宏基因组

宏基因组的研究步骤
从环境中提取生物DNA； 用核酸内切酶切割成一定长度的DNA片 段并连接到合适的载体上； 转化宿主菌，形成一个重组的DNA文库 即宏基因组文库； 宏基因组文库筛选。
从环境中提取生物DNA
提取步骤通常需要满足两个条件： ①尽可能提取样品所有微生物的基因， ②保持片段的完整和纯度。 目前所开发的DNA提取方法有两种： 直接裂解法和间接提取法
环境保护和污染修复
可以有效地从环境中分离新的基因、化合物和生 物催化剂； 所构建的工程菌可用于处理各种复杂污染物，是 非常有前景的降解酶系基因筛选方法； 所获取的多样性信息可以在废水处理的各种反应 器系统、污染物降解过程中微生物的作用和调控、 营养物循环和富营养作用的微生物生态、微生物 对环境和气候的监测等研究中发挥作用
宿主的选择
宏基因文库构建绝大多数采用cosmid、BAC或
fosmid为载体，其功能筛选宿主局限于大肠杆菌 ，但大肠杆菌并不是一个很理想的高效表达外源 基因的宿主细菌, 因而构建广宿主或穿梭宏基因 组文库在充分挖掘和筛选功能新基因的研究中尤 为重要。
宏基因组文库的建立
宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。 偏重于低拷贝、低丰度基因还是高拷贝、高丰度 基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物 还是整个操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。 基因文库的建立过程中需要选择合适的克隆载体 和宿主菌株 直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达载 体可插入的宏基因片段一般小于10 kb
底物诱导基因表达筛选 (substrate-induced gene-expression screening， SIGEX)
优点： 提供了一个有效的和经济的检测手段 增加了筛选的容量和效率 节省了时间 为高通量筛选提供了保障 不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心因修改底物而产生毒 性 可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能 尤其适合在工业上使用 缺点： 目标基因的结构性和适应性很敏感， 无法用于分析不能进入细胞质的底物， FACS对进样设备的要求也比较高； 代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都相邻； 有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他因子的诱导， 有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的， 有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表达
开拓天然产物新资源
2000年3月, Wang等人首次以链霉菌为宿主构建了土壤样 品宏基因组文库,并从中分离得到了外源基因的表达产物 Terragigine A2E 和Norcardamine 。其中, Terragigine 类为首次从eDNA重组微生物产物中发现的新类型的化合物。
医学的领域
宏基因组文库的筛选
筛选技术大致可分为 四类： ①基于核酸序列差异 分析；
②基于目的克隆功能 的特殊代谢活性；
③基于底物诱导基因 的表达； ④基于包括稳定性同 位素和荧光原位杂交 在内的其他技术。
基于序列的筛选方法
根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR 引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆。用这种 方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基 因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和 含有高度保守区的酶基因 对含有16S rRNA等系统进化锚定基因的克隆进行 测序或对文库随机测序 。 优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点 是必须对相关基因序列有一定的了解，文库中那 些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛选， 故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成 员有一定的局限性，也很难获得全序列。
环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复 获取任何序列的基因或功能，由此合成新 物质或发现新的生物物种。 发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐 受机制，帮助极端环境的污染修复。 从宏基因组中分离的重要基因元件组编成 具有其他活性成分、或可降解污染物功能 的基因簇，以替代原有不易降解化合物， 或直接降解环境中石油烃、有害有害化合 物、重金属。
Breitbart等利用宏基因组方法分析了人粪便中不可培养 的病毒群体，发现该群体中包含1200个病毒基因型，对其 序列分析表明大多数是之前没有报道的 Walter等对小鼠大肠微生物群构建了宏基因组文库，并对 表达β -葡聚糖酶活性的克隆进行了筛选，发现2个克隆是 来自不可培养微生物 Diaz—Torres等利用宏基因组学方法，对口腔细菌群体中 耐药基因进行了分析。结果证明用宏基因组学方法进行耐 药情况调查和研究是可行的 Gill等建立了人肠道微生物群的宏基因组，并对其代谢特 征进行了分析 Manichanh等利用宏基因组方法对比研究了正常人和节段 性回肠炎病人肠道微生物多样性，发现病人肠道微生物多 样性大大降低，尤其是硬壁菌门的细菌种类大大减少
载体的选择
一般选用质粒、粘粒或者Fosmid 载体来构建文库，其插 入片断小于40kb, 对生物合成比较复杂的化合物，因其基 因簇较大，则无法完整克隆。
细菌人工染色体（BAC）载体能克隆100 kb以上的大插入 片断，完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其 拷贝数目和表达量低。因而可选择和改进已有的穿梭 BAC 载体来构建文库，达到其拷贝数量可以诱导控制的目的， 在必要时可诱导增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克 隆和序列分析。
待解决问题
文库的质量，目前已发表的文库很少能够覆盖整 个宏基因组，这需要进一步优化DNA的提取及克隆 方法。 高通量的有效筛选平台，目前从几万或几十万个 克隆中只能筛选到几个有活性的基因，这主要是 由于微生物多样性高，宏基因组比较复杂，以及 外源基因在宿主菌中的表达障碍等等。 宏基因组学研究主要集中于原核生物，对真菌等 真核生物研究较少，所构建文库多为DNA文库， cDNA文库较少。
宏基因组文库的分析
宏基因组文库 Metagenomic Library
通过PCR 或者杂 交筛选特定序列
SIGEX
通过功能筛选特 定表型的阳性克 隆
宏基因组的应用
海洋微生物 环境保护和污染修复 开创天然产物新资源 医学领域 新型生物催化剂开发
海洋微生物上的应用
海洋蕴涵着非常丰富的微生物资源，宏基 因组工程与海洋生物学进行有机的结合， 可促使人类了解许多为培养海洋微生物的 基因组序列及其功能产物，在海洋天然药 物研究、海洋极端环境微生物研究、海洋 微生物多样性探索中具有十分重要的应用 前景。 目前已应用宏基因组技术研究了多种海洋 次生代谢产物合成途径，其中最为经典的 是研究海洋聚酮类和非核糖体肽类的生物 合成基因簇
直接裂解法
操作方法：将环境样品直接悬浮在裂解缓 冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法 (如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮 研磨法等)和化学法、酶法等 提取方法差别：细胞破壁的方式不同 优点：操作容易、成本低、DNA提取率高、 重复性好 缺点：但由于强烈的机械剪切作用，所提 取的DNA片段较小(1—50 kb) )且多为平端， 不利于建库，同时难以完全去除酚类物质
间接提取法
操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中 分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先 采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在 低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。 优点：可获得大片段DNA(20—500 kb)且纯度高 缺点：操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过 程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微 生物DNA 也不容易抽提出来。所获得的DNA产率比 直接裂解法少10—100倍
小结
宏基因组学研究将大大扩展我们对生命 的了解，包括了解生命如何耐受极端环境、 新的生物能源、生命进化以及微生物与环境 之间的相互作用。宏基因组技术通过对环境 DNA的直接克隆, 为研究和利用占微生物种 类 99 %以上的未可培养微生物提供了新的 途径。随着新的科技方法的不断发展，宏基 因组的应用范围将会越来越广泛。
宏基因组
产生背景 什么是宏基因组 宏基因组的研究步骤 宏基因组的应用

参与人员：黄雨欣、梁龙锋、王江飞、张伟苗、余中华
产生背景
人类基因组计划(human genome project， HGP)的完成，从结构基因组学进入以功能 性基因组研究为主的后基因组时代 人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基 因控制，还与其他生物基因组相关。已证 明体内菌群的组成和活动与人的生长发育、 生老病死息息相关。 要想了解生命的起源、本质、进化和相互 作用及影响，就必须对彼此密切相关的生 物进行各个基因组学及其相互关系的研究
底物诱导基因表达筛选 (substrate-induced gene-expression screening，SIGEX) 原理：SIGEX 是用于能利用各种底物诱导 的分解代谢型基因的检出，并结合生物发 光技术用来筛选代谢相关基因及酶基因。 由于编码相关代谢基因或酶基因通常呈簇 存在，通常与该物质诱导的启动子和同源 转录调控序列毗邻，往往在有底物诱导的 条件下才表达，反之则不表达。
什么是宏基因组

“1998年Handelsman等 首次提出宏基因组的概念。 一种以环境样品中的微生 物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分 析为研究手段,以微生物 多样性、种群结构、进化 关系、功能活性、相互协 作关系、及与环境之间的 关系为研究目的的新的微 生物研究方法。
宏基因组(the genomes of the total micro biota found in nature) 是指 生境中全部微生物基因的总和。它包 含了可培养的和未培养的微生物的基 因总和，微生物主要包括环境样品中 的细菌和真菌。
基于功能的筛选方法
优点是筛选过程比较简单、快速，只要基因能表 达，就可以根据基因表达特性进行筛选，不需要 复杂的实验过程。 缺点是这种筛选方法依赖于目的基因在新的宿主 中表达，但使用模式微生物并不能把所有的宏基 因组DNA表达出来，而且要求克隆到基因或基因簇 的全长，一旦克隆过程中破坏基因某个组件将使 得基因没法表达，也就不能根据功能进行筛选， 故检出的概率很低，工作量大
新型生物催化剂开发
传统的新型酶的筛选方法大大限制了筛选的广泛 性和有效性。宏基因组学通过直接从环境中提取 DNA 样品,尽可能为后面的筛选提供更加全面和多 样的基因资源,从而有效地提高了新酶的筛选效率。 一般来说,新功能酶的筛选主要还是基于活性筛选。 这种不依赖于序列的方法总体上可对所有新酶的 活性或特异性进行鉴定。虽然,基于序列的筛选方 法可能不像功能筛选那样具有较强的目标性,但通 过有目的地设计杂交探针或PCR 引物,可一定程度 地减少文库的容量,缩小筛选的范围。
基于功能的筛选方法
功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和 优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功 能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克 隆 不需要已知序列的信息，能较快地找到可用于工 农业和医药的蛋白质和天然产物 一种是对具有特殊功能的克隆子进行直接检测， 如利用其在选择性培养基上的表型特征进行筛选。 这种方法具有较高的灵敏度，可检测到较少的目 的克隆。 另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变 体在选择性条件下功能互补生长的特性进行 。
基于稳定性同位素技术筛选方法
具有相同原子序 数但不同中子数 目且不具放射性 的元素称为稳定 同位素(stable isotope probing，SIP)。 环境中的许多物 质都可以用SIP 来标记，鉴定和 分析复杂样本中 进行有特殊代谢 功能的微生物
环பைடு நூலகம்样品
宏基因组文库的构建 抽提DNA ) 克隆(多种载体) 转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌
医学领域
新感染性疾病的发现(例如临床存在很多不明原因 的发热病人．他们中是否有被不可培养微生物感 染的可能．值得深入探讨)； 正常人及某些疾病患者的肠道生境中微生物群体 多样性分析，以及与疾病的可能关系； 不可培养微生物耐药情况及其机制分析，以及在 耐药传播机制中的作用； 特殊微生物群体致病机制研究(例如生物膜的研究) 从微生物生境中发现有医学应用价值的生物活性 新物质