奶粉中蛋白质含量实验方法
奶粉中蛋白质含量测定
奶粉中蛋白质含量测定1.前言：在蛋白质研究领域中，用一种快速准确的方法来检测蛋白浓度是必不可少的。
与双缩脲法、紫外吸收法相比，新建立的考马斯亮蓝法在许多情况下已成为定量检测蛋白浓度的首选方法。
同时，与传统的Lowry法相比，该法具备更易操作，更快，更灵敏以及受其它试剂和非蛋白成分干扰较小等优势。
其检测原理是基于染料考马斯蓝G250和蛋白质之间可以形成特异性结合。
详细的研究表明[1]，该染料可以自由存在于四种不同的离子形式中。
相比之下，染料更多的阴离子形式与蛋白质结合且结合后显蓝色，在590 nm左右具有最大吸收。
因此通过测定染料中蓝色离子的量就可以折算出蛋白质的量，这通常可以在595 nm处测定吸光度获得。
2.实验方案及原理：（1）①实验流程：前期原料配备标准曲线绘制样品测定②实验前期准备：Ⅰ、称取奶粉样品，配制成5mg/ml的溶液。
再取0.3ml该溶液于试管，再加入0.7ml去离子水，9ml考马斯亮蓝G-250，配制成奶粉含量为150μg/ml的样品溶液；Ⅱ、配制浓度为0.4mg/ml的标准牛血清蛋白（BSA）溶液,选用五个点绘制标准曲线，这五点BSA溶液体积分别为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8ml，同时相应地加入9ml考马斯亮蓝G-250和水，每份配制成体积为10ml的溶液，即每份含BSA的量为40，80，160，240，320μg。
浓度分别为4，8，16，24，32μg/ml。
配制相同两组，分别记为A组和B组。
如下表：溶液序号0 1 2 3 4 50 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8标准牛血清蛋白（BSA）/ml去离子水/ml 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2考马斯亮蓝9 9 9 9 9 9G-250/ml③做紫外分光光度测试，得每份试剂蛋白质-色素结合物在595nm波长下的最大光吸收A。
因其光吸收值与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质的定量测定；④根据所测数据，通过作图得直线A=aC+d(A为蛋白质-色素结合物在595nm波长下的最大光吸收,C为溶液浓度)。
奶粉中蛋白质含量测量不确定度评定报告
测量不确定度评定报告编制：审核：批准：年月日1目的评定 食品中蛋白质的测定GB 5009.5 第一法 项目测量不确定度，本次实验测定奶粉中蛋白质含量。
2检测过程描述称取充分混匀的固体试样0.2g-2g ，精确至0.001g ，至消化管中，再加入0.4g 硫酸铜、6g 硫酸钾及20mL 硫酸于消化炉进行消化。
当消化炉温度达到420℃之后，继续消化1h ，此时消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却后加入50mL 水，于自动凯氏定氮仪上自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据。
同时测定空白。
3所用仪器设备和标准物质：4数学模型根据检测标准中规定的检测原理，建立被测量的数学模型（一般直接采用被测量的计算公式作为数学模型）。
100100/V m 0140.0c V V X 321⨯⨯⨯⨯⨯-=F ）（式中：X —试样中蛋白质的含量，单位为g/kg ；V 1—试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为mL ； V 2—试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积，单位mL ； c —盐酸标准滴定溶液浓度，单位mol/L;0.0140—1.0mL 盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为g ；m —试样的质量，单位g ；V 3—吸取消化液的体积，单位为mL ；F —氮换算为蛋白质的系数，各种食品中氮转换系数见标准附录A ； 100—换算系数。
5.不确定度的来源样品中蛋白质含量X 的不确定度来源有3个方面：5.1 重复性测量 5.2 标准溶液标准物质引入的相对不确定度。
5.3 样品称量万分级电子天平经北京计量院检定合格，0-50g 最大允许误差为±0.5e 。
5.4 检测设备凯氏定氮仪经中检计量有限公司校准，最大允许误差2%;6 不确定度分量的评定6.1 随机因素对测量结果带来的不确定度分量u r （f r ），评定时进行6次独立测量，算术平均值为 20.1g/100g ，测量重复性导致的标准不确定度评价如下表：奶粉中蛋白质含量测定结果一览表单位g/100g根据贝塞尔公式计算单次测量实验引入的标准差为：2101i ix 1n Y Y )C (--=∑=）（S=0.173测量结果由两次平行测定的算术平均值给出，故其重复性引入的标准不确定度为：2C S u x f r ）（）（==0.122mg/L测量重复性引入的相对标准不确定度为%61.01.20122.0C f u f u x r r r ===）（）（6.2 标准溶液引入相对不确定度u r （C s ）标准溶液浓度引入的相对不确定度u r （C 0）。
凯氏定氮法检测奶粉中蛋白质质量控制及注意事项
凯氏定氮法检测奶粉中蛋白质质量控制及注意事项
凯氏定氮法是一种常用的检测蛋白质含量的方法，也被广泛应用于奶制品行业。
在奶粉生产中，蛋白质的含量是影响奶粉品质的重要因素之一。
因此，采用凯氏定氮法对奶粉中蛋白质含量进行检测和质量控制非常必要。
本文将介绍凯氏定氮法在奶粉中检测蛋白质的应用以及注意事项。
一、凯氏定氮法原理
凯氏定氮法是以蛋白质中的亮氨酸和脯氨酸为基础，通过催化剂作用使蛋白质中的氮原子被氧化成氨，进而转化为氨基氮，再以铜离子为催化剂，将氨基氮还原成亚铜离子。
通过比色法或电位滴定法测定亚铜离子的含量，计算出蛋白质含量。
该方法具有准确、简单、灵敏等特点，被广泛应用于生物化学、食品科学等领域。
二、凯氏定氮法在奶粉中的应用
1. 样品处理要彻底。
奶粉在生产过程中易受到各种污染，应保持样品卫生和细心处理样品。
2. 操作要规范。
操作过程中要注意按操作规程处理，仪器设备要经过严格的校准。
3. 标准品的准备要充分。
标准品的准备要求较高，必须通过标准品验证后再进行蛋白质含量分析。
4. 良好的实验室管理。
合理的实验室布局、管理及仪器设备养护、维护是保持精度可靠性的前提。
5. 实验操作人员要熟练掌握相关技术，具备一定的实验经验和操作技能。
总之，凯氏定氮法是目前奶粉制造工业中广泛采用的一种检测蛋白质含量的方法。
在奶粉制造和质量控制中，准确、快速、准确的测定奶粉中蛋白质含量是保证产品质量的一个重要环节。
同时，操作规范、维护仪器设备、常规检验、标准品准备以及实验室管理都是确保实验结果准确可靠的必要前提。
怎样知道奶粉中的蛋白质含量
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
（3）标准蛋白质溶液:
精确称取结晶牛血清清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。
2.பைடு நூலகம்材
（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
实验三 凯氏定氮法测量奶粉中蛋白质含量
实验三 凯氏定氮法测量奶粉中蛋白质含量一、实验目的1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理2、学会全自动凯氏定氮仪的操作，包括样品的消化处理，蒸馏，滴定以及蛋白质含量的计算等二、实验原理蛋白质是含氮的化合物，食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以蛋白质换算系数，得到蛋白质含量。
由于食品中除了蛋白质意外还有其它含氮的物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。
三、实验仪器与试剂1、仪器消解仪，全自动凯氏定氮仪2、试剂浓硫酸，消解片硼酸（40g/L ），氢氧化钠（350g/L ），蒸馏水0.01mol/L 盐酸标准溶液，0.1%甲基红乙醇溶液， 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液奶粉四、实验步骤1、样品消化称取两份奶粉（0.5g ）,加入15mL 浓硫酸和一片消化片根据设定的程序进行消解2、样品的吸收和蒸馏消化后的样品冷却后，用全自动凯氏定氮仪进行吸收和蒸馏，馏出液为蓝色或蓝绿色3、样品滴定以0.01mol/L 盐酸标准溶液滴定至浅灰色或者淡红色五、结果计算 100101000140.0⨯⨯⨯⨯⨯=F m c V x X 为样品中蛋白质的含量，g/100g; V 为样品滴定消耗盐酸标准溶液体积， mL; c 为盐酸标准溶液浓度，mol/L; 0.014为1.0 mL 盐酸标准滴定溶液滴定溶液相当的氮的质量，g; m 为样品的质量，F为换算为蛋白质的系数，乳制品为6.38。
六、思考题1、预习凯氏定氮法测定蛋白质的原理2、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液，加入量对测定结果有何影响？3、实验过程中，影响准确性的因素有哪些？。
奶粉中蛋白质含量的测定
奶粉中蛋白质含量的测定第一篇嗨，亲爱的朋友们！今天咱们来聊聊奶粉中蛋白质含量的测定这个有趣的话题。
你知道吗？奶粉可是宝宝们成长的重要营养来源，而蛋白质在其中的含量那可是至关重要。
那怎么来测定这个含量呢？这就像是一场小小的科学探秘之旅。
呢，得有专业的实验室和仪器。
那些瓶瓶罐罐和精密的设备，看起来就特别厉害。
然后呢，工作人员会取一些奶粉样品，小心翼翼地处理。
这可不能马虎，一点点的偏差都可能影响结果。
测定的方法也有好几种。
有一种叫凯氏定氮法，听起来是不是有点高大上？其实就是通过一系列的化学反应，把奶粉中的氮转化成可以测量的形式，从而推算出蛋白质的含量。
在测定的过程中，每一个步骤都要精准，就像在完成一件精美的艺术品。
要是出了差错，那可就不好啦。
而且哦，测定蛋白质含量不仅仅是为了知道数字，更是为了保证宝宝们能喝到营养均衡、质量可靠的奶粉。
这可是关系到宝宝们健康成长的大事呢！所以呀，奶粉中蛋白质含量的测定可不是闹着玩的，是一项非常重要又严谨的工作。
第二篇哈喽呀，小伙伴们！咱们今天来扯扯奶粉中蛋白质含量的测定这事儿。
说起奶粉，那可是宝宝们的“口粮”，蛋白质在里面的含量可不能瞎猜。
那到底咋测定呢？想象一下，一群穿着白大褂的科学家，在实验室里忙忙碌碌。
他们先把奶粉拿来，就像对待宝贝一样。
然后开始各种操作，那认真劲儿，就跟在完成一个超级重要的任务。
有一种方法是用化学试剂来反应，看看能产生啥变化。
还有的会用高科技的仪器，一扫描一分析，结果就出来啦。
这测定可不是随便搞搞，得严格按照标准来。
要是不准，宝宝们喝的奶粉营养不够或者太多，那可就麻烦了。
而且呀，这测定还得经常做，不能偷懒。
就像我们要经常体检一样，奶粉也得经常“体检”，保证蛋白质含量一直是合适的。
每次想到那些工作人员为了宝宝们能健康成长，这么认真地测定奶粉中的蛋白质含量，我就觉得特别暖心。
这就是对宝宝们满满的爱呀！怎么样，是不是觉得奶粉中蛋白质含量的测定也挺有意思的？。
婴幼儿配方羊奶粉中乳清蛋白检测方法的研究
婴幼儿配方羊奶粉中乳清蛋白检测方法的研究在研究婴幼儿配方羊奶粉中乳清蛋白检测方法时，可以采用多种分析技术，包括色谱法、免疫测定法、质谱法等。
其中，色谱法被广泛应用于食品中蛋白质的检测与分析。
色谱法主要包括离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法和高效液相色谱法。
离子交换色谱法通过杂交离子交换树脂将含乳清蛋白的样品分离出来，然后通过检测溶液中乳清蛋白的浓度来确定样品中乳清蛋白的含量。
凝胶过滤色谱法则是通过利用凝胶介质的孔径大小将含乳清蛋白的样品分离出来。
高效液相色谱法是通过将样品中的乳清蛋白分子与溶剂中的相互作用力进行分离，常用的检测方法包括标记液相色谱法和直接检测液相色谱法。
另外，免疫测定法也是一种常见的检测乳清蛋白的方法。
免疫测定法主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法和射光分析法。
酶联免疫吸附试验是利用抗体特异性与乳清蛋白结合并之后加入酶标记物进行检测。
免疫荧光法是利用特异性抗体与乳清蛋白结合后，通过荧光素化的分子可以检测到抗原的质量和数量。
射光分析法基于项目特别载体对抗原的超光谱散射的特性的现象进行检测。
免疫测定法具有灵敏、快速、准确等特点，适用于乳清蛋白的高通量检测。
质谱法是一种精确测定样品中化合物的质量的方法，通常通过对样品分子进行分解，然后通过检测分解产物的质量来确定乳清蛋白的含量。
质谱法主要包括质谱的柱前衍生化、分子质谱和质谱成像等技术。
除了以上列举的方法外，还可以结合多种技术进行乳清蛋白的检测。
例如，可以利用核磁共振技术的各种成像方法对样品中的乳清蛋白进行检测，结合质谱技术可以达到更高的灵敏度和精确度。
总结起来，婴幼儿配方羊奶粉中乳清蛋白的检测方法包括色谱法、免疫测定法和质谱法等。
这些方法各具特点，可以根据实际需求选择合适的方法进行乳清蛋白的检测。
值得注意的是，不同方法的适用范围、灵敏度和准确度都有所不同，因此在进行实际应用时需要综合考虑各种因素，选择最合适的方法。
此外，对于婴幼儿配方羊奶粉中乳清蛋白的检测，还需要在保证准确性的同时确保检测方法的快速、简便和经济，以满足工业生产和质检的需要。
乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测
乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测YLNB 2.8一、凯氏定氮仪常量检测法1.原理样品中加入催化剂和浓硫酸，经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。
有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。
将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定，根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。
2.试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。
2.1浓硫酸2.2硫酸钾2.3硫酸铜2.4氢氧化钠溶液：400g/L2.5硼酸溶液：30g/L2.6甲基红一澳甲酚绿混合指示剂：用体积分数为95%的乙醇，将澳甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用时按1g/L澳甲酚绿：1g/L甲基红为5： 1的比例混合。
2.7硫酸标准溶液：c (H+)=0.1000±0.005mol/L2.7.1标准溶液的配制：取3ml浓硫酸加到15ml水中，冷却后洗入1000ml容量瓶中，定容。
2.7.2标准溶液的标定：（见GB/T601-2002 ）2.7 3硫酸铵：干燥后最低含量99.9%,使用前直接将硫酸铵在102±2℃干燥至少2h，在干燥器中冷却至室温。
3.仪器及器材3.1凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、蒸馏单元及电位滴定仪3.2消化管，适用于凯氏定氮仪（3.1）3.3接收瓶：300ml三角瓶或烧杯4.方法4.1样品称取4.1.1原料奶和纯牛奶样品：称取约5g4.1.2乳饮料：称取约8g4.1.3冰淇淋：称取约5g4.1.4乳粉：称取约0.5g4.2测量4.2.1消化4.2.1.1将上述样品称入消化管中，同时称取5g硫酸钾，0.5g 硫酸铜，然后加入15-20ml浓硫酸，将消化管放入消化炉中，将温度旋钮设定在大约6档左右，连接好排气装置并打开开关，开始进行消化，消化30分钟或直到白烟消失后，将消化炉旋钮调节至9档，继续消化直到消化液透明。
奶粉中蛋白质含量实验方法
【摘要】目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。
方法使用三氯乙酸沉淀蛋白质后，运用BCA（二喹啉甲酸）法，在570 nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。
结果待测溶液中蛋白质浓度在0～250 μg/ml 范围内标准曲线呈线性关系，其回归方程为：Y=301.12X-73.42，相关系数r=0.998，平均回收率为100.2%。
结论结合三氯乙酸沉淀的BCA法适用于奶粉中蛋白质的快速检验和掺伪检验。
【关键词】奶粉；蛋白质；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺A rapid and simple method of protein determination in powdered milkZhang Zhiqiao, Shen Guodong, Wang GangFirst Middle School of Hefei, Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University, Hefei 230001［Abstract］Objective To explore a rapid and simple method of protein determination in powdered milk without other nitrogen-containing compound disturbance in Kjeldahl determination.Methods Conjugated with protein precipitation with trichloroacetic acid, BCA (bicinchoninic acid) method was used. According to the positive relationship of protein content with the 570 nm absorbance, protein content was calculated in powdered milk.Results Protein content in milk solution showed a good linear relationship at the detection ranges of 0-250μg/ml, with regression equation: Y=301.12X-73.42 and related coefficient: 0.998, and the average recovery rate was 100.2%.Conclusion BCA method conjugated with trichloroacetic acid is adaptable to the rapid and sensitive determination of protein in powdered milk.［Key words］Powdered milk; Protein; BCA method; Trichloroacetic acid; Melamine蛋白质是人类最重要的营养物质之一。
蛋白质测定-凯氏定氮法
反应室中溶液的颜色
硼酸吸收液的颜色
[注意] ①加NaOH一定要过量，此时溶液生成深蓝色或黑色沉淀
②为防止样液中氨气逸出。一是要水封，二要夹紧废液蝴蝶
夹后再通蒸汽，三要注意接头处有无松漏现象
③ 冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。 吸收液温度不应超过40℃，避免氨气逸出，若超过时 可置于冷水浴中使用。
提高溶液沸点，从而加快有机物分解
浓硫酸 氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2
样品预处理
样品充分混匀
固体试样 0.2~2g 半固体试样 2~5g 液体试样 10~25g
直接消化
样品称量、消化
1.000g奶粉 0.2g硫酸铜 6g硫酸钾 20mL浓硫酸 玻璃珠
轻摇
小火加热炭化 至泡沫完全停止
大火加热 保持瓶中液体微沸
若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶 液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品
及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋 白质含量:
蛋白氮=总氮-非蛋白氮
准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml， 移 取 5ml 消 化 液 进 行 蒸 馏 ， 用 20ml 硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的 蛋白质含量？
实验
奶粉中蛋白质的测定 ——凯氏定氮法
【基础知识】
蛋白质概述
蛋白质是食品营养价值的重要指标，含N是蛋白质区 别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量
接近，一般来说，pro的平均含氮量为16%，即一份 氮相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。
注意：
不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、 青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大 豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、 燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳及其 制品为6.38。
测定奶粉中蛋白质含量的方法
测定奶粉中蛋白质含量的方法
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Kjeldahl法
Kjeldahl法是测定奶粉中蛋白质含量的常用方法，它可以用于推算奶中各种活性物质的含量，包括蛋白质、氨基酸、氨基糖和其他氨基化合物。
Kjeldahl方法包含三个步骤：水解、蒸馏分离和计量。
1. 水解：将给定的样品加入硝酸溶液中，然后煮沸，用以将蛋白质和氨基化合物水解成氨（NH3），水解温度约为120℃-130℃，然后保温至155℃-160℃使氨完全挥发。
2. 蒸馏分离：将氨挥发到蒸馏管中，再将管子放入HCl溶液中进行蒸馏分离，使氨分子重新溶解在HCl溶液中。
然后使用可见光计量显色剂，如日光灯校准计量，最后得到氨水溶液。
3. 计量：将得到的氨水溶液进行titrasiometry计量，这是采用一定的量的碱性溶液子代替氨水溶液的一种计量方法，最后，通过计算可以得到奶中所含蛋白质的含量。
蛋白质测定-凯氏定氮法
精品课件
准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml， 移 取 5ml 消 化 液 进 行 蒸 馏 ， 用 20ml 硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的 蛋白质含量？
试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消 化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？
精品Байду номын сангаас件
凯氏定氮蒸馏装置
传统装置
1：电炉 2：水蒸气发生器 3：螺旋夹 4：小玻杯及棒状玻塞 5：反应室 6：反应室外层 7：橡皮管及螺旋夹 8：冷凝管 9：蒸馏液接收瓶
精品课件
水蒸气发生器： 装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇
指示剂数滴及硫酸数ml，使水呈微红色（保持酸性 以防水中氨的逸出）→按上图所示搭好装置
精品课件
凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的 测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉 以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为 粗蛋白质含量。
若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶 液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品
及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋 白质含量:
实验 奶粉中蛋白质的测定
——凯氏定氮法
精品课件
【基础知识】
蛋白质概述
蛋白质是食品营养价值的重要指标，含N是蛋白质区 别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量 接近，一般来说，pro的平均含氮量为16%，即一份氮 相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。
注意： 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、 青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大 豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、 燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳及其 制品为6.38。
高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中A1_β-酪蛋白、A2_β-酪蛋白含量
高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白含量羊 银，张瑞华，刘 莹*（天津市食品安全检测技术研究院，天津 300308）摘 要：建立婴幼儿配方乳粉中A1、A2 β-酪蛋白的高效液相色谱-串联质谱测定方法。
乳粉经尿素溶液溶解稀释，胰蛋白酶酶解，过膜后利用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱分离，0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈为流动相梯度洗脱，高效液相色谱-串联质谱仪测定。
结果表明，A1、A2 β-酪蛋白在0.02～2.00 mg·mL-1线性范围内，相关系数（R2）均≤0.99，检出限为0.05～0.10 g·kg-1；定量限为0.2～0.5 g·kg-1；平均回收率在92.08%～105.29%；平均相对标准偏差为1.5%～7.9%。
随机选取了10个品牌的婴幼儿配方乳粉进行测定，得到A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白的含量在0～30.3 g·kg-1。
关键词：婴幼儿配方乳粉；A2 β-酪蛋白；A1 β-酪蛋白；高效液相色谱-串联质谱法Determination of A1 and A2 β-Casein in Infant Formula Milk Powder by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryYANG Yin, ZHANG Ruihua, LIU Ying*(Tianjin Institute for Food Safety Inspection Technology, Tianjin 300308, China) Abstract: To establish a method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）to detect A1 and A2 β-casein in infant formula milk powder. The milk powder was dissolved and diluted in urea solution, hydrolyzed with trypsin, and filtered to be determined. The samples were separated on ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) column by water containing 0.1%(by volume) formic acid and methanol containing 0.1%(by volume) formic acid, and determined by HPLC-MS/MS. The results showed that the correlation coefficients (R2) of A1 and A2 β- casein were all greater than 0.99 in the corresponding linear range of 0.02～2.00 mg·mL-1. The limits of detection ranged from 0.05 to 0.10 g·kg-1. The limits of quantitation ranged from 0.2 to 0.5 g·kg-1. Average recovery rate were 92.08%～105.29%, relative standard deviation was 1.5%～7.9%. The contents of A1 β- casein and A2 β- casein ranged from 0 to 30.3 g·kg-1 in 10 brands of infant formula milk powder.Keywords: infant formula milk powder; A2 β-casein; A1 β-casein; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry酪蛋白是广泛存在于牛乳、羊乳及人乳等乳及其制品中的一类蛋白质，是由多种不同的氨基酸组成的多肽链，具有抗菌、免疫调节、营养供给等多种生物活性。
奶粉中蛋白质含量检测方法
奶粉中蛋白质含量检测方法
奶粉中蛋白质含量的检测方法有以下几种：
1. Kjeldahl法：这是一种传统的蛋白质含量检测方法。
该方法会将样品中的蛋白质分解成氨基酸，然后使用硫酸、碱、催化剂等试剂进行反应，最终通过测定样品中氨基酸所含的氮量来计算蛋白质含量。
2. Lowry法：这种方法利用蛋白质与铜离子的反应生成紫色产物，通过测定产物的吸光度来确
定蛋白质的含量。
3. 氨基酸分析法：该方法通过分析样品中各种氨基酸的含量，从而计算出蛋白质的含量。
这种方法通常使用高效液相色谱法（HPLC）或气相色谱法（GC）来分析氨基酸。
4. 生物学方法：通过测定样品中的生物可利用氮（BUN，Biological Available Nitrogen）来估
算蛋白质含量。
生物学方法通常使用二水脲酶法或铵离子法。
需要注意的是，不同的方法在样品处理、试剂选择、操作步骤等方面可能有所差异，因此在实际应用中需要根据实验室设备和条件选择合适的方法。
另外，为了提高检测的准确性和可靠性，常常需要结合多个方法来进行检测和验证。
奶粉中蛋白质的测定
双缩脲法测定奶粉中蛋白质的含量摘要测定奶粉中蛋白质含量可用双缩脲法，蛋白质含有两个以上的肽键，在强碱条件下，肽键（—CO—NH—）的质子被解离，二价的铜离子和失去质子的多肽链的氮原子相结合产生稳定的紫色络合物，在540~560nm处测定其光吸收值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。
可用来定量测定蛋白质含量，测定范围1~10mg蛋白质。
二价的铜离子与除精氨酸以外的所有氨基酸和二肽均不发生反应，仅和1-亚氨基缩脲、2—亚氨基缩脲、丙二酰胺等少数几种物质有颜色反应，所以基本上可以认为这是蛋白质的特有反应。
②双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。
关键词：双缩脲蛋白质含量奶粉1.前言近年来奶粉质量问题在社会上掀起了很大的风浪，作为一名普通的消费者，我们可学习一些实用的方法去了解判断奶粉的质量问题，所以本实验会详细介绍了一种简单快速的测定奶粉中蛋白质含量的方法。
蛋白质的含量测定是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
测定蛋白质总量的常用方法有4种：凯氏定氮法、双缩脲法、folin-酚试剂法（lowry）、紫外吸收法。
双缩脲法是最简单快速的方法，且不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，该方法在一定程度上还是具有很大的实用意义的。
本实验用分光光度计能测定范围内减少样品中蛋白质含量的梯度，增加实验组以提高实验的灵敏度差，同时也用离心机和半透膜等技术减少在操作过程中蛋白质的损失和金属离子的影响。
2.实验目的学习和掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计和离心机的使用和操作。
3.实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3)是个两分子脲径180（左右加热），放出一个分子氨后得到产物。
在强碱性溶液中双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键或能过一个中间碳原子相连的肽键这类化合物都有双缩脲反应。
紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量
紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量一、本文概述本文旨在探讨紫外分光光度法在快速测定液体奶和奶粉中蛋白质含量方面的应用。
紫外分光光度法是一种基于物质对紫外光的吸收特性进行定量分析的方法，具有操作简便、快速准确、适用范围广等优点，因此在食品营养成分分析中得到了广泛应用。
本文将详细介绍紫外分光光度法的基本原理、实验步骤及注意事项，并通过实例分析验证该方法在液体奶和奶粉中蛋白质含量测定中的准确性和可靠性。
本文还将讨论该方法相较于传统蛋白质测定方法的优势，以及在实际应用中的潜力和局限性。
通过本文的研究，旨在为液体奶和奶粉生产的质量控制、食品安全监管以及营养学研究提供有力支持。
二、紫外分光光度法原理紫外分光光度法是一种基于物质在紫外光区（通常指波长范围在200-400纳米）对光的吸收性质进行分析的方法。
在液体奶和奶粉中蛋白质含量的测定中，该方法主要利用蛋白质分子中的芳香族氨基酸（如色氨酸和酪氨酸）以及某些特定的肽键在紫外光区具有吸收峰的特性。
当紫外光通过这些含有蛋白质的样品时，部分光能被蛋白质分子吸收，导致光的强度减弱。
根据朗伯-比尔定律，光强度的减少与样品中蛋白质的浓度成正比。
因此，通过测量紫外光通过样品前后的强度变化，可以计算出样品中蛋白质的浓度。
在紫外分光光度法中，常用的波长通常为280纳米，因为这是大多数蛋白质在紫外光区的主要吸收峰。
为了消除其他可能干扰测定的物质（如核酸）的影响，通常还会使用多个波长（如260纳米）进行校正。
通过比较不同波长下的吸光度值，可以更加准确地计算出蛋白质含量。
紫外分光光度法具有快速、简便、灵敏度高和成本较低等优点，因此在食品工业中得到了广泛应用。
然而，需要注意的是，该方法只能提供蛋白质总量的信息，无法区分不同种类的蛋白质。
对于含有较多非蛋白质成分或具有特殊光学性质的样品，可能需要采用其他方法进行蛋白质含量的测定。
三、实验材料与方法本实验采用紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中的蛋白质含量。
紫外分光光度法快速测定液体奶_奶粉中蛋白质含量_田志梅
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【化学测定方法 】
紫外分光光度法快速测定液体奶 、奶粉中蛋白质含量
田志梅 , 张永顺
(河北省衡水市疾病预防控制中心 , 河北 衡水 053000)
菌乳 (纯牛奶 )、含乳饮料等三种样品 做方法加 标回收试验 , 结 果见表 2。
表 2 方法的加标回收率
样 品名 称
本底值蛋白质含量 加入量 实测结果 回收率
(mg/ml)
(mg/ml) (mg/ml) (%)
1‰奶粉 稀释 液
0.35
0.40
0.72
96.0
1%灭菌 乳
0.34
0.40
0.77 104.1
溶解后 , 置于 1 L容量瓶中 , 加入 9 g/L氯化钠溶液至刻度 , 混
匀 。 再从中吸取 10.00 ml样品溶液于 100 ml容量瓶 中 , 加入
9 g/L氯化钠溶液至刻度 , 微波振荡 5 min, 混匀 。 用定性滤纸
过滤 , 弃去初滤液 30 ml, 收集 滤液 备用 。 用 9 g/L氯化 钠溶
液做空白调零 , 在 280 nm波长处 , 用 1 cm石英比 色皿测得吸
光度值 。 记录乳样 的吸 光度 值 , 从工 作曲 线上 查出 或用 计算
标准回归方程计算出 测定样品溶液中蛋白质含量 C。
1.2.3 分析结果的 表述 与计算 样 品中蛋 白质 的含 量 X按
式 (1)计算 : X=10C· F
全脂奶粉
34.96
≥34
35.25
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【摘要】目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。
方法使用三氯乙酸沉淀蛋白质后，运用BCA（二喹啉甲酸）法，在570 nm波长处，分不测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。
结果待测溶液中蛋白质浓度在0～250 μg/ml 范围内标准曲线呈线性关系，其回归方程为：Y=301.12X-73.42，相关系数r=0.998，平均回收率为100.2%。
结论结合三氯乙酸沉淀的BCA法适用于奶粉中蛋白质的快速检验和掺伪检验。
【关键词】奶粉；蛋白质；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺A rapid and simple method of protein determination in powdered milkZhang Zhiqiao, Shen Guodong, Wang GangFirst Middle School of Hefei, Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University, Hefei 230001［Abstract］Objective To explore a rapid and simple method of protein determination in powdered milk without other nitrogen-containing compound disturbance in Kjeldahl determination.Methods Conjugated with protein precipitation with trichloroacetic acid, BCA (bicinchoninic acid) method was used. According to the positive relationship of protein content with the 570 nm absorbance, protein content was calculated in powdered milk.Results Protein content in milk solution showed a good linear relationship at the detection ranges of 0-250 μg/ml, with regression equation: Y=301.12X-73.42 and related coefficient: 0.998, and the average recovery rate was 100.2%.Conclusion BCA method conjugated with trichloroacetic acid is adaptable to the rapid andsensitive determination of protein in powdered milk.［Key words］Powdered milk; Protein; BCA method; Trichloroacetic acid; Melamine蛋白质是人类最重要的营养物质之一。
因此，蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。
目前蛋白质定量方法较多, 如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry 法等。
尽管凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰（如2008年9月“问题奶粉”的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高）；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时刻长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。
为弥补这些不足，本实验利用BCA（二喹啉甲酸）法结合三氯乙酸沉淀法建立一种快速简便的测定奶粉中蛋白质含量的方法。
1 材料与方法1.1 仪器与试剂1.1.1 仪器酶标仪（型号ELX800， BIO-TEK INSTRUMENTS公司），96孔微孔板，化学分析滤纸（直径：9 cm，最大孔径：10 μm，杭州新华纸业有限公司），玻璃漏斗、烧杯等。
1.1.2 试剂光明全脂速溶奶粉（黑龙江省光明松鹤乳品有限责任公司，产地：齐齐哈尔，生产日期：20081010），蒙牛学生多维高钙高锌奶粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，产地：呼和浩特，生产日期：20081207），尿素（分析纯，上海苏懿化学试剂有限公司），三聚氰胺（化学纯，上海凌峰化学试剂有限公司），硝酸铵（分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司），三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），BSA（牛血清清蛋白，美国Sigma公司）BCA试剂盒（PIERCE 公司，BCA23225），去离子水。
1.2 实验方法1.2.1 方法原理据资料介绍，BCA法是目前已知的一种敏感准确的蛋白质测试法，广泛用于国内外企业和科研院所进行蛋白质含量检测。
其要紧原理是：要分析的蛋白质在碱性溶液里与Cu2+ 反应产生Cu+ ，Cu+与BCA形成一种紫色化合物，其汲取峰在562 nm波长处。
BCA法定量分析蛋白质具有准确灵敏（20～2 000 μg/ml）、快速（约40 min）、稳定和经济有用（能够用试管或微孔板测定），以及它是反应物与蛋白质直接作用，对铵盐类等含氮化合物的抗干扰能力较强等特点。
三氯乙酸沉淀蛋白质的要紧原理：三氯乙酸作为蛋白质变性剂可使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水基团，使之聚拢沉淀。
据文献报道，三氯乙酸比硫酸铜等物质能更好地排除非蛋白氮对溶液中蛋白氮的阻碍，具有广泛的适用性。
1.2.2 标准应用曲线的绘制配制2 mg/ml牛血清清蛋白（BSA）溶液作为标准蛋白质储存液（含有9 g/L 氯化钠），参照BCA试剂盒讲明书所示方法，按表1所示配制不同浓度BSA工作液，用定性滤纸过滤，收集滤液并记录体积，取其中200 μl滤液加入等体积的10%三氯乙酸溶液，充分反应后12 000 r/min离心30 min，吸取上清液待测；以9 g/L 氯化钠溶液为空白对比，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各25 μl加入微孔板上相应的各个微孔中，每孔还加入200 μl A液与B液（10A∶1B）的混合工作液，60℃水浴30 min，用酶标仪在570 nm波长下测定各个微孔中溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白质质量浓度为横坐标，计算标准回归方程并绘制工作曲线。
表1 不同浓度BSA工作液的配方（略）1.2.3 样品制备与测定准确称量牛奶粉150 mg/份和300 mg/份各4份，分不倒入贴有1、2、3、4、5、6、7、8标签的8个50 ml离心管中，再分不称量20 mg的硝酸铵、三聚氰胺和尿素各2份，按表2示倒入对应的离心管中。
加入适量60℃ 9 g/L 氯化钠溶液充分溶解，并用100 ml容量瓶定容至刻度。
用定性滤纸过滤，收集滤液并记录体积，取其中200 μl滤液加入等体积的10%三氯乙酸溶液，充分反应后12 000 r/min离心30 min，吸取上清液待测；以9 g/L 氯化钠溶液为空白对比，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各25 μl加入微孔板上相应的各个微孔中，每孔还加入200 μl AB（10A∶1B）混合液，60℃水浴30 min，用酶标仪在570 nm 波长下测定各个微孔中溶液的吸光度，从标准工作曲线上查出对应的蛋白质浓度。
表2 待测样品组成（略）1.2.4 分析结果的表述与计算样品中蛋白质的含量X按式(1)计算：X=10C·F (1)，式中：X-样品中蛋白质的含量，g/100 ml(g)，C-测定样品溶液中蛋白质含量（mg/ml），F-稀释倍数。
1.2.5 同意差同一样品的两次测定结果之差，不得超过平均值的51%。
2 结果2.1 标准工作曲线及线性范围以BSA各级工作液的蛋白质浓度（Y，μgmoL-1）对其OD值（X）作图，结果表明蛋白质浓度在0～250 μg/ml范围内标准工作曲线呈线性关系，标准曲线方程：Y=301.12X-73.42，相关系数r=0.998。
见附图。
附图蛋白质含量测定的标准曲线2.2 样品测定中干扰因素的阻碍取上述添加了不同干扰物质的样品，按上述实验方法进行操作，结果发觉，在60℃的水中三聚氰胺等添加物质都能充分溶解，只是过滤速度表现不一样：添加了三聚氰胺的奶粉溶液过滤速度最快（3号和7号管分不用时为19 min和21 min），添加了尿素的奶粉溶液次之（4号和8号管分不用时为79 min和92 min），添加了硝酸铵的奶粉溶液最慢（2号和6号管分不用时为112 min和124 min）。
分不收集滤液和三氯乙酸沉淀后的上清液进行BCA法检测蛋白质含量，测得各项实验数据如表3。
结果发觉三种不同的非蛋白质的含氮化合物差不多不阻碍蛋白质含量的正确测定：质量150 mg的奶粉添加三种含氮化合物后平均蛋白质含量为35.72 mg，标准方差为1.38 mg；质量300 mg的奶粉添加三种含氮化合物后平均蛋白质含量为62.13 mg，标准方差为1.43 mg；分不与空白对比的34.96 mg和65.56 mg，以及厂家奶粉中蛋白质标示量36 mg和72 mg相比，二者差异都不明显。
同时实验结果也表明本实验所用奶粉的蛋白质含量达到国家要求（我国《食品营养标签治理规范》的技术附件中规定，关于蛋白质和碳水化合物，其同意的误差范围是≥80%标示值）。
表3 不同样品蛋白质含量测定（略）2.3 方法的加标回收率分不取奶粉1（光明全脂速溶奶粉，其稀释液为稀释液1）和奶粉2（蒙牛学生多维高钙高锌奶粉，其稀释液为稀释液2）加入60℃ 9 g/L 氯化钠溶液进行1/1 000样品稀释，做方法加标回收试验，结果见表4，该方法的平均加标回收率为100.2%。
表4 方法的加标回收率3 讨论奶粉中蛋白质含量是奶粉检验工作的一项重要指标。
目前国内要紧采纳常规凯氏定氮法，国外也多采纳常规或改良的凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量，但此法费时、费水、费电，操作繁琐，试剂消耗量大，且不能有效区分非蛋白氮［2、3］。
常见的含氮化合物如硝酸铵和尿素比牛奶蛋白质的含氮率都高，易溶于水，专门容易掺入奶粉等食物中；而三聚氰胺尽管常和气冷水状况下在水中的溶解度特不低［4］，然而人们平常适应上和奶粉讲明书上都要求用温开水冲调，例如60℃时三聚氰胺在100 g水中能够溶解1.8 g，100℃时溶解6.4 g，因而掺伪问题容易受到人们的忽视。
国内已有多篇文献涉及有关乳制品中蛋白质含量测定方法的研究，例如，云南工业大学张惠芬等探讨了在奶粉、豆奶粉、鱼粉中人为掺入尿素、硫酸铵等含氮化合物对蛋白质测定的阻碍，结果表明：用95%乙醇能专门好地将尿素与食品中蛋白进行分离，回收率较高，并能方便、快速测定掺入量。