脂肪酶活力测定方法及其比较
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。
2. 所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司3. 标准曲线绘制：a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和(全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以 1 min 内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol 对硝基苯酸(p-NP) 所需的酶量为 1 个酶活单位(U)。
脂肪酶
显色剂，均匀搅拌3min，油酸分子与Cu2+
生成绿色的络合物，4000r/min离心10min
后取上层有机相在710nm处测定吸光度。
（三）、对硝基苯酚法
1、溶液配制准备
底物溶液配制:量取对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)0.0378g，加入Triton X-100 1mL，用50mmoL/L Tris-HCL缓冲液（pH值8.0）定容100mmL。
8
9
10
10
20
14
38
33
五、结果与讨论
测定速度： 滴定法 稳定性： 铜皂法 铜皂法 对硝基苯酚法 对硝基苯酚法 滴定法
灵敏度：
对硝基苯酚法
铜皂法
滴定法
实际应用中，可根据不同需要选择测定方法。
酶相互间无法进行正常的活力比较。本实验就酸
碱ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ定法、铜皂法、对硝基苯酚法三种常用方法 进行了比较。
二、实验材料
脂肪酶，生物工程研究室提供
榨汁机，分析天平，碱性滴定管， 分光光度计，pH计，离心机，恒温水浴锅
脂肪酶活力单位
脂肪酶活力单位定义：在一定条件下，
每分钟释放出1μmoL脂肪酸的酶的量定义为
一个脂肪酶活力单位（U）。
三、实验方法
（一）、滴定法
底物溶液（乳化液）配制:量取4%PVA溶液150mL, 加入橄榄油50mL，用榨汁机处理3min，现配现用。
脂肪酶溶液配制:配制pH值为7.38的0.5mg/mL脂
肪酶溶液。
(二)、铜皂法
1、脂肪酸吸光度标准曲线的绘制
配制一系列不同浓度的油酸溶液，分别 取4mL油酸溶液置于锥形瓶中，加入1mL
18.32
16.98
19.23
脂肪酶检测方法
脂肪酶检测方法
脂肪酶检测方法是一种用于测定脂肪酶水平的技术。
脂肪酶是人
体内的一种酶类物质，其主要功能是分解脂肪并促进人体对脂肪的吸
收利用。
在一些疾病或高脂饮食的情况下，脂肪酶水平可能会异常，
因此需要进行检测。
目前常用的脂肪酶检测方法有光度法、电泳法、色谱法等。
其中，光度法在临床诊断中应用最为广泛，其原理是在特定条件下，测定酶
催化反应产生的光学吸收变化。
电泳法则是利用电场将蛋白质分离，
并检测脂肪酶的移动距离以确定其浓度。
色谱法则是基于不同大小的
蛋白质分子在某种介质中的迁移速率不同的原理。
脂肪酶检测方法在临床上有着重要的作用。
它可以帮助医生了解
患者体内脂肪酶水平的变化，并给出相应的治疗建议。
此外，该检测
方法也可以用于营养学研究、食品加工等方面。
三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进_江慧芳
计算出酶活力。
11 31 3 改进后的脂肪酶活力测定方法
取一系列 p- N P 标准溶液稀释到 5 mL , 呈适当的
浓度梯度, 加入 5 mL 01 5 m ol # L- 1 的三氯乙酸混合,
再加入 51 15 mL 01 5 mol # L - 1N aO H 调 pH 值, 直至
pH 值与加酸前一致, 分别测定吸光度, 绘制吸光度-
5 OD 值 变 化 快, 效果不好
10 OD 值 仍 变 化, 较慢, 效果不好
笔者在此就碱滴定法[ 3, 4] 、对硝基苯酚法[ 5, 6] 和铜 皂法[ 7~ 9] 三种常用的脂肪酶活力测定方法进行了比较 实验, 以期寻找简单快捷、准确有效的活力测定方法。
1 实验
11 1 碱滴定法 11 11 1 药品、试剂及仪器
脂肪酶 ( No vezymes 公 司) , 2% 聚 乙烯 醇 ( 简 称 PV A , 聚合 度 1750) , 01 0667 mol # L - 1 的 K H 2 P O4N a2H P O4 缓冲溶液( pH 值为 51 91, 61 47, 61 98, 71 38, 81 04) , 01 05 mo l # L - 1 N aO H 标准溶液, 橄榄油, 95% 乙醇, 10 g # L - 1 酚酞指示剂。
液的用量, m L; t 为作用时间, min。
11 3 对硝基苯酚法
11 31 1 药品、试剂及仪器 脂肪酶( No vezymes 公司) , 对硝基苯酚( p- NP ) ,
对硝基苯酚棕榈酸酯( p- N PP ) , 50 m mol # L - 1 T ris-
H Cl 缓冲液( pH 值 81 0) , 异丙醇, 阿拉伯胶, T rit on X-
脂肪酶活力检测方法分析
▲制备乳化液
第一次制作乳化液选择高速捣碎机。
将４％ＰＶＡ溶液１００ ｍＬ和底物混合，可以在冰箱中静置５￣１０℃保持１￣２ ｈ，随后向捣碎机转移，这样操作９ ｍｉｎ ３次，乳化液可以保存在冰箱中，在之后的每一次使用时重新实施乳化。
第二可以选择乳化液初步选择超定的功率下严格实施超声乳化处理，在对底物乳化温度控制时可以考虑使用水浴，在冰箱中储存乳化液，再一次应用时需要重新实施乳化。
检测脂肪酶活力的方法
▲抽提正己烷方法
在甘氨酸缓冲液中放置１ ｍＬ橄榄油，添加规定数量的酶液在３７℃的情况。
脂肪酶_酶比色法_概述说明以及解释
脂肪酶酶比色法概述说明以及解释1. 引言1.1 概述脂肪酶是一类具有催化作用的酶，在生物体内起着关键的功能。
它们能够加速脂肪分子（甘油三酯和脂肪酸）的降解，从而促进脂肪代谢和能量释放。
随着对脂肪酶及其应用领域的研究不断深入，人们发现了许多检测和分析脂肪酶活性的方法，其中酶比色法是一种被广泛应用的方法。
1.2 文章结构本文将对脂肪酶和酶比色法进行详细描述和解释。
首先，在“引言”部分，我们将给出本文的背景和目标，并简要概述脂肪酶以及酶比色法的重要性。
接下来，将在“脂肪酶”部分介绍其定义、分类、生物学功能以及应用领域。
紧接着，在“酶比色法”部分将详细讲解该方法的定义、原理、应用和优势，同时还会列举实验流程和步骤。
然后，在“概述说明脂肪酶的工作机制”部分，将探讨脂肪酶的作用方式、反应条件和影响因素，并通过实例及实验结果解读进一步阐述。
最后，在“结论”部分，将对本文的主要观点和发现进行总结，并展望和建议未来关于脂肪酶研究的方向。
1.3 目的本文的主要目的是深入介绍脂肪酶和酶比色法，以提供关于脂肪酶工作机制及其检测方法方面的详尽信息。
通过对脂肪酶概念、分类、生物学功能以及应用领域进行说明，读者能够全面了解脂肪酶在生物体内的重要性。
此外，详细介绍酶比色法的定义、原理、应用、优势以及实验流程和步骤，有助于读者更好地理解该方法在测定脂肪酶活性方面的价值。
最后，通过概述脂肪酶的工作机制并解读相关实验结果，读者将深入了解脂肪酶催化过程中的关键步骤和条件。
希望本文能为研究人员提供有价值的信息，并对脂肪酶的研究和应用提供启示和指导。
2. 脂肪酶:2.1 定义和分类:脂肪酶，也称为脂肪水解酶，是一类能够催化脂肪分子水解反应的酶。
它们能够将复杂的脂肪分子分解成较小的脂肪酸和甘油。
根据其作用方式和底物特点，脂肪酶可以被分为三大类：lipase、esterase和phospholipase。
- lipase（脂肪解酶）：主要催化三酰甘油水解反应，将三酰甘油分解成甘油和游离脂肪酸。
脂肪酶的测定及临床意义
脂肪酶的测定及临床意义
[大] [中] [小]
脂肪酶的测定及临床意义
脂肪酶是一种水解长链脂肪酸甘油酯的酶，血清中的脂肪酶主要来自于胰腺，也有一些来自于其他组织，如胃，小肠黏膜，肺等处者；此外，在白细胞，脂肪细胞，乳汁中也可测到脂肪酶活性。
脂肪酶可由肾小球滤过，并被肾小管全部回吸收，所以尿中测不到脂肪酶活性。
参考值：BMD浊度法（30℃）：成人：30～109U/I．
＞60岁：18～180U/L．
滴定法：0～0.7U/ml 1．5U以上有意义。
血清脂肪酶活性测定可用于胰腺疾病诊断，特别是在急性胰腺炎时，发病后4～8h内血清脂肪酶活性升高，24h达峰值，一般持续8～14天。
脂肪酶活性升高多与淀粉酶并行，但可能开始升高地时间更早、持续时间更长、升高的程度更大。
有报告患急性胰腺炎时脂肪酶比淀粉酶更敏感和特异，因而认为脂肪酶活性升高更有诊断意义，最好是同时检测淀粉酶和脂肪酶。
因脂肪酶活性升高持续的时间较长，所以在疾病的后期测定可能更有意义。
此外血清脂肪酶升高也可见于急腹症、慢性肾病等，但患腮腺炎和巨淀粉酶血症时不升高，此点与淀粉酶不同，可用于鉴别。
测定脂肪酶可用橄榄油或三油酸甘油酯做底物，脂肪酶只作用在脂-水界面，因此，所用之底物必须呈乳胶状态，其反应速度将随乳状液之分散度（表面积）而增加。
由胰腺分泌的共酯酶连于胆酸盐表面，形成共酯酶-胆酸盐复合物，再附着于底物表面，这种形式的底物和脂肪酶有很高的亲和力。
虽然脂肪酶对急性胰腺炎诊断比较特异和灵敏，但以前由于方法学问题，未得到临床普遍应用。
现已有试剂盒供应，有利于临床推广应用。
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。
2.所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司3.标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L):称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b.标准曲线绘制：分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
脂肪酶活力测定方法及其比较
脂肪酶活力测定方法及其比较一、本文概述脂肪酶是一类能够催化脂肪酸酯水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，其在生物体内起着重要的代谢作用。
脂肪酶活力测定方法的研究对于了解脂肪酶的催化性质、生物合成、调控机制以及在工业、医药和农业等领域的应用具有重要意义。
本文旨在介绍常见的脂肪酶活力测定方法，包括滴定法、比色法、荧光法、高效液相色谱法等，并比较它们的优缺点，以期为读者提供一个全面、系统的脂肪酶活力测定方法参考。
通过本文的阐述，读者可以了解各种测定方法的基本原理、操作步骤、适用范围以及注意事项，从而根据自身研究需求选择最合适的测定方法。
本文还将探讨脂肪酶活力测定方法的未来发展趋势，以期为相关领域的研究提供有益的参考和启示。
二、脂肪酶活力测定的基本原理脂肪酶活力测定主要基于脂肪酶水解脂肪酸的特性，通过测量水解产物的生成速率来评估酶的活性。
脂肪酶是一种能够催化脂肪酸酯水解的酶，其催化反应可以表述为：脂肪酶 + 脂肪酸酯→脂肪酸 + 醇。
在测定脂肪酶活力时，通常使用特定的底物，如三乙酸甘油酯（p-nitrophenyl butyrate）或橄榄油等，这些底物在脂肪酶的作用下会水解生成相应的脂肪酸和醇。
在测定过程中，通常使用比色法、滴定法或高效液相色谱法等方法来检测水解产物的生成量。
例如，当使用p-nitrophenyl butyrate 作为底物时，水解产生的p-nitrophenol在碱性条件下会呈现黄色，其颜色深浅与浓度成正比，因此可以通过比色法来测定其浓度，从而推算出脂肪酶的活力。
不同的测定方法具有各自的优缺点，比如比色法操作简便，但可能受到颜色干扰和pH值变化的影响；滴定法则需要精确的化学计量和反应条件控制；高效液相色谱法则具有更高的灵敏度和准确性，但设备成本较高，操作相对复杂。
因此，在选择脂肪酶活力测定方法时，需要根据实验条件和目的来综合考虑各种因素。
脂肪酶活力测定的结果还受到多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、反应温度、pH值等。
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。
2.所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司3.标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L):称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b.标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是，，，，，，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和（全部都是）的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm下测定吸光值,以1 min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。
公式y=+中x是p-NP的浓度(单位：mmol/l)，y是吸光值，、是反应系数，R2是相关系数。
脂肪酶活力测定方法的改进
第26卷第6期通化师范学院学报Vol.26No.62005年11月JOURNAL OF TON GHUA TEACHERS ’COLL EGE Nov.2005脂肪酶活力测定方法的改进①纪建业(通化师范学院化学系,吉林通化134002)摘 要:改进了传统测定脂肪酶活力的方法,探讨了脂肪酶的活力测定的最适应条件.改进后的方法不需要制备乳化液,采用了分光光度法测定生成的脂肪酸,提高了灵敏度.关键词:脂肪酶;活性测定;温度;p H 值中图分类号:O623 文献标识码:A 文章编号:1008-7974(2005)06-0051-03酶是具有生物活性的物质,其催化性能与酶的质量多少无关,仅决定于其活性的大小.温度过高(一般超过50℃),酸碱度过大,极少量抑制剂的引入等都会使酶变性、失活、降低或失去其催化性能,这就给酶的活性测定带来了诸多的困难和难度.传统的脂肪酶的测定方法中,需要制备聚乙烯醇橄榄油乳化液,产生的脂肪酸用标准碱溶液滴定.本实验中没有制备橄榄油乳化液,采取将底物橄榄油直接加入到含有脂肪酶的缓冲溶液中,进行均匀磁力搅拌,产生脂肪酸用分光光度法检测.1 试剂与仪器磷酸二氢钾(分析纯,沈阳市试剂一厂);氢氧化钠(优级纯,北京化工厂);乙酸铜(分析纯,北京化工厂);吡啶(分析纯,天津市天大化工实验厂);苯(分析纯,天津市化学试剂一厂);油酸(化学纯,天津市化学试剂公司分装厂);橄榄油(化学纯,上海化学试剂公司分装厂);脂肪酶(粗品,北京微生物研究所);水(去离子水,东北师范大学化学系);盐酸(分析纯,长春市化学试剂厂);分光光度计(722型,上海第三分析仪器厂);酸度计(p HS -3B 型,上海雷磁仪器厂);磁力搅拌器(WC J -802型,江苏省泰县分析仪器厂);超级恒温槽(CS501型,重庆实验设备厂);离心沉淀器(800型,上海手术器戒十厂);分析天平(TG 328B 型,上海天平仪器厂).2 实验方法2.1 脂肪酶溶液的配制用分析天平称取一定量的酶粉于研钵中,加入少许水研磨成糊状,再加一定量50m mol.L -1磷酸盐缓冲液(p H =7.0)溶解,离心后取上清液储于4℃以下的冰箱中备用.本实验选用的浓度均为1mg/ml .2.2 显色剂的配制配制5%醋酸铜溶液,用吡啶调节至p H =6.1,既得脂肪酸显色剂.2.3 脂肪酸吸光度工作曲线的制定配置一系列不同浓度的油酸/苯溶液,分别取4ml 于锥形瓶中,加1ml 显色剂,磁力搅拌3分钟,油酸分子与Cu 2+生成绿色的络合物,离心后取上层有机相在710nm 下测定吸光度.用未加油酸的空白溶液作参比.以吸光度对油酸浓度作图,得一直线,既为脂肪酸吸光度工作曲线.2.4 脂肪酶活力测定用胶管将反应器与恒温槽连接,并调节恒温槽温度至37℃.取3ml50m mol.L -1磷酸盐缓冲液(p H =7.0)和1ml 橄榄油于反应器中,预热5分钟.然后用微量进样器注入0.1ml 酶溶液,磁力搅拌10分钟,立即加8ml 苯,继续搅拌2分钟,终止反应,同时萃取生成的脂肪酸.将溶液转移至离心试管中,在4000r/min 下离心10分钟,有机相和水相分层澄清.取上层有机相4ml 于小锥形瓶中,加1ml 显色剂在磁力搅拌器上搅拌3分钟,产生的脂肪酸与Cu 2+生成绿色络和物.取上层含有脂肪酸铜的苯溶液,用分光光度计在710nm 波长下测其吸光度.以同法制备但不含脂肪酶的空白溶液为参比,对照脂肪酸吸光度工作曲线,既可求得脂肪酸的浓度.由脂肪酶活力定义得活力计算公式・15・①收稿日期:2005-03-15作者简介:纪建业(1960-),男,通化师范学院化学系副教授.脂肪酶的活力(单位/ml)=CV/TV′式中C脂肪酸的浓度(μmol/ml);V脂肪酸/苯溶液的体积(ml);T作用时间(min);V′:酶液的用量(ml)3 结论与讨论3.1 显色剂单纯乙酸铜溶液与反应形成的铜皂在640nm有一较弱的吸收峰.当加入吡啶后,随着溶液p H值增大,铜皂的吸收成倍增加,同时吸收峰红移.在p H=6.0—6.2范围,铜皂的吸收最强.在710nm处,且在±10nm范围内,吸光度变化不大,因此须控制醋酸铜—吡啶的p H在6.1处.显色剂用量实验:取0.1mol/L油酸/苯溶液4ml于小锥形瓶中,室温下分别加不同量的显色剂,磁力搅拌3分钟.静止,待溶液分层澄清,以苯为参比液,测上层有机相的吸光度.以吸光度对显色剂用量作图,即得如图1所示显色剂用量曲线.从用量曲线看,取1ml显色剂是合适的.3.2 反应进程脂肪酶的活力是以催化橄榄油水解每分钟产生脂肪酸的量(微摩尔)来定义的,即用水解的初速度来表示.这就要求在测定活力时,反应时间应控制在酶的初速度范围内.图2是酶在p H=7.5,温度37℃,不同浓度下的反应进程曲线.由此可见,反应的初速度时间与酶的浓度有关,低浓度时反应初速度时间较长,高浓度时反应初速度时间较短.因此在测定酶的活力时反应时间应根据酶的浓度而定,选在图中的线性部分时间内,才能得到准确的结果.3.3 脂肪酸的碳链长短尽管饱和脂肪酸的铜皂在苯中的溶解度随碳链增长而降低,但是C8-C18脂肪酸的铜皂之摩尔吸光系数基本上相同,包括不饱和油酸在内,而油酸铜皂的溶解度比硬脂酸大得多,因此绘制吸光度工作曲线时以油酸作标准是合理可行的.3.4 p H值对酶活力的影响脂肪酶的活力与催化反应时的p H值的关系见图3.由图可见,p H值对酶的活力影响甚大,且不随p H值均匀变化.p H值=7.5时活力最大,p H值在5-8之间脂肪酶都有较高的活力(85%以上),这有利于脂肪酶的应用.当p H<3或p H>9时活力降低到13%以下.3.5温度对酶活力的影响图4给出了脂肪酶的活力与反应温度的关系.在p H值7.5的条件下,反应最适温度为35℃左右,30℃-40℃之间,酶的活力在85%以上,低于30℃时酶的活力随温度上升而急剧增加;高于40℃时酶的活力随温度上升又急剧减小,这是因为超过最适温度以后,酶空间结构遭到破坏,酶失去活性,不具有降低反应活化能的本领.3.6 底物浓度的影响图5是反应初速度与橄榄油浓度的关系曲线.可以看出,底物浓度增加,初速度加快.底物浓度低时,初速度与底物浓度成正比,当底物浓度增加到一定值时,初速度不再增加.本实验中选用的底物浓度为0.25(V/V).3.7 酶浓度的影响图6是反应初速度与酶浓度的关系曲线.与图5相似,低浓度时初速度与浓度成正比.随着酶浓度增加曲线向横坐标轴方向弯曲,不再保持线性关系,这一方面可能是由于酶制剂中存在着激活剂或抑制剂的缘故,另一方面底物对酶不是饱和状态.实验中选用的浓度为25μg/ml・・254 结论4.1 改进后的脂肪酶活力测定方法不需要制备乳化液,简化了操作步骤,克服了因乳化液不稳定造成的实验结果重现性差的缺点,采用了分光光度法测定生成的脂肪酸,使灵敏度提高(与滴定法比),有利于检测活力低的脂肪酶.4.2 脂肪酶催化反应的温度作用范围为30℃-40℃,最适35℃;p H 值作用范围为5-8,最适7.5,4.3 温度、p H 值对脂肪酶稳定性的影响.35℃以下几乎不失活,高于35℃温度升高,活力呈直线下降,50℃时几乎全部失活.p H5-7.5时冰箱中(1℃)无活力损失,室温下(17-19℃)活力能保持95%以上.参考文献:[1]五校合编.有机化学[M ].高等教育出版社,1986.[2]J.B.Joncs ,Tetrahedron ,42:3351(1986).[3]G.M.Whitcsidcs and C.H.Wong ,Angcw.Chcm.Int.Ed.Ed.Engl ,24:617(1985).[4]M.Ohno ed.,K ousokinou to seimitsuyuukigousei ,CMC ,Tokyo ,1984.[5]H.Yamade ,T.Tosa and T.Ueno eds.,Hybrid Processniyoru yuyonbussitsuseisan ,Kagaku Doujin ,Kyoto ,1991.[6]H.Yamada and S.Shimizu ,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,27:622(1988).The Determination of the Activity of LipaseJ I Jian -ye(Depart ment of Chemist ry ,Tonghua Teathers College ,Tonghua ,Jilin ,134002)Abstract :The traditional method for the determination of the Activity of lipase has been improved in the paper.The feasible con 2ditions are discussed synchronously in it.It is not necessary to prepare emulsificaction any more through the improved method.The resultant of fatty acid is determined by spectrophotometry and a higher sensitivity has been obtained.K eyw ords :lipase ;determination of activity ;temperature ;the value of p H・35・。
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及方法脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。
2. 所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司3. 标准曲线绘制：a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和(全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以 1 min 内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol 对硝基苯酸(p-NP) 所需的酶量为 1 个酶活单位(U)。
脂肪酶的微生物生产技术综述(优选参考)
脂肪酶的微生物生产技术综述By 夏远川脂肪酶是一种普遍存在于动植物和微生物体内的酶，也是最早研究的酶类之一，早在1834年就有关于兔胰腺脂肪酶活性的报道。
[1]脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，一般用于催化水解和合成反应，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯键的水解，生成甘油一酯、甘油二酯或直接生成甘油和脂肪酸。
[2]脂肪酶还可催化酯类化合物的醇解、酯化、酯交换等反应，且不需要辅酶，在工业生产和研究工作中均有广泛应用。
[3]脂肪酶按作用时的适应温度可分为高温脂肪酶、中温脂肪酶、低温脂肪酶；按适宜pH可分为碱性脂肪酶、中性脂肪酶、酸性脂肪酶。
脂肪酶的主要工业应用方向：1、洗涤工业：在洗涤剂中添加脂肪酶可使洗涤剂对脂质类污渍的去除效果大大提高，并可减少表面活性剂及无机助剂（尤其是三聚磷酸钠）的用量，大大减少洗涤剂带来的环境污染。
用于洗涤剂的脂肪酶为碱性脂肪酶，在碱性范围内有活性、活性不受表面活性剂影响、对氧系漂白剂稳定、热稳定性好，并且由于大多数加酶洗涤剂都适当配有蛋白酶，因此用于洗涤剂的脂肪酶还应具抗蛋白酶降解的能力。
[4]1988年，丹麦NOVO公司将碱性脂肪酶应用于洗涤剂中并推向市场。
1992年，这家公司构建了商业上第一株产脂肪酶菌株。
[1]2、食品工业：油脂改性是食品加工过程中的一个重要环节，脂肪酶可通过催化酯交换、酯转移、水解等反应，改变油脂的的物理化学性质，使便宜的、营养价值低的油脂升级为昂贵的、营养价值高的油脂；此外脂肪酶还可用于合成广泛应用于食品工业的糖酯类产品、合成不带副产物或毒性物质的芳香味酯类化合物、合成抗坏血酸酯类抗氧化剂如异抗坏血酸等。
[5]3、造纸工业：使用脂肪酶处理纸浆可减少胶黏物（绝大多数胶黏物都含有大量酯键）对造纸毛毯网间空隙的堵塞，提高纸机的运行效率和成纸品质，并降低环境污染，减少废水处理的负荷。
此外脂肪酶脱墨技术在废纸利用方面也起到非常大的作用，与传统脱墨技术相比脱墨效果更好环境污染更低，具有很大的优势。
最新脂肪酶酶活测定方法
脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。
其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。
近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。
脂肪酶在微生物中有广泛的分布。
脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游离脂肪酸→甘油酸酯+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸。
脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。
1 滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂）1.1 脂肪酶活力定义为1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。
1.2 测定原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。
反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。
1.3 仪器设备恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅拌器1.4 试剂溶液95％酒精4%聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）：称取4g PVA，加蒸馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。
橄榄油(分析纯)底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min）。
pH7.5磷酸缓冲液：称取十二水磷酸氢二钠39.62g，磷酸二氢钾1.96g，用水溶解并定容至500mL，调节溶液的pH 到7.5±0.05。
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万方数据
苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法．
１．３．３对硝基苯酚法
对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。
Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积．
２３种方法的比较
２．１实验仪器和操作难易程度的比较
平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。
培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２·１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。
超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。
精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。
操作简单［２·１８］（表１）．
２．２实验试剂及精确度的比较
平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。
精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。
１７｜．对硝基苯酚法使用的试剂主要是对硝基苯酚，稳定性好且非常精确［２．１８］（表１）．
２．３各种方法的适用范围
平板法所使用的仪器十分常见、所使用的试剂也比较便宜，但该种方法的误差较大同时需要的时间很长．因此该种方法主要应用于产脂肪酶菌种的筛选及批量酶样品的快速测定［１１］；滴定法所使用的仪器常见、操作简单，所使用的试剂比较便宜，精确度较高，适合于学生实验和具备简单仪器的实验室测定脂肪酶的活性［２］；铜皂法所使用的仪器较常见、操作繁琐、稳定性不高。
但实验精确度高且试剂较便宜，大部分实验室和生物技术公司用该种方法测定脂肪酶的活性［１５］；微乳液法所使用的仪器常见、操作简单，重复性好，但试剂价格偏高，主要适用于实验室和生物技术公司对酶活性的精确测定［１６－１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器常见，但试剂对硝基苯酚价格昂贵且有毒，主要适用于实验室对酶活性的精确测定［２．１８］（表１）．
表Ｉ平板法、滴定法及比色法的比较
３结论
在脂肪酶活性检测时，可根据实验目的、实验设施及节约成本的原则选择适宜的方法和底物来检测脂肪酶活性．在活性检测过程中，酶活力单位的计算尽量在最适温度、最适ｐＨ、酶浓度以及适宜的底物浓度下进行。
从而使测定的脂肪酶活性达到最大值，使结果更加准确和可信．另外，由于酶的活力单位可以根据计算和记录的方便而自行定义。
给交流和工业生产造成麻烦，建议在测定脂肪酶的活力时，尽量使用国际单位来计算·４４·酶活．
致谢本文受到贵州省教育厅重点扶持学科基金和凯里学院植物学重点学科基金资助．
参考文献：
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２００４，６４（６）：７６３—７８１．
万方数据
万方数据
脂肪酶活力测定方法及其比较
作者：雷启义， 邹凯， 周江菊， 张文华， LEI Qi-yi， ZOU Kai， ZHOU Jiang-ju， ZHANG Wen-hua
作者单位：雷启义,周江菊,张文华,LEI Qi-yi,ZHOU Jiang-ju,ZHANG Wen-hua(凯里学院环境与生命科学学院,贵州凯里,556011)， 邹凯,ZOU Kai(铜陵外国语学校,安徽铜陵,363100)
刊名：
凯里学院学报
英文刊名：Journal of Kaili University
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本文链接：/Periodical_qdnmzsfgdzkxxxb201106016.aspx。