大肠杆菌感受态
大肠杆菌感受态细胞的转化方法
一、概述大肠杆菌是一种常见的微生物细菌，广泛存在于自然界中。
而大肠杆菌感受态细胞的转化方法，是一项重要的研究课题。
本文旨在探讨大肠杆菌感受态细胞的转化方法，以期为相关领域的学者和研究人员提供参考。
二、大肠杆菌感受态细胞的定义大肠杆菌感受态细胞是指能够接受外源DNA并进行转化的大肠杆菌细胞。
在细菌转化的过程中，外源DNA能够通过不同的方式导入大肠杆菌感受态细胞内，并且在某种条件下，使其获得新的遗传信息，从而表现出与原有菌株不同的性状。
三、大肠杆菌感受态细胞的转化方法1. 热激转化方法热激转化方法是将需要转化的大肠杆菌细胞与外源DNA在高温条件下共培养，利用高温使大肠杆菌细胞的细胞壁变得松弛，使外源DNA能够顺利进入细胞内。
然后在低温下将其复性，并引起DNA与细胞的内合作用，最终实现外源DNA的转化。
2. 电穿孔法电穿孔法是通过将大肠杆菌感受态细胞暴露在高电场中，在电场作用力下使细胞膜发生孔道破裂，从而使外源DNA顺利进入细胞内，实现转化。
3. 化学法化学法是使用化学物质（如钙离子、聚乙二醇等）处理大肠杆菌感受态细胞，使细胞膜通透性提高，从而使外源DNA得以顺利进入细胞内，实现转化。
4. 冷冻法冷冻法是将需要转化的大肠杆菌感受态细胞与外源DNA共同置于冰冻条件下进行培养，利用冰冻条件下细胞膜通透性增加，使外源DNA能够进入细胞内，最终实现转化。
5. 基因枪法基因枪法是利用基因枪将外源DNA通过高速微粒轰击的方式，直接送入大肠杆菌感受态细胞内，从而实现转化。
6. 瞬时脉冲法瞬时脉冲法是利用高压脉冲将外源DNA导入大肠杆菌感受态细胞内，通过瞬时压力使细胞膜通透性增加，从而使外源DNA能够进入细胞内，实现转化。
四、大肠杆菌感受态细胞的转化效率影响因素1. 外源DNA的浓度外源DNA的浓度对大肠杆菌感受态细胞的转化效率有重要影响。
过高或者过低的外源DNA浓度都会降低转化效率。
2. 细胞状态大肠杆菌感受态细胞的生长状态和健康程度对转化效率有直接影响。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
1、感受态细胞的概念所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
大肠杆菌感受态的制备注意事项
大肠杆菌感受态的制备注意事项一、前言大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
其感受态的制备是研究大肠杆菌生长和代谢机制的重要手段之一。
本文将从实验室条件、培养基、细胞处理等方面详细介绍大肠杆菌感受态的制备注意事项。
二、实验室条件1. 实验室应保持干净整洁，避免灰尘和异味影响实验结果。
2. 实验室应保持适宜的温度和湿度，避免过高或过低的环境温度对实验产生影响。
3. 实验室应定期消毒，确保操作台面、仪器设备等无菌。
三、培养基1. 选择合适的培养基是制备大肠杆菌感受态的关键。
常用的培养基有Luria-Bertani（LB）培养基、M9盐基培养基等。
根据实验需要选择适当的培养基。
2. 培养基应在使用前进行严格无菌处理，避免污染影响实验结果。
3. 培养基pH值应控制在合适的范围内，一般为7.0-7.5。
4. 培养基中添加的各种营养物质应按照实验要求精确称量，避免误差对实验结果产生影响。
四、细胞处理1. 大肠杆菌应在对数生长期进行处理，通常为OD600=0.6-0.8。
2. 细胞应在无菌条件下进行采集和洗涤，避免污染影响实验结果。
3. 细胞应在适当的温度下进行处理，一般为37℃。
4. 细胞处理过程中应注意避光，避免光照对实验结果产生影响。
五、感受态制备1. 感受态制备前应将培养基和细胞等物品预先冷藏或冰冻，以保证制备过程中温度控制的准确性。
2. 制备感受态前应先将培养基预热至37℃，并加入相应浓度的感受态诱导剂（如IPTG）。
3. 加入诱导剂后，将细胞转移到含有诱导剂的培养基中，并在适当温度下孵育一定时间（通常为2-4小时）。
4. 制备过程中应注意避光，避免光照对实验结果产生影响。
5. 制备完成后应及时取样，避免长时间放置影响实验结果。
六、结论以上是大肠杆菌感受态制备的注意事项。
在实验过程中，我们应该严格按照要求进行操作，保证实验结果的准确性和可靠性。
同时，在实验室管理方面也要加强管理，保证实验室环境的卫生和安全。
感受态的验证
大肠杆菌感受态的验证方法：一般，大肠杆菌感受态做好，我们会思考两个问题：1.有没有污染?2.得率如何?我所在的实验室验证方法如下：阳性验证：一般公司买的连接试剂盒里面，会有阳性对照样品质粒和目的片段。
感受态做好后，用以上样品做一下连接及转化，在LB+羧苄平板上后长出单菌落，挑取单菌落时要注意在平板上分散开挑取5个就好，然后做一个菌液PCR。
PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，加Marker 的同时，别忘了把质粒和目的片段也跑上。
如果条带大小正确就可以认为得率OK。
得率=(条带大小正确的/5)x100%阴性验证：直接把做好的感受态涂布在LB+羧苄的平板上。
若平板上什么都没有长出来，就可以说没有被污染。
12345678910111213141512345、失望，有时候也是一种幸福，因为有所期待所以才会失望。
因为有爱，才会有期待，所以纵使失望，也是一种幸福，虽然这种幸福有点痛6、于千万人之中，遇见你要遇见的人。
于千万年之中，时间无涯的荒野里，没有早一步，也没有迟一步，遇上了也只能轻轻地说一句：”哦，你也在这里吗？“7、我们再也回不去了！8、如果情感和岁月也能轻轻撕碎，扔到海中，那么，我愿意从此就在海底沉默。
你的言语，我爱听，却不懂得，我的沉默，你愿见，却不明白。
9、你问我爱你值比值得，其实你应该知道，爱就是不问值不值得。
10、我喜欢钱，因为我没吃过钱的苦，不知道钱的坏处，只知道钱的好处。
11、能够爱一个人爱到问他拿零用钱的程度，都是严格的考验。
12、对于不会说话的人，衣服是一种语言，随身带着的是袖珍戏剧。
13、要做的事情总找得出时间和机会；不要做的事情总找的出藉口。
14、如果你不调戏女人，她说你不是一个男人；如果你调戏她，她说你不是一个上等人。
15、回忆永远是惆怅。
愉快的使人觉得：可惜已经完了，不愉快的想起来还是伤心。
16、一个知己就好象一面镜子，反映出我们天性中最优美的部分。
17、替别人做点事，又有点怨，活着才有意思，否则太空虚了。
大肠杆菌感受态细胞制备和转化
DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于
细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收
DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温
一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如
卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物
涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，
即可获得细菌菌落。
④ 涂平板: 将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含
Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基
吸收后，37℃倒置培养皿培养12~18h。 2
20008
分 子实
1
生验
0
物
学
注意：
1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的 LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入 Kana储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后到 平板；
细胞膜的通透性发生暂时性改变, 成为能允许外源 DNA
分子进入的细胞, 称感受态细胞。
2
20008
1
0
分 子实 生验
物 学
转化
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入 受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
2
20008
实验九，十
大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化
一.实验原理
1.概念 感受态细胞
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移
到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种
转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另
一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,
需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后,
大肠杆菌感受态制备及转化
大肠杆菌感受态制备及转化大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，常见于土壤、水体、人和动物的肠道等地方。
由于其易于培养和操作，成为生物学研究中常用的实验材料。
本文将介绍大肠杆菌的感受态制备及转化的过程。
感受态制备是指将大肠杆菌细胞从冻存状态恢复到活跃状态的过程。
为了保证感受态制备的成功，首先需要准备培养基和细菌菌种。
常用的培养基有LB培养基和SOC培养基，其中LB培养基适用于大肠杆菌的一般培养，SOC培养基则适用于感受态制备和转化实验。
培养基的配制需按照实验要求进行，注意消毒措施，避免污染。
感受态制备的过程一般包括以下几个步骤。
首先，将冻存的大肠杆菌菌种转移到预先加热的LB培养基中，进行孵育培养。
培养温度和时间根据实验需要进行调整，通常为37摄氏度下培养12-16小时。
其次，将培养物进行稀释，使其浓度适合后续实验操作。
最后，将稀释后的细菌液进行离心，去除上清液，沉淀后的菌体即为感受态大肠杆菌。
感受态大肠杆菌的转化是指将外源DNA导入到大肠杆菌细胞中的过程。
转化的前提是大肠杆菌细胞处于感受态，即细胞膜对外源DNA具有较高的通透性。
转化的关键是选择合适的质粒载体和转化方法。
常用的质粒载体有pUC19、pGEM-T等，这些载体具有含有抗生素抗性基因的特点，可以通过抗生素的选择来筛选转化成功的细菌。
质粒载体通常通过限制酶切与外源DNA进行连接，形成重组质粒。
将重组质粒与感受态大肠杆菌进行转化后，通过培养在含有抗生素的培养基上筛选，即可得到含有目标基因的转化菌落。
转化的方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
热激法是将感受态大肠杆菌与重组质粒混合后，在高温条件下进行短暂的热冲击，使细菌细胞膜通透性增加，促进外源DNA的摄入。
电穿孔法是利用电场作用使细菌细胞膜产生孔隙，使外源DNA通过孔隙进入细胞。
化学法则是利用化学试剂改变细菌细胞膜的性质，增加其对外源DNA的吸收能力。
转化后的菌落需要进行筛选，常用的方法是通过抗生素选择。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备原理：大肠杆菌自然条件下极难进行转化，其关键原因是转化因子吸收较为困难。
在转化试验中，通常先采取人工方法制备感受态细胞，代表性方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现多种蛋白质和酶，负责供体DNA结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接收外来DNA分子受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞转化：①在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促进细胞外膜和内膜间隙中部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能和加入DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现很多间隙，为DNA分子提供了进入细胞通道。
一、受体菌培养从LB平板上挑取新活化E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50百分比接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷0.05mol/LCaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油0.05mol/LCaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl小份,贮存于-80℃可保留半年。
大肠杆菌感受态过程中注意事项：1、细菌生长状态：不要用经过数次转接或储于4℃培养菌，最好从-80℃甘油保留菌种中直接转接用于制备感受态细胞菌液。
大肠杆菌感受态的制备
大肠杆菌感受态的制备
标题：大肠杆菌感受态的制备
正文：
大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道菌群中的细菌，对于人类和动物的健康具有重要意义。
为了研究大肠杆菌的感受态及其在生物学过程中的作用，制备大肠杆菌的感受态成为了研究的重要一环。
首先，制备大肠杆菌感受态需要选择合适的培养基。
一般情况下，以富含营养物质的LB培养基作为基础培养基，通过添加适量的抗生素和其他所需的营养物质来促进感受态的形成。
此外，培养基的pH 值和温度也需要控制在适宜的范围内。
其次，制备大肠杆菌感受态需要在培养过程中引入外部刺激物，如温度变化、pH变化、营养限制等。
这些刺激物能够激活大肠杆菌的感受态，并促进其进一步的生长和适应环境。
在实验室中，可以通过改变培养条件来制备大肠杆菌的感受态。
例如，在培养基中添加一定浓度的抗生素，使得大肠杆菌进入感受态，以适应抗生素的压力。
此外，通过改变培养基的pH值和温度，也可以引发大肠杆菌的感受态。
需要注意的是，在制备大肠杆菌感受态的过程中，不得涉及版权等侵权争议。
所有实验数据和研究结果应遵守学术道德规范，并确保实验过程的透明和可重复性。
总之，制备大肠杆菌感受态是一个重要的研究方向，对于理解大肠杆菌的适应性和生物学过程具有重要意义。
在制备过程中，需要注意选择合适的培养基，引入适当的刺激物，并遵守学术道德规范，确保研究结果的可信性和可重复性。
制备大肠杆菌感受态细胞的原理
制备大肠杆菌感受态细胞的原理嘿，朋友们！今天咱来唠唠制备大肠杆菌感受态细胞的那些事儿。
你想想啊，这大肠杆菌就好比是个小调皮，平时大大咧咧的，可咱得想办法让它变得乖乖的，好接受咱给它的新东西呀！制备感受态细胞呢，就像是给这个小调皮洗了个舒服的澡，让它能开开心心地迎接新变化。
咱为啥要费这劲去弄感受态细胞呀？这就好比你要给一个小朋友礼物，要是他不乐意接，那不是白搭嘛！所以咱得让大肠杆菌变得特别容易接受外来的东西，这样咱想给它导入个基因啥的，就容易多啦！那怎么弄呢？这可得有点小技巧啦！首先呢，咱得把大肠杆菌培养得好好的，就像给小树苗浇水施肥一样，让它茁壮成长。
然后，通过一些特殊的处理，让它的细胞膜变得更容易让东西进去。
这就好比是给大肠杆菌的家门开了个特别通道，让好东西能顺顺利利地进来。
这个过程可不简单哦，得小心翼翼的，就像你走钢丝一样，稍不注意就可能掉下去。
咱得控制好各种条件，温度啦、时间啦，都得把握得恰到好处。
这要是没弄好，那可就前功尽弃啦！哎呀，那得多可惜呀！你说这大肠杆菌感受态细胞制备难不难？其实也不难，只要你用心去做，就像对待自己最喜欢的宝贝一样，肯定能成功的。
等你成功制备出了感受态细胞，那感觉，就像自己打了一场大胜仗一样，开心得不得了呢！你想想，通过自己的努力，让这些小小的大肠杆菌变得乖乖的，能为咱所用，这多有成就感呀！而且这可是为后续的各种实验打下了坚实的基础呢，没有感受态细胞，好多实验都没法开展呀！所以呀，大家可别小瞧了这制备大肠杆菌感受态细胞的过程，这里面的学问大着呢！只要你肯下功夫，就一定能掌握这门技术。
加油吧，朋友们，让我们一起在生物学的海洋里畅游，探索更多的奥秘！这就是我对制备大肠杆菌感受态细胞的理解，大家觉得怎么样呢？是不是很有意思呀？原创不易，请尊重原创，谢谢!。
大肠杆菌感受态制备方法
大肠杆菌感受态制备方法
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲大肠杆菌感受态制备这档子事儿。
你说这大肠杆菌感受态制备啊，就像是给大肠杆菌来个大变身，让它能乖乖地接受我们给它的新东西。
这可不像咱平时做饭那么简单哦，这里面的门道可多着呢！
咱先得准备好各种材料，就像大厨做菜得有新鲜的食材一样。
然后呢，要小心翼翼地操作，不能有半点马虎。
你想想，要是一不小心弄错了一步，那不就前功尽弃啦？
比如说，在培养大肠杆菌的时候，那可得像照顾小宝宝一样细心。
温度啊、时间啊，都得把握得恰到好处。
温度高了低了，时间长了短了，都可能出问题哟！这就好像咱烤蛋糕，火候不对，蛋糕可就不好吃啦。
还有啊，在做一些关键步骤的时候，真得瞪大眼睛，全神贯注。
那感觉，就跟走钢丝似的，稍微有点偏差，后果就不堪设想。
这可不是闹着玩的呀！
咱再说说那个转化的过程，把要导入的东西加进去，就盼着大肠杆菌能顺利接受。
这就好像给它送礼物，得让它喜欢，它才能收下呀。
要是它不乐意，那咱不就白忙活啦？
制备好的感受态大肠杆菌，那可是宝贝呀！能帮我们实现好多实验目的呢。
就好像我们有了一把神奇的钥匙，可以打开好多知识的大门。
总之呢，大肠杆菌感受态制备这事儿，需要我们有耐心、细心，还得有那么点技巧。
可不能马马虎虎对待哦，不然怎么能得到我们想要的结果呢？大家可得好好记住这些要点，认真去做呀！相信只要我们用心，就一定能做好大肠杆菌感受态制备这件事儿，让我们的实验顺顺利利的！。
超级感受态细胞(大肠杆菌)-原理和制备Protocol
大肠杆菌超级感受态细胞原理和制备
所谓感受态，是指受体（或宿主）细胞最容易接受外源DNA片段而不将其降解并实现其转化的一种生理状态。
一. 原理：
人工感受态的形成, 需要低温和Ca2+处理，细胞膨胀成球状，细胞表面正电荷增加，
通透性增加，这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列。
转化的质粒DNA 由于形成抗
DNase 的羟基-钙( Ⅱ) - 磷酸复合物而粘附于细胞表面。
Ca2+与膜上的多聚羟基丁
酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入。
cAMP可以使感受态水平提高10000倍，而Ca2+也可大大的提高转化的效率，在
Mg2+的辅助下Ca2+感受的细胞转化率比单用Ca2+处理的高1.84倍。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：
1）局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
2）酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：
二. 制备：
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在无菌低温下进行。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
大肠杆菌感受态制备
摇床
用于大肠杆菌的振 荡培养。
恒温振荡器
用于大肠杆菌的恒 温振荡培养。
03 实验步骤
细菌培养
01
02
03
培养基选择
选择适合大肠杆菌生长的 培养基，如LB培养基，以 保证细菌正常生长。
培养温度
将细菌培养在37℃恒温摇 床中，振荡培养至对数生 长期。
细菌密度
通过观察细菌的生长情况， 控制细菌密度，通常在 OD600值为0.6-0.8时进 行后续操作。
参考文献2
02
03
参考文献3
大肠杆菌感受态制备技术进展， 作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
大肠杆菌感受态制备实验指南， 作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
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实验原理
感受态
感受态是指细菌处于一种生理状态，能够接受外源DNA并与之结合， 进而发生转化。
转化过程
外源DNA通过细菌的细胞膜进入细胞内，并在DNA结合蛋白的作 用下与细菌染色体上的同源序列发生交换，从而实现基因的克隆和 表达。
影响因素
影响感受态形成的因素包括细菌生长状态、培养基成分、温度、渗透 压等。
转化子的筛选和验证
筛选方法
转化子可以通过抗生素筛选、蓝白斑筛选等方法进行 筛选。
验证方法
验证转化子是否含有目的基因，可以通过PCR、酶切、 测序等方法进行。
注意事项
在筛选和验证过程中，需要注意避免假阳性或假阴性 的结果，确保实验结果的准确性。
优化实验条件
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温度
感受态细胞的转化需要在一定的温度下进行，不 同的温度可能会影响转化效率，因此需要选择适 宜的温度进行实验。
常用几种感受态区别
常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21的区别1：DH5a菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3）3：BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3，pLysS ，Camr4：JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5：TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG6：HB101菌株该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-17：M110或 SCS110大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。
第一章 1-4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.
1第六节大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、基本知识核酸不能自己进入细菌,而是需要帮助,并对细菌经过处理,才能穿过细胞的内、外膜进入,在里边表达和复制。
☺感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Competent cells 。
☺转化(Transformation :是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
2二、大肠杆菌感受态细胞的制备常用CaCl 2成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA 产生5×106~2×l07个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒上进行的常规克隆的需要。
适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。
制备的感受态细胞可贮存于-70℃,数月至1年。
但保存时间过长会使转化效率受到影响。
新鲜细胞4 ℃保存可用5天。
用于电转化法的感受态细胞的制备使用低盐缓冲液或水洗细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。
(具体操作及参数,参考仪器说明3☺下列有3个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的:–转化缓冲液中试剂的纯度–细胞的生长状态–玻璃和塑料器皿的清洁度4例:Cacl 2法制备感受态细胞(化学法步骤:1从于37℃培养16~20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm ,转到一个含有100ml LB 或SOB 培养基的1L 烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约3小时。
为得到有效转化,活细胞数不应超过108细胞/ml ,可每隔20~30分钟测量OD 600值来监测培养物的生长情况。
2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml 丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0℃。
3于4 ℃,离心10分钟,以回收细胞。
4倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
大肠杆菌感受态细胞的原理
大肠杆菌感受态细胞的原理今天来聊聊大肠杆菌感受态细胞的原理。
你看啊，在我们的生活中，有这么个现象就有点类似大肠杆菌感受态细胞。
想象一下一个非常封闭保守的小村庄，平时基本不接纳外人，但是在某个特殊的时期，就比如说可能遭遇了自然灾害之后，这个村庄突然就变得很容易接纳外村的救援人员啊、物资啊之类的。
大肠杆菌感受态细胞其实就是类似这样的一个情况。
大肠杆菌正常情况下是相对比较稳定的，它对于外界的一些DNA分子是有抵制情绪的，不会轻易让它们进入自己的细胞质。
但是呢，当它处于感受态的时候，就像村庄打开了大门一样，它的细胞壁和细胞膜会发生一些变化，在这个时候，就非常欢迎外界的DNA分子进入自己的细胞内部。
那为什么会这样呢？老实说，我一开始也不明白。
后来学习才知道，细菌在感受态的时候，细胞膜的通透性会增加。
这就好比原本紧密的铁栅栏出现了很多缝隙，外面的东西就容易钻进来了。
打个比方吧，大肠杆菌的细胞膜就像是一堵墙，平常这堵墙特别厚实、牢固，什么东西都透不过去。
可是呢，在感受态的时候啊，就好像这堵墙上突然出现了好多特殊的小通道，这些通道就给外界的DNA提供了方便之门。
这些通道是怎么形成的呢？一般来说，通过一些物理、化学的方法诱导，例如使用氯化钙处理。
可以想象成这个氯化钙就像是一把特殊的钥匙，它对大肠杆菌这堵墙做了一些手脚，让墙有了通道。
说到这里，你可能会问，大肠杆菌为什么要有这样一种感受态的形式呢？这就要说到生物进化和基因传递了。
在细菌的世界里，基因的交流也是很重要的。
就像我们人类社会中一些好的技术和文化会传播一样，大肠杆菌通过接纳外界的DNA，可能会获得一些新的基因，这些新基因也许能让它们获得一些新的能力，比如说对抗生素的耐药性。
在实际应用中啊，这一点就非常有用了。
生物实验室里经常会做一些基因克隆实验，利用大肠杆菌感受态细胞，我们把我们想要研究的基因片段转入大肠杆菌，这样大肠杆菌就成为了一个小小的“基因工厂”。
比如说，我们想要生产人类胰岛素用于治疗糖尿病，就可以把合成胰岛素的基因通过感受态细胞导入大肠杆菌里，让大肠杆菌为我们生产胰岛素。
大肠杆菌化转感受态制备
大肠杆菌化转感受态制备大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌，具有广泛的生物学功能和应用价值。
化转感受态制备是一种常用的方法，通过改变大肠杆菌的遗传物质，使其表达特定的转基因产物。
本文将介绍大肠杆菌化转感受态制备的原理、方法以及应用。
一、大肠杆菌化转感受态制备的原理大肠杆菌化转感受态制备是利用大肠杆菌的自然特性和遗传工程技术，将外源DNA导入大肠杆菌细胞内，并使其稳定表达。
大肠杆菌细胞通过自身的DNA复制和转录机制，将外源DNA整合到自身的基因组中，从而使外源基因在大肠杆菌中得以表达。
1. 质粒转化法：将质粒DNA与大肠杆菌细胞一起处理，使质粒DNA 进入大肠杆菌细胞内，并通过质粒DNA上的选择标记基因筛选转化成功的细胞。
2. 噬菌体转染法：利用噬菌体作为载体，将外源DNA导入大肠杆菌细胞内，并通过噬菌体的复制和感染机制，使外源DNA稳定表达。
3. 电穿孔法：利用高压电脉冲使大肠杆菌细胞膜发生破裂，外源DNA得以进入细胞内，并通过细胞自身的修复机制，使外源DNA稳定表达。
4. 钙离子转化法：利用钙离子与外源DNA形成复合物，通过渗透作用使其进入大肠杆菌细胞内，并通过细胞自身的代谢机制使外源DNA稳定表达。
三、大肠杆菌化转感受态制备的应用1. 蛋白表达：通过将目的基因导入大肠杆菌细胞内，使其表达目的蛋白，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
2. DNA克隆：利用大肠杆菌的高效复制和转录机制，将目的DNA片段插入质粒中，并通过质粒在大肠杆菌中的复制和传递，实现DNA 的克隆和扩增。
3. 突变分析：通过外源DNA的插入、缺失或替换，研究大肠杆菌基因的功能和调控机制，为进一步研究生物学问题提供重要工具。
4. 基因敲除和敲入：通过将外源DNA的特定片段插入大肠杆菌基因组中，实现对目的基因的敲除或敲入，研究基因功能和调控网络。
5. 抗生素筛选：利用大肠杆菌对抗生素的敏感性，通过将目的基因导入大肠杆菌中，筛选抗生素抗性基因。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・co li K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
感受态的验证
大肠杆菌感受态的验证方法：
一般，大肠杆菌感受态做好，我们会思考两个问题：
1.有没有污染?
2.得率如何?
我所在的实验室验证方法如下：
阳性验证：一般公司买的连接试剂盒里面，会有阳性对照样品质粒和目的片段。
感受态做好后，用以上样品做一下连接及转化，在LB+羧苄平板上后长出单菌落，挑取单菌落时要注意在平板上分散开挑取5个就好，然后做一个菌液PCR。
PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，加Marker 的同时，别忘了把质粒和目的片段也跑上。
如果条带大小正确就可以认为得率OK。
得率=(条带大小正确的/5)x100%
阴性验证：直接把做好的感受态涂布在LB+羧苄的平板上。
若平板上什么都没有长出来，就可以说没有被污染。
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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
概述
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
本实验室一般用TSS法制备感受态。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cDNA)。
转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外。