Western-blot实验方法步骤..
Western-blot实验操作步骤
Western-blot实验操作步骤Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。
1.配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
western blot实验流程(自己整理)
Western Blot实验步骤1.制胶2.细胞蛋白抽提步骤1.提前预冷离心机，溶解lysis buffer；2.将细胞沉淀置于冰上；1ml PBS重悬，4℃离心5min，（除去样中微量血清）；3.每107cells加裂解工作液100ul，轻轻重悬细胞沉淀；4.置冰上10min，其间振荡2-3次；5.13000rpm离心10min，4℃；6.将上清转到小离心管中；7.取出1ul，用于Bradford测定蛋白浓度（ug/ul）=（样本OD值的平均值-对照OD值平均值）*斜率100℃，5min；提前预热。
中间打开盖子1~2次。
6.上样电泳（100V，90min）向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。
玻璃板内侧液面高于外侧。
然后开始上样，保证每孔总蛋白量在30-50ug,总上样量小于30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。
上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。
通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。
电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3 小时。
电泳时间根据具体情况定。
7.转膜（250mA，1h 30min）转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板湿式电转膜1. 电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。
按“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素NC 膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC 膜与胶，NC 膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。
2. 转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（-20℃），确保NC 膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
western blot实验步骤
一、提取组织蛋白新鲜肺组织取20-30mg，减去气管，组织匀浆机研磨，100W超声3S，12000r/min离心37℃孵育30min，测OD562。
按所得结果定量到50微升计算上样量，将20微升上清分装到一个1.5ml的EP管，加5微升上样缓冲液，-20℃冻存。
二、煮样95℃，煮10min,待温度降到室温关闭机器，煮后的组织离心7500r/min，1min备用三、安装玻璃板，倒入电泳缓冲液，拔梳子，用进样针吸取计算的上样量上样，装好正负极，倒满电泳液，设置80V，30min跑条带，结束后100V，60min，没跑到底酌情延长时间(30min)，准备转膜所需工具：1.剪好6片滤纸，转膜液湿润海绵及滤纸，赶气泡。
2.PVDF膜，准备甲醇激活膜2min，蒸馏水5min电泳时间到关闭电源，取出玻璃板，准备切胶，切好后，按形状切稍大一圈的PVDF膜，覆盖到切好的胶上，标记好上下。
安好夹子，放入电泳槽准备转膜，转膜需冰浴。
四、转膜结束后，将膜取下，TBST清洗3遍，每遍5min。
五、7%牛奶（1.75g，加TBST 25毫升）,封闭2小时，慢摇。
六、封一抗内参：β-actinα-SMA:1：10000配制波形蛋白：1：5000制备杂交袋，放入膜，滴入抗体，封口，4℃过夜七、将过夜的膜放入37℃恒温箱中孵育30min，结束后回收一抗，标记好第几次用，TBST清洗膜3遍，每遍10min。
八、封二抗：羊抗兔HRP(1：5000)稀释，配制10ml，慢摇1小时后回收二抗，标记好第几次。
TBST清洗膜3遍，每遍15min。
九、1：1配制发光液（避光保存），准备眼科镊、滤纸、托盘、曝光，先曝背景再报条带，先自动后手动。
Western blot实验步骤
1.9/ 4× 分 离 胶 缓 冲 液 3.61 （mL） 10% 过硫酸氨（ L ） 112/
168
TEMED（L） 分离范围（kDa）
5.0/7.5 36-150
3.7/5.5 5 1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 7.染色液：称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入
甲醇450ml，冰乙酸100ml、水650ml。
• 8.脱色液 ：甲醇100ml，冰乙酸700ml，加水 830ml。 • 9.十二烷基硫酸钠（SDS）溶液:10%(w/v) 1g SDS，10ml去离子水配制，室温保存。
SDS-PAGE 电泳采用 Tris- 甘氨酸系统，即按分子克隆 中Sambrook等的方法（Sambrook, 1989）进行
• PVDF膜（ 聚偏二氟乙烯，polyvinylidene fluoride)的预处理 ： 在甲醇浸泡10秒湿润膜，转移缓冲液浸泡10－15 分钟，除去甲醇。PVDF是疏水性的，在转膜缓冲 液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润，且甲 醇处理活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易 跟带负电的蛋白质结合； • PVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDF膜 可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质， 最初是将它用于蛋白质的序列测定，虽然PDVF膜 结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它 的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
WB实验步骤
Western blot 实验步骤及注意事项1.细胞蛋白提取1)25ml培养瓶弃干净培养基，可倒置于吸水纸或正立使液流至瓶底，用枪头吸净；再用预冷的PBS清洗3次，枪头吸净。
2)配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1（PMSF使用浓度为1mM，由17.4mg PMSF粉末和1ml异丙醇配制），每培养瓶加200μl细胞裂解液。
于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。
3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）4)于4℃下 12000rpm 离心 15min。
（提前开离心机预冷）5)将离心后的上清分装转移至0.5min 的离心管中放于－80℃保存。
6)蛋白变性：蛋白上清与5x SDS蛋白上样缓冲液按4:1混合（即每100μl蛋白中加25μl缓冲液），置于100℃水浴箱中水浴5min使之充分变性，置于－20℃保存。
2.制胶与上样1)清洗玻璃板：扣紧玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水超纯水冲洗干净后立在筐里晾干。
a 测漏实验（那个玻璃板装好，再整体装在板子上）2)灌胶与上样：（从一侧加入胶液9混匀，匀速加入）①10% SDS--- SDS 10g+水100ml （将10g SDS加到90ml水中,加热溶解，然后定容至100ml，室温保存;常温放置若出现沉淀，可放37℃水浴箱中温浴）②10%过硫酸铵（AP）---过硫酸铵 0.1g+超纯水10ml (溶解后，4℃保存，保存时间为1w)③根据分离胶及浓缩胶表的浓度制胶，分离胶灌胶后用无水乙醇或水压胶，灌浓缩胶后马上放梳子。
（胶一定要平，不留气泡）④配制电泳液：1L纯水+3.03g Tris+18.77 Glycine+1g SDS，溶解后室温保存。
⑤将玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板向内，大玻璃板向外）。
加入足够电泳液，最少没过小玻璃板，两手捏住梳子两边轻轻拔出。
Western Blot实验详细步骤
Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL 停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。
）1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。
装置运行时需冰浴。
）五、封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
westernblot实验步骤
westernblot实验步骤Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法，适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。
下面将介绍Western blot实验的主要步骤，以及注意事项。
1. SDS-PAGE凝胶电泳Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE （Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种分离蛋白质的方法，可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。
在SDS-PAGE中，蛋白质会被特定化学物质SDS （十二烷基硫酸钠）包裹，其带负电荷的端口相互排斥，并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行，根据大小排序在不同位置。
2.转移蛋白质到膜上SDS-PAGE电泳完毕后，需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。
转移可以采用湿式或半干燥式方法，膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。
3.蛋白质与抗体结合膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合，使其出现颜色。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体，通常由动物免疫学制备而成。
在结合抗体之前，膜需要被阻断，以避免非特异性的背景信号。
4.识别蛋白质识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。
蛋白质与特定抗体形成复合物后，可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。
底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶，在底物的作用下，可生成可见信号，如液态手套（ECL）。
注意事项：1.蛋白质的提取和纯化，提取方式会影响到实验结果，选择适当的提取方法是十分重要的。
2.涉及到蛋白质电泳和转移过程，准确控制电泳时间和电压，转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。
3.在结合抗体前，必须阻断膜上的未被结合的蛋白质，减小背景信号。
通常使用酵素或乳清蛋白等物质进行阻断，以避免非特异性结合。
4.选择合适的底物，控制反应条件，避免过度堆积或实验时间不够导致底物显色偏低。
Western blot实验步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）原理
• 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）是蛋白质 分析过程中最常用的技术。
• 蛋白质在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本 身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在 PAGE 中加入阴离子去污剂 SDS, SDS 将蛋白质的二硫键、氢 键及疏水键打开，使蛋白质变性， SDS 将包裹在变性 蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子，同时，由于SDS带 有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。这 样，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白带有的 SDS 量，而 SDS 与蛋白结合的量与蛋白的分子量成正比， 即迁移率决定于蛋白质分子量大小 。因此利用 SDSPAGE可测定蛋白质的分子量。
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 5. 10×电极缓冲液：称取Tris 30g、甘 氨酸144g，加入10％SDS 100ml，定容至 1000ml, pH8.8
• 6. 2X样品缓冲液:甘油2ml（或称取蔗糖2g ），加 入10％SDS 2ml，溴酚蓝0.25mg，浓缩胶缓冲液2.5ml、 ß －巯基乙醇0.5ml，加水定容至10ml。 • （加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子, 可以自由通过凝胶孔径, 所以它显示着电泳的前沿位 置,当指示剂到达凝胶底部时, 即可停止电泳）
• 蛋白质样品在上样电泳前均需变性。
Western Blot实验步骤
Western Blot实验步骤蛋白抽提①把组织剪切成细小的碎片。
②融解Western及IP细胞裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
③按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液（如果裂解液不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量）。
④用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
在冰上放置30min。
⑤充分裂解后，4o C 13000g离心30分钟，取上清，其中一部分按1uL样品+4uLPBS 稀释后取2uL用于测蛋白浓度。
另一部分煮沸10分钟-20o C保存。
蛋白质定量：采用BCA蛋白测定法①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品，取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/mL。
用PBS稀释标准品。
③将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20微升加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20微升。
④加上述稀释5倍的样品2uL加到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。
注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。
⑥测定A562的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
SDS-PAGE电泳①根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，配制SDS-PAGE浓缩胶与分离胶：本实验浓缩胶为3.9%，分离胶为8%和10%。
使用Whatman 3 mm 滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制浓缩胶。
用10mL注射器将浓缩胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。
western blot 全过程 详细步骤
一：提蛋白：1.PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。
2.在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。
3.4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。
4.取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。
5.96孔板中每孔加2ul蛋白液。
6.每孔加200ulA/B混合液。
7.37度半小时。
8.测浓度以及标化用一起在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及loding buffer，还有标化后的浓度。
562波长0.046斜率（实验组值-对照组值）/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug）9.加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。
二：跑胶1. 1.0玻板，洗干净2.配制10%或者12%分离胶一块胶需要5ml3.灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇4.配制5%浓缩胶2块胶需要4ml5.待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子6.待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线丝）7.预电泳，100v，10-15min8.加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul9.60v 10-20min，之后100-110v三：转膜1.配transfer buffer ，用10*transfer buffer 稀释10倍，并加20%甲醇2.transfer buffer浸泡海绵、滤纸3.pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transfer buffer里20min4.胶取出，在transfer buffer里泡10min5.黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸）6.转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑）四：封闭、一抗、二抗1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h 37度2.一抗4度12h3.pbst洗膜，3次，每次10min4.二抗（1:5000）1h 37度5. pbst洗膜，3次，每次10min6.显影剂A和B各300ulPBST：1000ml’PBS+1mltween5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉10*running buffer：tris 30.3g 甘氨酸144.1g sds 10g 加水至1000ml10*transfer buffer：tris 30.3g 甘氨酸144.1g 加水至1000ml1* transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇加水至1000ml。
完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
Western blot具体实验操作步骤
一、提取总蛋白1.将皿中上清吸光后，用外用PBS将皿洗3遍，最后一遍将皿内液体吸光（否则会降低蛋白浓度）。
（亦可先将带有PBS的细胞刮入1.5ml EP管，离心后弃去上清）2.配制裂解液:1ml RIPA裂解液（4度冰箱棕瓶）(0.5M Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 1%NP40, 0.5% 去氧胆酸钠, 0.1%SDS)加入5μl PMSF（-20度冰柜内矩形盒小管内）(蛋白酶抑制剂，防蛋白降解).根据皿中细胞团块大小加入100-300μl裂解液, 4℃摇床30min3.皿中液体吸至1.5mlEP管，离心机预冷后， 4℃，12000×g（RCF），离心15min后取上清(装于500μlEP管)（可分装后-20℃保存）。
二、BCA蛋白浓度测定1.按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；2.完全溶解蛋白标准品（存于-20℃冰箱第一抽屉），取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml；3.将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的标准品孔中，用专用生理盐水补足到20微升;4.加1μL样品到96孔板的样品空中，加生理盐水19微升;5.各孔加入200微升BCA工作液，37℃孵箱放置30分钟;6. 570nm波长测定蛋白。
根据标准曲线计算出蛋白浓度EXCEL详细过程：标曲：上一行吸光度，下一行浓度（0，0.5，1，2，4，6，8，10），以此作标曲，标曲相关系数须达两个9，以这次的样品为例，算得两样品浓度分别为4.09和5.26 因为须上样100μg，所以算得须上样的蛋白体积=100/4.09=24.5μL所以上样须补水30-24.5=5.5μL及βme：6×SDS（2：3）为10μL现此样品蛋白体积足够煮10份，即按照245μL蛋白样品+55μL水+100μLβme：SDS（2：3）来配注意：SDS很粘，须涡旋再低速离心，使用枪时须慢吸三、煮蛋白：加样配制: 总体积:40μL（含蛋白液与dH2O混合物30μL+β-meSDS10μL）1.β-巯基乙醇（β-me）：6×SDS（2：3）样品缓冲液10μL2.蛋白取量取一组蛋白中,样品蛋白加的体积=蛋白浓度最低的浓度*30μL/每个样品浓度3.剩余的体积即30μL-样品蛋白加的体积，即为各管需补加水的体积4.多加一点防煮时蒸发部分混和后file22-start100℃煮沸5 min。
Western Blot 详细实验步骤
Western Blot protocol1，制样：将获得的细胞用PBS洗涤，300gx4℃x5min,弃去上清。
加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。
放到干浴锅100℃煮10min，放入冰上5min，最后存入-20℃冰箱待用。
2，将样品取出待用，可100℃煮2min，待上样。
3，配胶：浓缩胶5%，分离胶8%，10%或12%（分子大用低浓度，分子小用高浓度Caspase3 35kD，12%浓度(活性形式17kD)；DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度）：ddH2O，30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。
1）夹好板子，用ddH2O捡漏，5min。
2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶（50ml管子），混匀。
3）加胶7ml，大致与夹子的门平齐。
随后轻轻加3ml乙醇液封页面。
静置30min。
4）将乙醇倒掉，用ddH2O清洗3遍。
5）制备浓缩胶，加入3ml左右只玻璃板界面，插入梳子。
6）静置30min后拔掉梳子。
取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。
7）若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。
（TEMED在灌胶前加入）4，上样：1）固定好玻片，加入running buffer 没过底板，盖上盖子。
2）浓缩胶75-80V 30min左右，分离胶100V-120V 1h左右。
5，转膜：1）取出玻璃板，用切胶器轻轻撬动取掉小玻片，切去浓缩胶（将分离胶放入放入ddH2O水中浸泡5min，重复三次）再放入trans buffer中放置10min。
2）剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡，使其带正电。
3）将PVDF，海绵垫，滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。
4）在黑色面板依次放入海绵垫，至少3层滤纸，胶，转移膜，注意不能有气泡，再放滤纸，海绵垫形成夹心结构。
(大分子用0.4 um PVDF 膜，小分子用0.25um PVDF膜)。
WesternBlot实验步骤
WesternBlot实验步骤Western Blot实验步骤Western Blot操作步骤：（一）蛋白样品制备选TRIZOL 法（二）蛋白含量的测定（1）制作标准曲线1、从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0 g，2.5 g，5.0g ，10.0 g ，20.0 g ，40.0 g。
4、混匀后，室温放置2min。
在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。
5、（2）检测样品蛋白含量1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。
室温放置30min后即可用于测蛋白。
2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 l，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。
4、取一管考马斯亮蓝加95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5 l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample检测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。
可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。
测得的结果是5 l样品含的蛋白量。
（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面Western Blot实验步骤快到所需高度时要放慢速度。
Western Blot 实验步骤及注意事项
Western Blot 实验步骤及注意事项western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤1.缓冲液配制(1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol（临用前加）,ddH2O to 1L(2)10×TBS: 1 M Tris・HCl（pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液：脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE电泳电压：积层胶电泳电压80V左右，分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹(1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜，与凝胶大小相符合。
将PVDF膜事先用甲醇浸泡，再用转移缓冲液浸泡。
(2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移时间）。
(3) 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。
(4) 以1/1000的比例，加入5 μL第一抗体，4 ℃温育过夜。
(5) TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。
(6)加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL第二抗体，温育1 h。
(7) TBST溶液洗膜5min，轻倒，重复3次。
(8)加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气，滤纸吸干显色底物。
放入夹板中。
(9)配制显影液和定影液。
暗室操作：将X光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
Western Blot实验详细步骤
Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。
）1、转印滤纸：全胶长，宽，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁* ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。
装置运行时需冰浴。
）五、封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
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细胞准备
• 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮 子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得 很粘稠。吸入1.5ml离心管。 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层 为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 有必要时重复上一步骤。 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上 清转入另一Eppendorf -80°C保存
溶解蛋白策略
• 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这 可能导致免疫反应性的丢失。 • 2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造 成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。 • 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞 表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力， 变性蛋白比天然蛋白更容易降解。 • 往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调 整提取的条件。 • 为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清 或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多 种形式起反应。
Western-blot 试验
概论
• 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。 • 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。 • 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学 的研究。
溶解方法
• 溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： • 1 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲 液裂解。 • 2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后 制备提取液。 • 3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS 凝胶加样缓冲液。 • 4 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗 原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液 裂解。
仪器与设备
• • • • • • 低温超速离心机（Eppendorf公司） 分光光度计（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司） 电泳仪（Bio-Rad 公司） 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司）
配制试剂
• 10×电泳Buffer 称取Tris-base 30.3克 glycine 144克 加去离子水，定容至1000ml SDS 10克 1.5M Tris.HCl PH 8.8 称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml 0.5M Tris.HCl PH6.8 称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml 转膜缓冲液 称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml，临用前加200ml甲醇 10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml。
配制试剂
• 4×SDS Sample Buffer 2.4克 Tris HCL，溶解在30ml水中，调pH6.8 8克SDS 0.4克溴酚兰 定容至100ml 40ml甘油 10ml DTT贮存液 • 1mol/L DTT贮存液：0.01mol/L 乙酸钠 20ml 3.09克DTT过滤除菌后20℃保存，分装成1ml。 • 考马斯亮兰染液： 45ml 甲醇 45ml 水 用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质 10ml 冰乙酸 0.25克 考马斯亮兰R250
抗体选择
• 一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例 如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合 作为探针用于WETERN-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是彻 底变性的。 • 多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物， 通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可 能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白 上的不同抗原表位的效果。 • 设臵对照： 1不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆 抗体） 2 样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的 制品 • 选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合 物为佳。
• •
• •
注意事项
• 细胞裂解液的量 • 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡 沫。 • 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS －PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋白。 • 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可 被检测。 • 未知蛋白应同时作阳性对照。
主要试剂
• • • • • • • • • • • • RIPA（华舜公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 双丙烯酰胺（Amresco公司） 丽春红染料（华舜公司） Tween 20（Amresco公司） 过硫酸铵（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纤维素膜（Amersham公司） 考马斯亮兰（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司）