奶粉中蛋白质含量实验方法
奶粉中蛋白质含量测定
奶粉中蛋白质含量测定
1.前言：在蛋白质研究领域中，用一种快速准确的方法来检测蛋白浓度是必不可少的。与双缩脲法、紫外吸收法相比，新建立的考马斯亮蓝法在许多情况下已成为定量检测蛋白浓度的首选方法。同时，与传统的Lowry法相比，该法具备更易操作，更快，更灵敏以及受其它试剂和非蛋白成分干扰较小等优势。其检测原理是基于染料考马斯蓝G250和蛋白质之间可以形成特异性结合。详细的研究表明[1]，该染料可以自由存在于四种不同的离子形式中。相比之下，染料更多的阴离子形式与蛋白质结合且结合后显蓝色，在590 nm左右具有最大吸收。因此通过测定染料中蓝色离子的量就可以折算出蛋白质的量，这通常可以在595 nm处测定吸光度获得。
2.实验方案及原理：
（1）①实验流程：
前期原料配备
标准曲线绘制
样品测定
②实验前期准备：
Ⅰ、称取奶粉样品，配制成5mg/ml的溶液。再取0.3ml该溶液于试管，再加入0.7ml去离子水，9ml考马斯亮蓝G-250，配制成奶粉含量为150μg/ml的样品溶液；
Ⅱ、配制浓度为0.4mg/ml的标准牛血清蛋白（BSA）溶液,选用五个点绘制标准曲线，这五点BSA溶液体积分别为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8ml，同时相应地加入9ml考马斯亮蓝G-250和水，每份配制成体积为10ml的溶液，即每份含BSA的量为40，80，160，240，320μg。浓度分别为4，8，16，24，32μg/ml。配制相同两组，分别记为A组和B组。如下表：
溶液序号0 1 2 3 4 5
0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8
凯氏定氮法测定奶粉中蛋白质含量的...
凯氏定氮法测定奶粉中蛋白质含量的步骤如下：
① 样品处理：准确称取奶粉试样1.000 g置于烧瓶中，加入足量不含氮元素的试剂A，一定条件下充分反应，产物用水溶解并冷却后全部转移至100 mL容量瓶中定容。
② 碱化蒸馏：量取容量瓶中溶液10.00 mL转移至右图所示的反应管中，再加入足量NaOH溶液，塞好进样口橡皮塞。通入高温水蒸气。用吸收剂吸收产生的气体。
③ 滴定：向吸收气体后的溶液中滴加2滴指示剂，用0.01 mol/LHCl标准溶液滴定至终点。
已知：
吸收剂中发生的反应为：NH3＋4H3BO3＝NH4HB4O7＋5H2O；
滴定时发生的反应为：NH4HB4O7＋HCl＋5H2O＝NH4Cl＋4H3BO3。
根据以上知识回答下列问题：
⑴ 样品处理的目的是；通入高温水蒸汽的作用除加热外，还有。
⑵ 冷凝管的作用是冷凝、导气、。
⑶ 若蛋白质中氮元素的平均含量为16.0 %，滴定终点时消耗盐酸标准液15.50 mL，则该奶粉中蛋白质的含量为 %。
⑷ 凯氏定氮法测定奶粉中蛋白质含量灵敏度高，操作简单，缺点是。
⑴ 将奶粉中氮元素全部转变为NH4＋使反应中生成的氨气全部进入吸收液
⑵ 防止倒吸
⑶ 13.6
⑷ 无法确定氮元素是否一定来自于蛋白质
解析:
本题以凯氏定氮法测定奶粉中蛋白质含量，涉及酸碱中和，含量计算等知识点，属中档题。（1）从已知的反应方程式可以看出，吸收剂吸收的是NH3，步骤②，加入NaOH反应出NH3，故步骤①中，样品的处理目的是将N元素转变成NH4＋。（2）从装置图可分析知，通入水蒸气可以将NH3带入右侧的吸收剂中。左侧高温水蒸气相当于加热，故冷凝管的另一作用是防止倒吸。（3）由方程式可找出关系为：N~NH3~ NH4HB4O7~HCl，m(N)=14×0.01×15.5×10-3×10=2.17×10-2g，m(蛋白质)%= =13.6%。（4）此法只能测出奶粉中所有的N的含量，而不能确定N元素来自蛋白质。
奶粉中蛋白质含量测量不确定度评定报告
测量不确定度评定报告
编制：
审核：
批准：
年月日
1目的
评定 食品中蛋白质的测定GB 5009.5 第一法 项目测量不确定度，本次实验测定奶粉中蛋白质含量。
2检测过程描述
称取充分混匀的固体试样0.2g-2g ，精确至0.001g ，至消化管中，再加入0.4g 硫酸铜、6g 硫酸钾及20mL 硫酸于消化炉进行消化。当消化炉温度达到420℃之后，继续消化1h ，此时消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却后加入50mL 水，于自动凯氏定氮仪上自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据。同时测定空白。
3所用仪器设备和标准物质：
4数学模型
根据检测标准中规定的检测原理，建立被测量的数学模型（一般直接采用被测量的计算公式作为数学模型）。
100100
/V m 0140
.0c V V X 321⨯⨯⨯⨯⨯-=F ）（
式中：X —试样中蛋白质的含量，单位为g/kg ；
V 1—试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为mL ； V 2—试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积，单位mL ； c —盐酸标准滴定溶液浓度，单位mol/L;
0.0140—1.0mL 盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为g ；
m —试样的质量，单位g ；
V 3—吸取消化液的体积，单位为mL ；
F —氮换算为蛋白质的系数，各种食品中氮转换系数见标准附录A ； 100—换算系数。
5.不确定度的来源
样品中蛋白质含量X 的不确定度来源有3个方面：
5.1 重复性测量 5.2 标准溶液
标准物质引入的相对不确定度。
5.3 样品称量
万分级电子天平经北京计量院检定合格，0-50g 最大允许误差为±0.5e 。
凯氏定氮法检测奶粉中蛋白质质量控制及注意事项
凯氏定氮法检测奶粉中蛋白质质量控制及注意事项
凯氏定氮法是一种常用的检测蛋白质含量的方法，也被广泛应用于奶制品行业。在奶粉生产中，蛋白质的含量是影响奶粉品质的重要因素之一。因此，采用凯氏定氮法对奶粉中蛋白质含量进行检测和质量控制非常必要。本文将介绍凯氏定氮法在奶粉中检测蛋白质的应用以及注意事项。
一、凯氏定氮法原理
凯氏定氮法是以蛋白质中的亮氨酸和脯氨酸为基础，通过催化剂作用使蛋白质中的氮原子被氧化成氨，进而转化为氨基氮，再以铜离子为催化剂，将氨基氮还原成亚铜离子。通过比色法或电位滴定法测定亚铜离子的含量，计算出蛋白质含量。该方法具有准确、简单、灵敏等特点，被广泛应用于生物化学、食品科学等领域。
二、凯氏定氮法在奶粉中的应用
1. 样品处理要彻底。奶粉在生产过程中易受到各种污染，应保持样品卫生和细心处理样品。
2. 操作要规范。操作过程中要注意按操作规程处理，仪器设备要经过严格的校准。
3. 标准品的准备要充分。标准品的准备要求较高，必须通过标准品验证后再进行蛋白质含量分析。
4. 良好的实验室管理。合理的实验室布局、管理及仪器设备养护、维护是保持精度可靠性的前提。
5. 实验操作人员要熟练掌握相关技术，具备一定的实验经验和操作技能。
总之，凯氏定氮法是目前奶粉制造工业中广泛采用的一种检测蛋白质含量的方法。在奶粉制造和质量控制中，准确、快速、准确的测定奶粉中蛋白质含量是保证产品质量的一个重要环节。同时，操作规范、维护仪器设备、常规检验、标准品准备以及实验室管理都是确保实验结果准确可靠的必要前提。
怎样知道奶粉中的蛋白质含量
蛋白质测定方法之双缩脲法一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2.器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽
实验三 凯氏定氮法测量奶粉中蛋白质含量
实验三 凯氏定氮法测量奶粉中蛋白质含量
一、实验目的
1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理
2、学会全自动凯氏定氮仪的操作，包括样品的消化处理，蒸馏，滴定以及蛋白质含量的计算等
二、实验原理
蛋白质是含氮的化合物，食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以蛋白质换算系数，得到蛋白质含量。由于食品中除了蛋白质意外还有其它含氮的物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。
三、实验仪器与试剂
1、仪器
消解仪，全自动凯氏定氮仪
2、试剂
浓硫酸，消解片
硼酸（40g/L ），氢氧化钠（350g/L ），蒸馏水
0.01mol/L 盐酸标准溶液，0.1%甲基红乙醇溶液， 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液
奶粉
四、实验步骤
1、样品消化
称取两份奶粉（0.5g ）,加入15mL 浓硫酸和一片消化片根据设定的程序进行消解
2、样品的吸收和蒸馏
消化后的样品冷却后，用全自动凯氏定氮仪进行吸收和蒸馏，馏出液为蓝色或蓝绿色
3、样品滴定
以0.01mol/L 盐酸标准溶液滴定至浅灰色或者淡红色
五、结果计算 10010100
0140.0⨯⨯⨯⨯⨯=F m c V x X 为样品中蛋白质的含量，g/100g; V 为样品滴定消耗盐酸标准溶液体积， mL; c 为盐酸标准溶液浓度，mol/L; 0.014为1.0 mL 盐酸标准滴定溶液滴定溶液相当的氮的质量，g; m 为样
品的质量，F为换算为蛋白质的系数，乳制品为6.38。
六、思考题
1、预习凯氏定氮法测定蛋白质的原理
牛奶中蛋白质含量的测定
牛奶中蛋白质含量的测定
摘要：通过国标牛奶中蛋白质的测定找出它的不足之处，用新的方法进行蛋白质的测定。
关键词：蛋白质测定凯氏定氮法微波消解—凯式定氮法 Bradford法甲醛值滴定法
牛奶是一种营养丰富而全面的理想食品,是人体所需蛋白质的重要来源,蛋白质是牛奶中的主要营养指标。因此，牛奶中蛋白质的测定是一件非常重要的事，也是大家非常关注的事。
用凯氏定氮的方法检测蛋白质含量。
蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法介绍【GB/T 5009.5—1985】
食品中蛋白质的测定方法
本标准适用于各类食品中蛋白质的测定。
1 原理
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2 试剂
所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 40%氢氧化钠溶液。
2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。
3 仪器
定氮蒸馏装置：如图所示。（图略）
4 操作方法
4.1 样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml液体样品(约相当氮30～40mg)，移入干燥的 100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止
测定奶粉中蛋白质的真实含量
凯氏定氮法测奶粉中真实蛋白质的含量
摘要
实验用凯氏定氮法测定奶粉中的蛋白质含量，将硫酸及催化剂与奶粉一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O逸出，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，被硼酸吸收。用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，消耗的盐酸标准液计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。
关键词: 凯氏定氮法蛋白质消化蒸馏
1前言：劣质奶粉的出现严重地损害了人民群众的健康,劣质奶粉的主要特点是蛋白质含量远低于正常值。正是利用氮与蛋白质含量间的关系，实验室测定蛋白质的非直接性，一些不法人士钻了蛋白质中氮的含量。他们利用三聚氰胺含有很高的氮，将三聚氰胺残掺杂近奶粉中以提高奶粉的蛋白质含量。而长期饮用这些蛋白质含量极低的奶粉，首先会导致婴儿严重营养不良，随后会引起各种并发症，在外来细菌的侵袭之下，婴儿几乎完全丧失了自身的免疫能力，病情发展十分迅速，最后婴儿头部严重水肿，几乎看不清五官，全身皮肤也出现了大面积的高度溃烂，伤口长时间无法愈合，最后导致呼吸衰竭而死亡。因此，测定奶粉中蛋白质含量，对掌握其营养价值和品质的变化，保障人体的健康，合理配料，为乳制品深加工提供数据十分重要，此外，蛋白质分解产物对乳制品的色、香、味都有一定的作用，所以测定具有深远意义。
2实验目的
（1）学习凯氏定氮法的测定蛋白质的原理；
（2）掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量的计算等。
3实验原理
各种天然有机物的含氮量通常用微量凯氏定氮法（micro-Kjeldahl method）来测定。当有机含氮化合物与浓硫酸共热消化，氮转化为氨，氨与硫酸结合成硫酸铵。消化产生
乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测
乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测
YLNB 2.8
一、凯氏定氮仪常量检测法
1.原理
样品中加入催化剂和浓硫酸，经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定，根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。
2.试剂
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。
2.1浓硫酸
2.2硫酸钾
2.3硫酸铜
2.4氢氧化钠溶液：400g/L
2.5硼酸溶液：30g/L
2.6甲基红一澳甲酚绿混合指示剂：用体积分数为95%的乙醇，将澳甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用时按1g/L澳甲酚绿：1g/L甲基红为5： 1的比例混合。
2.7硫酸标准溶液：c (H+)=0.1000±0.005mol/L
2.7.1标准溶液的配制：取3ml浓硫酸加到15ml水中，冷却
后洗入1000ml容量瓶中，定容。
2.7.2标准溶液的标定：（见GB/T601-2002 ）
2.7 3硫酸铵：干燥后最低含量99.9%,使用前直接将硫酸铵在102±2℃干燥至少2h，在干燥器中冷却至室温。
3.仪器及器材
3.1凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、蒸馏单元及电位滴定仪
3.2消化管，适用于凯氏定氮仪（3.1）
3.3接收瓶：300ml三角瓶或烧杯
4.方法
4.1样品称取
4.1.1原料奶和纯牛奶样品：称取约5g
4.1.2乳饮料：称取约8g
4.1.3冰淇淋：称取约5g
4.1.4乳粉：称取约0.5g
奶粉中蛋白质含量实验方法
【摘要】目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法使用三氯乙酸沉淀蛋白质后，运用BCA（二喹啉甲酸）法，在570 nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。结果待测溶液中蛋白质浓度在0～250 μg/ml 范围内标准曲线呈线性关系，其回归方程为：Y=301.12X-73.42，相关系数r=0.998，平均回收率为100.2%。结论结合三氯乙酸沉淀的BCA法适用于奶粉中蛋白质的快速检验和掺伪检验。
【关键词】奶粉；蛋白质；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺
A rapid and simple method of protein determination in powdered milk
Zhang Zhiqiao, Shen Guodong, Wang Gang
First Middle School of Hefei, Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University, Hefei 230001
［Abstract］Objective To explore a rapid and simple method of protein determination in powdered milk without other nitrogen-containing compound disturbance in Kjeldahl determination.Methods Conjugated with protein precipitation with trichloroacetic acid, BCA (bicinchoninic acid) method was used. According to the positive relationship of protein content with the 570 nm absorbance, protein content was calculated in powdered milk.Results Protein content in milk solution showed a good linear relationship at the detection ranges of 0-250
奶粉中蛋白质含量测定
双缩脲（NH
3CONHCONH
3
）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得
到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO
4
形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1.试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出
其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H
2
O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO
4•5H
2
O）和6.0克酒石酸钾钠
（KNaC
4H
4
O
6
•4H
2
O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，
用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
分析化学。凯氏定氮法测定奶粉中的蛋白质含量
最初引起人们关注的竟然是美国宠物。2007年3 月份，在取食了来自中国的蛋白粉后，不少宠物 猫狗死亡，更多患上了肾病。美国FDA最终认定 ，是“三聚氰胺”惹的祸。
因此各地工商部门和质检部门都加大了执法力度
？那么，怎么才能知道奶粉是否合格呢，蛋白质含量就 一个最重要的指标。
是其中
当然蛋白质的测定方法很多，如总氮量法，福林—酚试剂法，双 缩脲法，紫外吸收法等。近来已有专用的蛋白质分析仪，
但经典的凯氏定氮法仍是食品，饲料分析，种子鉴定及营养和生 化研究中最广泛应用且具有足够精度的方法。
2
1
5
凯氏烧瓶（100ml）:1个
凯氏定氮装置
10
移液管(10ml): 1支
酸式滴定管(10ml): 1支
4 3
6
9
8
7
1.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子 6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套 9.反应管 10.蒸汽发生瓶
凯氏定氮装置图
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中。
食品中蛋白质的测定
食品安全国家标准
食品中蛋白质的测定
1范围
本标准规定了食品中蛋白质的测定方法㊂
本标准第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定,第三法适用于蛋白质含量在10g/100g 以上的粮食㊁豆类奶粉㊁米粉㊁蛋白质粉等固体试样的测定㊂
本标准不适用于添加无机含氮物质㊁有机非蛋白质含氮物质的食品的测定㊂
第一法凯氏定氮法
2原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵㊂碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量计算氮含量,再乘以换算系数,即为蛋白质的含量㊂
3试剂和材料
3.1试剂
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂
3.1.1硫酸铜(C u S O4㊃5H2O)㊂
3.1.2硫酸钾(K2S O4)㊂
3.1.3硫酸(H2S O4)㊂
3.1.4硼酸(H3B O3)㊂
3.1.5甲基红指示剂(C15H15N3O2)㊂
3.1.6溴甲酚绿指示剂(C21H14B r4O5S)㊂
3.1.7亚甲基蓝指示剂(C16H18C l N3S㊃3H2O)㊂
3.1.8氢氧化钠(N a O H)㊂
3.1.995%乙醇(C2H5OH)㊂
3.2试剂配制
3.2.1硼酸溶液(20g/L):称取20g硼酸,加水溶解后并稀释至1000m L㊂
3.2.2氢氧化钠溶液(400g/L):称取40g氢氧化钠加水溶解后,放冷,并稀释至100m L㊂
3.2.3硫酸标准滴定溶液[c(12H2S O4)]0.0500m o l/L或盐酸标准滴定溶液[c(H C l)]0.0500m o l/L㊂3.2.4甲基红乙醇溶液(1g/L):称取0.1g甲基红,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂3.2.5亚甲基蓝乙醇溶液(1g/L):称取0.1g亚甲基蓝,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂
测定奶粉中蛋白质含量的方法
测定奶粉中蛋白质含量的方法
_
Kjeldahl法
Kjeldahl法是测定奶粉中蛋白质含量的常用方法，它可以用于推算奶中各种活性物质的含量，包括蛋白质、氨基酸、氨基糖和其他氨基化合物。Kjeldahl方法包含三个步骤：水解、蒸馏分离和计量。
1. 水解：将给定的样品加入硝酸溶液中，然后煮沸，用以将蛋白质和氨基化合物水解成氨（NH3），水解温度约为120℃-130℃，然后保温至155℃-160℃使氨完全挥发。
2. 蒸馏分离：将氨挥发到蒸馏管中，再将管子放入HCl溶液中进行蒸馏分离，使氨分子重新溶解在HCl溶液中。然后使用可见光计量显色剂，如日光灯校准计量，最后得到氨水溶液。
3. 计量：将得到的氨水溶液进行titrasiometry计量，这是采用一定的量的碱性溶液子代替氨水溶液的一种计量方法，最后，通过计算可以得到奶中所含蛋白质的含量。
双缩脲测定奶粉中蛋白质的含量
双缩脲法测定奶粉中的蛋白质含量
【摘要】目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法使用双缩脲法测定蛋白质的含量，在540 nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。
【关键词】奶粉；蛋白质；双缩脲法；标准曲线
1【前言】蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，奶粉中蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质定量方法较多, 如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry 法等。虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如2008年9月“问题奶粉”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。为弥补这些不足，本实验利用双缩脲法快速测定奶粉中的蛋白质含量。
2 实验目的
（1）学习从奶粉中提取酪蛋白的原理和方法；
（2）掌握利用双缩脲法对蛋白质含量的测定的原理和方法；
（3）掌握利用分光光度法对物质的定性和定量测定的原理和方法；
3实验原理
3.1奶粉中提取蛋白质的原理
奶粉中主要蛋白质是酪蛋白，每100克婴幼儿奶粉中含12克～25克。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将奶粉用蒸馏水溶解，然后将其PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯酪蛋白。
高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中A1_β-酪蛋白、A2_β-酪蛋白含量
高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白含量
羊 银，张瑞华，刘 莹*
（天津市食品安全检测技术研究院，天津 300308）
摘 要：建立婴幼儿配方乳粉中A1、A2 β-酪蛋白的高效液相色谱-串联质谱测定方法。乳粉经尿素溶液溶解稀释，胰蛋白酶酶解，过膜后利用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱分离，0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈为流动相梯度洗脱，高效液相色谱-串联质谱仪测定。结果表明，A1、A2 β-酪蛋白在0.02～2.00 mg·mL-1线性范围内，相关系数（R2）均≤0.99，检出限为0.05～0.10 g·kg-1；定量限为0.2～0.5 g·kg-1；平均回收率在92.08%～105.29%；平均相对标准偏差为1.5%～7.9%。随机选取了10个品牌的婴幼儿配方乳粉进行测定，得到A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白的含量在0～30.3 g·kg-1。
关键词：婴幼儿配方乳粉；A2 β-酪蛋白；A1 β-酪蛋白；高效液相色谱-串联质谱法
Determination of A1 and A2 β-Casein in Infant Formula Milk Powder by High Performance Liquid Chromatography-
Tandem Mass Spectrometry
YANG Yin, ZHANG Ruihua, LIU Ying*
(Tianjin Institute for Food Safety Inspection Technology, Tianjin 300308, China) Abstract: To establish a method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）to detect A1 and A2 β-casein in infant formula milk powder. The milk powder was dissolved and diluted in urea solution, hydrolyzed with trypsin, and filtered to be determined. The samples were separated on ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) column by water containing 0.1%(by volume) formic acid and methanol containing 0.1%(by volume) formic acid, and determined by HPLC-MS/MS. The results showed that the correlation coefficients (R2) of A1 and A2 β- casein were all greater than 0.99 in the corresponding linear range of 0.02～2.00 mg·mL-1. The limits of detection ranged from 0.05 to 0.10 g·kg-1. The limits of quantitation ranged from 0.2 to 0.5 g·kg-1. Average recovery rate were 92.08%～105.29%, relative standard deviation was 1.5%～7.9%. The contents of A1 β- casein and A2 β- casein ranged from 0 to 30.3 g·kg-1 in 10 brands of infant formula milk powder.
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【摘要】目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法使用三氯乙酸沉淀蛋白质后，运用BCA（二喹啉甲酸）法，在570 nm波长处，分不测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。结果待测溶液中蛋白质浓度在0～250 μg/ml 范围内标准曲线呈线性关系，其回归方程为：Y=301.12X-73.42，相关系数r=0.998，平均回收率为100.2%。结论结合三氯乙酸沉淀的BCA法适用于奶粉中蛋白质的快速检验和掺伪检验。
【关键词】奶粉；蛋白质；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺
A rapid and simple method of protein determination in powdered milk
Zhang Zhiqiao, Shen Guodong, Wang Gang
First Middle School of Hefei, Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University, Hefei 230001
［Abstract］Objective To explore a rapid and simple method of protein determination in powdered milk without other nitrogen-containing compound disturbance in Kjeldahl determination.Methods Conjugated with protein precipitation with trichloroacetic acid, BCA (bicinchoninic acid) method was used. According to the positive relationship of protein content with the 570 nm absorbance, protein content was calculated in powdered milk.Results Protein content in milk solution showed a good linear relationship at the detection ranges of 0-250 μg/ml, with regression equation: Y=301.12X-73.42 and related coefficient: 0.998, and the average recovery rate was 100.2%.Conclusion BCA method conjugated with trichloroacetic acid is adaptable to the rapid and
sensitive determination of protein in powdered milk.
［Key words］Powdered milk; Protein; BCA method; Trichloroacetic acid; Melamine
蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质定量方法较多, 如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry 法等。尽管凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如2008年9月“问题奶粉”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时刻长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。为弥补这些不足，本实验利用BCA（二喹啉甲酸）法结合三氯乙酸沉淀法建立一种快速简便的测定奶粉中蛋白质含量的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
酶标仪（型号ELX800， BIO-TEK INSTRUMENTS公司），96孔微孔板，化学分析滤纸（直径：9 cm，最大孔径：10 μm，杭州新华纸业有限公司），玻璃漏斗、烧杯等。
1.1.2 试剂
光明全脂速溶奶粉（黑龙江省光明松鹤乳品有限责任公司，产地：齐齐哈尔，生产日期：20081010），蒙牛学生多维高钙高锌奶粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，产地：呼和浩特，生产日期：20081207），尿素（分析纯，上海苏懿化学试剂有限公司），三聚氰胺（化学纯，上海凌峰化学试剂有限公司），硝酸铵（分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司），三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），BSA（牛血清清蛋白，美国Sigma公司）BCA试剂盒（PIERCE 公司，BCA23225），去离子水。
1.2 实验方法
1.2.1 方法原理
据资料介绍，BCA法是目前已知的一种敏感准确的蛋白质测试法，广泛用于国内外企业和科研院所进行蛋白质含量检测。其要紧原理是：要分析的蛋白质在碱性溶液里与Cu2+ 反应产生Cu+ ，Cu+与BCA形成一种紫色化合物，其汲取峰在562 nm波长处。BCA法定量分析蛋白质具有准确灵敏（20～2 000 μg/ml）、快速（约40 min）、稳定和经济有用（能够用试管或微孔板测定），以及它是反应物与蛋白质直接作用，对铵盐类等含氮化合物的抗干扰能力较强等特点。
三氯乙酸沉淀蛋白质的要紧原理：三氯乙酸作为蛋白质变性剂可使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水基团，使之聚拢
沉淀。据文献报道，三氯乙酸比硫酸铜等物质能更好地排除非蛋白氮对溶液中蛋白氮的阻碍，具有广泛的适用性。
1.2.2 标准应用曲线的绘制
配制2 mg/ml牛血清清蛋白（BSA）溶液作为标准蛋白质储存液（含有9 g/L 氯化钠），参照BCA试剂盒讲明书所示方法，按表1所示配制不同浓度BSA工作液，用定性滤纸过滤，收集滤液并记录体积，取其中200 μl滤液加入等体积的10%三氯乙酸溶液，充分反应后12 000 r/min离心30 min，吸取上清液待测；以9 g/L 氯化钠溶液为空白对比，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各25 μl加入微孔板上相应的各个微孔中，每孔还加入200 μl A液与B液（10A∶1B）的混合工作液，60℃水浴30 min，用酶标仪在570 nm波长下测定各个微孔中溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白质质量浓度为横坐标，计算标准回归方程并绘制工作曲线。表1 不同浓度BSA工作液的配方（略）
1.2.3 样品制备与测定
准确称量牛奶粉150 mg/份和300 mg/份各4份，分不倒入贴有1、2、3、4、5、6、7、8标签的8个50 ml离心管中，再分不称量20 mg的硝酸铵、三聚氰胺和尿素各2份，按表2示倒入对应的离心管中。加入适量60℃ 9 g/L 氯化钠溶液充分溶解，并用100 ml容量瓶定容至刻度。用定性滤纸过滤，收集滤液并记录体积，取其中200 μl滤液加入等体积的10%三氯乙酸溶液，