激光共聚焦扫描显微镜简介
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介
.b ž激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。
同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”; 进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析; 还可用于活细胞生理信号, 离子含量的实时动态分析监测, 粘附细胞的分选, 细胞激光显微外科和光陷阱技术等。
可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
- www 生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mIntroductionžLSCM 是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。
ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件)ž图像输出设备LSCM 的基本组成生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mLSCM 的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。
激光扫描共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光共聚焦扫描显微镜
激光共聚焦扫描显微镜随着计算机技术和光电技术的飞跃发展，八十年代后期开始实际应用的激光共聚焦扫描显微镜（LSM），使人们在医学生物学上对活细胞的动态观察、细胞无损伤探测、免疫荧光标记和离子荧光探针的观察和研究上有了更加得心应手的手段和工具。
随着计算机、光学显微镜、大数值孔径复消色差物镜、高分辨率分析显示、激光源、激光功率、高敏感度探测器、声光转换电子控制和各种荧光标记物的发展，使得LSM向更精、更快、多维和无损伤性分析的方向发展。
概念：激光共聚焦扫描显微镜就是激光源加共聚焦显微镜，具体说就是利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察分析对象进行数字图象处理的一套观察和分析系统。
LSCM的主要组成部分及工作原理：illuminating pinhole:照明针孔功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
beamsplitter:光束分离器功能：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。
Objective:物镜功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole及detector pinhole两处聚焦。
共聚焦的含义由此而来。
detector pinhole:探测器针孔功能：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。
最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。
PMT：光电倍增管（探测器）功能：接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。
共聚焦激光扫描
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项 具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进 的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光 作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的 原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并 带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理 的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的 分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三 维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域 中得到了广泛应用。
光学低相干反射测量技术（OLCR） OLCR最早形成于七十年代，它利用低相干光干涉原 理测量反射光的幅度和相对相位，从而获取传输介 质的内部信息。 用途：集成光纤器件的特征或瑕疵检测。
1991年，美国的麻省理工学 院的J. G. Fujimoto和D. Hu ang等人成功地开发了光学 相干层析成像技术，该技术 结合了共焦显微术和低相干 光的外差探测技术，通过快 速扫描实现二维或三维层析 成像。
How a Confocal Image is Formed
Pinhole 1
Specimen
Pinhole 2
Condenser Lens
Hale Waihona Puke Objective Lens
Detector
Modified from: Handbook of Biological Confocal Microscopy. J.B.Pawley, Plennum Press, 1989
In vivo fiber-optic confocal reflectance microscope with an injection-molded plastic miniature objective lens
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Con- focal Microscope，LSCM）是20世纪80年代发展起来的一种新型高精度显微镜。
它在普通荧光显微镜的基础上加装激光扫描装置，使用可激发的荧光探针，采用敏感的光电倍增管作为检测器，利用计算机控制扫描反射镜并进行图像采集、处理和分析[1]。
激光扫描共聚焦显微技术不仅可用于观察各种固定的细胞和组织，还可对活细胞的形态、结构和离子的变化进行实时动态观察和测定[2]。
目前，这种技术已用于细胞形态定位、三维结构重建、细胞内离子动态变化过程等研究，并与定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段和技术相结合，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用[3]。
激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning mi-croscopy,CLSM)是一种新型高精度的激光源加共聚焦显微镜,是利用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察分析对象进行数字图像处理的一套观察和分析系统其最大特点是对标本进行无损伤性的实时观察分析, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号以及细胞形态的变化,对生物标本进行定性、定量、定时和定位研究,具有极大的优越性[1]。
主要构件一个完整的CLSM系统由几个主要的硬件和一些成像分析软件组成。
硬件包括表面荧光显微镜、激光光源及冷却系统、定位扫描装置、分辨系统、计算机控制系统、显示器和图像输出打印设备,软件由三维图像分析系统和三维图像文件管理系统构成[2]3主要功能3·1定性定量定位荧光分析CLSM可对单、双或三色标记的细胞及组织标本的荧光进行定性定量定位分析,还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。
此外,还适用于高灵敏度的快速免疫荧光测定,可以准确检测抗原表达、荧光原位杂交斑点及细胞结合和杀伤的形态学特性并作定量分析,以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息[6]。
激光扫描共聚焦显微镜-仪器百科
一、激光扫描共聚焦显微镜简介激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，简称CLSM）是近代生物医学图像仪器。
它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。
利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。
二、激光扫描共聚焦显微镜原理在普通宽视野光学显微镜中，整个标本全部都被水银弧光灯或氙灯的光线照明，图像可以用肉眼直接观察。
同时，来自焦点以外的其他区域的荧光对结构的干扰较大，尤其是标本的厚度在2um以上时，其影响更为明显。
激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。
组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。
在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。
因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。
由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。
以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。
三、激光扫描共焦显微镜的优点1.动态连续扫描及三维图像重组。
LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描,来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。
激光扫描共聚焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。
获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。
激光共聚焦显微镜
❖ 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐 点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧
光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的
聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波
长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有 较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
❖ 1·卵子产出后30秒的扫描电镜图像(Scanning electron microscopic images of an egg 30 minutes after spawni皮质 贮泡(cortical vesicle)×460
❖ 2·卵子产出后30秒时的透射电镜图像(Transmission electron microscopic images of egg 30 minutes after spawn
❖ 线粒体(mitochondria) Y:卵黄颗粒(yolk granule) CG:皮层 颗粒(cortical granule)×4 800
❖ 3·孵化膜正在形成,显示刚形成的孵化膜(HE)、两种皮层颗粒 (CG1、CG2)、卵黄颗粒(Y) [Hatching was forming, showing hatching envelope (HE) as just formed with two kinds of cortical granules (CG1、CG2) granule (Y)]×4 800
物学、胚胎学的活体研究及生理生化成份的动态变 化的研究中已有很大的进展(Hertzleret al.,1992,
1994; Jaffeet al.,1994;Lindsayetal.,1992;Malindaet
激光共聚焦扫描显微镜用途
激光共聚焦扫描显微镜用途激光共聚焦扫描显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy, LSCM）是一种高分辨率的成像技术，主要用于对细胞、组织和材料进行非破坏性的三维成像和分析。
它通过使用激光束扫描样品，获取高质量的荧光图像，并通过计算机处理和重建，实现对样品的横向和纵向解剖结构的可视化。
1.生物医学研究：激光共聚焦显微镜可用于观察活细胞的形态、结构和功能。
通过标记细胞的一些结构或分子，可以观察细胞器官的形态与位置、蛋白质的表达和分布、细胞的生理活动等。
同时，LSCM还可以进行细胞动力学研究，包括细胞迁移、分裂和凋亡等生物学过程。
2.神经科学研究：LSCM可以帮助神经科学家观察和研究神经元的形态和连接。
通过标记神经元的轴突和树突，可以实现对神经网络的全面观察和分析，从而揭示神经系统的组织构建和功能运作机制，并对神经退行性疾病和神经变性疾病的发生、发展和治疗提供重要参考。
3.组织学研究：激光共聚焦显微镜提供了对组织样本的高分辨率成像，在组织学研究中具有重要的应用前景。
可以观察和分析组织的细胞组织结构、器官形态、局部代谢情况等，进而探究组织发育、器官功能和疾病发展等问题。
4.生物材料分析：LSCM可用于研究生物材料的形态、结构和功能。
可以观察和分析材料的粒子分布、孔隙结构、表面性质、生物相容性等特征，从而用于材料的设计、制备和性能优化。
5.药物研究和药物筛选：激光共聚焦显微镜在药物研究和药物筛选中具有重要作用。
可以观察和分析药物的靶位结合情况、药物的进入细胞和细胞内分布、药物代谢等，从而揭示药物的作用机制和效应，对药物研发和药物筛选提供有力支持。
总之，激光共聚焦显微镜作为高分辨率的成像技术，在生命科学、材料科学和医学研究领域具有广泛应用前景。
通过对样本的高效成像和分析，可以揭示细胞和组织的细微结构和功能，进而促进研究人员对生命科学和材料科学的深入理解和应用发展。
激光共聚焦扫描显微镜技术
激光共聚焦扫描显微镜技术一、简介激光共聚焦扫描显微镜在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非焦平面及焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清晰度。
在此基础上，由于计算机及相应的软件技术组合，可以对较厚样品进行连续光学切片及三维重建。
目前，激光共聚焦显微镜（LSCM）技术已广泛应用于生物医学领域。
本文对LSCM的应用原理、较普通光镜的优点及生物学应用做简单介绍。
激光共聚焦扫描显微镜是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
其组成除光学显微镜部分之外主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集，处理，转换，应用软件）、图象输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。
在生物医学等研究领域中发挥重要作用，尤其在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维重建等方面，是传统的光学显微镜所望尘莫及的。
二、 L SCM的主要组成部分及工作原理：illuminating pinhole:照明针孔功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
beamsplitter:光束分离器功能：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。
Objective:物镜Focal plane:焦平面功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole及detector pinhole两处聚焦。
共聚焦的含义由此而来。
detector pinhole:探测器针孔功能：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。
最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。
激光共聚焦扫描显微镜简介
不激光共聚焦扫描显微镜简介一、激光共聚焦显微镜的基本组成激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。
激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。
与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。
所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。
激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。
2、扫描装置。
3、激光光源。
4、检测系统。
整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
1.1 显微镜光学系统显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。
显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。
物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。
物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。
1.2 扫描装置LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。
由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512（26万色）画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。
扫描系统的工作程序由计算机自动控制。
1.3 激光光源LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。
多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光，新的405nm半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线，但是小巧便宜而且维护简单。
激光扫描共聚焦显微镜dabian)
Immuno-fluorecence label
Hela green-中心体 red- 纺锤体
•定位、定量研究中常用荧光探针
1.Amine-Reactive Probes
与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可 用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等
FITC 异硫氰基荧光素 (四甲基异硫氰基罗丹明)
2.标记细胞器荧光探针
1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子性,可检
测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留 时间短 JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体 490/590 发红光 可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电 位最佳探针 Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 ,
Fluorescent Microscope Confocal Microscope
Arc Lamp
Laser
Excitation Diaphragm Excitation Filter
Ocular
Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Objective
Objective
等)。
一.定位、定量
免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量 如：细胞膜受体或抗原的分布，
微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与 共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化 细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位杂交-fitc + PI 荧光原位杂交： 染色体基因定位 单细胞凝胶电泳 GFP的表达 活细胞或活体组织静息游离Ca2+ 的分布与定量 活细胞内pH的定量、膜电位的测量 活细胞内自由基水平的定量
激光扫描共聚焦显微镜
荧光与透射光同时成像
动态观测
• 激光共聚焦显微镜的一大特点就是可以对 活细胞进行连续扫描，实现实时动态观测 。这样可记录细胞在外界某种条件的刺激 下瞬时发生的变化。
• 常用的有检测细胞内游离Ca 离子变化、细 胞内PH值变化，等等。
Ca离子动态检测
• 荧光染料：Fluo-3AM。 • 此染料可特异性标记细胞内游离Ca离子，
多色荧光标记检测
普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光， 要观测多种荧光标记的样品需要多次观测 ，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以 多激光多通道同时扫描，多通道同时探测 。
绿色：SYBR 14染色，活精子 红色：PI染色，死精子
牛精子
绿色：MitoTracker Green
紫色：Hoechst 33342
荧光强度
分层扫描（切片扫描）
• 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小
，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中 相当薄的一层被探测到，而其他层面不影 响成像。
分层扫描（切片扫描）
• 当观测较厚样品时，普通透射光不能透过 样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方 法来观测。
发射光
入射光 被检测层面
整个样品 白光（不能透过）
• 利用专用图象处理软件，还可以实现其他 许多数据分析。
分层扫描（切片扫描）
GFP与PE双色标记3D扫描
细胞“CT”片
3D模拟
Z轴分析
植物切片三维重建
细胞测量
周长
面积
长度
常用荧光探针介绍
细胞活性探针 细胞器探针 细胞骨架探针 核酸探针 细胞内离子探针
细胞活性探针
• 活细胞探针：吖叮橙（AO）
BacLight
Bacterial Viability Kit
激光扫描共聚焦显微镜
扫描速度慢
相对于传统的显微镜， 激光扫描共聚焦显微镜 的扫描速度较慢，需要 更长的时间来获取图像。
荧光衰减
荧光染料在长时间的光 照下会逐渐衰减，影响 图像的质量。
改进方向
降低成本
通过改进技术和降低制造成本，使更多 的实验室和研究机构能够使用激光扫描
共聚焦显微镜。
发展多色成像技术
利用多色荧光染料或光谱分离技术实 现多色成像，以便同时观察多个标记
物或细胞成分。
提高扫描速度
研究更快的扫描技术和算法，提高图 像的获取速度。
增强自动化和智能化
开发自动化和智能化的操作系统，减 少人工干预和操作时间，提高实验效 率。
05 激光扫描共聚焦显微镜与 其他显微镜的比较
传统显微镜
光源
传统显微镜使用普通光源，如灯泡或反射镜，提供均匀照明。
分辨率
受限于光的衍射极限，传统显微镜的分辨率相Байду номын сангаас较低。
其他现代显微技术
原子力显微镜（AFM）
01
利用原子间相互作用力进行成像，适用于表面形貌和物理性质
的测量。
扫描隧道显微镜（STM）
02
利用量子隧穿效应进行成像，适用于表面电子结构的测量。
光学 tweezers 技术
03
利用光束操纵微小粒子，实现细胞和分子水平的操控和观察。
06 激光扫描共聚焦显微镜的 未来发展与展望
激光扫描共聚焦显微镜
目录
• 激光扫描共聚焦显微镜简介 • 激光扫描共聚焦显微镜技术原理 • 激光扫描共聚焦显微镜操作流程 • 激光扫描共聚焦显微镜优缺点 • 激光扫描共聚焦显微镜与其他显微镜的比
较 • 激光扫描共聚焦显微镜的未来发展与展望
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介
依探针对电位变化响应速度,将电位敏感探针分为快响应探针和慢响应探针
快响应探针: 膜电位直接影响探针分子的电分布而改 变其光谱,响应快 慢响应探针: 主要通过改变其在膜内外的分布来对膜 电位的变化作出反应.跨膜运动需要一定的时间,所以 反应慢.
DCFH-DA常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化
Intensity Before bleach bleach After bleach 90 min after
多光子激光扫描显微镜— Multiphoton Laser Scanning Microscopy
在生物及医学成像,单分子探测,三维信息存 储,微加工等领域得到广泛应用,展示了广阔 的发展前景.
间标: 二抗+荧光探针(如:微管蛋白tublin)
肌动蛋白(Actin)标记
肌动蛋白是微丝的基本成分
毒伞素(鬼笔环肽)---与多聚体肌动蛋白微丝专 一性结合起来且亲和作用强烈.
微管蛋白(Tubulin)标记
染料荧光黄(LY)---黄色带电荷的小分子强荧光物质, 不通过细胞膜,但可以很容易通过GJIC,从标记的细胞 (划痕法)传输到邻近细胞. 观察LY向邻近细胞的传输速率,用以表示GJIC连接通 讯功能
4 高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie
根据不同细胞的特性,将每一种细胞特有的物质用不同 的荧光控针标记; 融合操作后,确认不同的荧光信号是否发生共定位于同 一细胞;
如在同一细胞中同时检测 到上述不同的荧光信号,则说 明已经发生了细胞融合.
骨架(微丝,微管和中等纤维) 直标: 一抗+荧光探针(如:肌动蛋白actin )
激光扫描共聚焦显微镜
1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
共聚焦激光扫描
基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器
小孔 聚焦透镜 激光束 光学扫描 Quarter Wave Plate 物镜 窗口 组织样品
分光器
色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。 B
对皮肤疾病的治疗与疗效评估需 要先进的皮肤诊断技术
共聚焦激光扫描（荧光）显微镜
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项 具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进 的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光 作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的 原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并 带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理 的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的 分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三 维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域 中得到了广泛应用。
1. 无创、原位、动态、即时
2. 对可疑皮损部位可进行多次、重复观察 3. 提供客观、量化的评估指标
皮肤影像学
内窥式激光共聚焦显微镜
横向分辨率为 3.1um；轴向 分辨率为 16.6um
J。Knitrtel et. al. optics communications 188(2001)267-273
How a Confocal Image is Formed
Pinhole 1 Pinhole 2
Specimen
Detector Condenser Lens Objective Lens
Modified from: Handbook of Biological Confocal Microscopy. J.B.Pawley, Plennum Press, 1989
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激光共聚焦扫描显微镜简介
一、激光共聚焦显微镜的基本组成
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。
激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。
与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。
所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。
激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。
2、扫描装置。
3、激光光源。
4、检测系统。
整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
1.1 显微镜光学系统
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。
显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。
物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。
物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。
1.2 扫描装置
LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。
由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画面每秒可达5帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。
扫描系统的工作程序由计算机自动控制。
1.3 激光光源
LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。
多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光。
1.4 检测系统
LSCM为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。
PMT前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要,也有通过光栅或棱镜分光后进行光谱扫描功能的设置。
二、激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用
与传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性：
1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。
2、可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。
3、多维图象的获得，如7 维图象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。
4、细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。
5、荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察；
6、对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。
主要应用：
1、细胞生物学：
如：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡机制；各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗体对紫外线引起的DNA损伤进行观察和定量；分析正常细胞和癌细胞细胞骨架与核改变之间的关系；细胞黏附行为等2、生物化学：
如：酶、核酸、受体分析、荧光原位杂交、杂色体基因定位等，利用共聚焦技术可以取代传统的核酸印迹染交等技术，进行基因的表达检测，使基因的转录、翻译等检测变的更加简单、准确。
3、药理学：
如：药物对细胞的作用及其动力学；药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量
4、生理学、发育生物学：
如：膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态；动物发育以及胚胎的形成，骨髓干细胞的分化行为；细胞膜电位的测量.荧光漂白恢复（FRAP）、荧光漂白丢失（FLIP）的测量等。
5、遗传学和组胚学：
如：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断；6、神经生物学：
如：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递；
7、微生物学和寄生虫学：
如：细菌、寄生虫形态结构；
8、病理学及病理学临床应用：
如：活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断；
9、免疫学、环境医学和营养学。
如：免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位，细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位；对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达，荧光能量共转移（FRET）。