检测的主流技术。
同时“十二五”期间国内相关检测机构、科研院所、高等院校、大中企业等实验室的仪器设备配套也已比较完整，这些都为标准的推广打下了坚实的基础。
HPLC是目前国内外最为常见的蛋白纯度检测技术，其原理是根据蛋白质保留时间的差异分离蛋白质，通过峰面积积分测定蛋白质的纯度。
利用样品中各组分在色谱柱内借助于固定相及流动相的某种物理、化学作用在固定相与流动相之间分配行为的不同来进行分离的，其分离机制有吸附、分配、离子交换、分子排阻、疏水作用、亲和力等，而色谱柱是色谱分离系统的核心部分，装有不同类型填料的色谱柱与相对应的流动相形成不同分离机制，对绝大多数的有机化合物进行分离分析。
但该技术通常针对分子量量较大的蛋白、糖蛋白等，而且用反相柱可能在柱上沉淀、或出现严重脱尾峰，且分辨率不如SDS-PAGE。
核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的分子量分别为13.7 KDa和32 KDa，属于小分子蛋白，采用HPLC很难得出理想的检测结果，故目前多数知名的核酸酶公司如Takara宝生物工程大连有限公司、Solarbio索莱宝生物科技有限公司及Sigma公司都采用电泳(SDS-PAGE)这个传统但分辨率很高的检测方法对其产品的纯度进行检测。
该检测方法检测成本低，结果准确，重复率高，但是目前市场上缺乏统一的检测标准，故对该方法进行了标准化的规定。
实际上这也是规范核酸酶类生物产品的实际需要，有助于相关产品的纯度统一。
六、关键试验内容和技术指标说明6.1分析方法及其条件的选择与优化6.1.1 分析方法的选择从本质上讲，酶也是一种蛋白质，根据文献报道和现有方法调研，SDS-PAGE的方法适用于核酸酶(核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶)纯度检测，同时这也是目前最为普遍采用的通用方法，具有显著的方法优势。
鉴于此，本标准的核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度的方法制定采用SDS-PAGE。
,5/15,标准_核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法(编制说明)6.1.2 蛋白含量测定蛋白含量的测定目前较为通用的包括Bradford分光光度法和Lowry法，结合前期文献调研以及实验室操作实践，Bradford分光光度法比较Lowry法简单迅速，是目前测定蛋白质含量的首选方法。
此方法利用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的特性以及在一定范围内与蛋白质含量呈现线性关系的特征检测蛋白含量。
鉴于此，本标准蛋白含量测定采用Bradford分光光度法。
6.1.3 SDS-PAGE6.1.3.1稀释倍数的选择本次实验将样品按5mg/ml溶解后再进行2倍稀释、4倍稀释、8倍稀释、16倍、32倍稀释。
通过根据试验结果分析不同稀释梯度范围内电泳条带的清晰程度，选择最为合适的稀释倍数确定为国家标准方法中使用的倍数。
.2浓缩胶的选择 6.1.3核酸酶(核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶)的分子量大小分别介于为14-20kDa和28-33 kDa，介于10-50 kDa，根据实验选择12%凝胶分离蛋白，得到清晰且分离度高的条带。
6.2 检测方法的建立与分析6.2.1 蛋白含量检测考马斯亮蓝G-250与待测蛋白结合后，在波长595 nm处有较高的吸收值，且在一定范围内呈现线性关系，通过选取牛血清白蛋白并配置标准溶液，绘制标准曲线，结合曲线计算待测样品蛋白实际含量。