层析分离纯化技术PPT课件

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第三章层析概论一、层析以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。

目前，这种方法已作为纯化或鉴定各种化合物的一种重要手段。

1903年俄国植物学家茨维特首先将碳酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤发现，各种色层彼此可分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，这就是早期的吸附层析碳酸钙细粉植物色素溶液石油醚洗涤二、层析类型层析方法可根据不同的标准分成若干类型：按流动相分类：液相层析和气相层析；按固定相“床”的形式分类：柱层析、薄板(层)层析、薄膜层析等等，详见表3~1。

三、层析常用术语1．固定相固定相是由层析基质组成的。

其基质包括：固体物质(如吸附剂、离子交换剂)液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。

2．流动相在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。

在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。

在薄层层析时，流动相又称展层剂。

3．操作容量即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量；一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。

(mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml)其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。

4．床体积(Vt)通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。

Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和，即:Vt = V0+ Vi + Vg(详见图3-1)5．外水体积(V0)外水体积指基质颗粒之间体积的总和。

6．内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。

7．基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。

层析分离纯化技术76页PPT

1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有久久不会退去的余香。
层析分离纯化技术4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮回里有你。
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育；而要挑战别人所ห้องสมุดไป่ตู้的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔

实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质讲课讲稿

☺琼脂糖凝胶是商品名因生产厂家不同而异。（具体名称和型号见教材P18）
琼脂糖凝胶特点
❖室温下其稳定性胶葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，对样品的吸附性很小。
❖洗脱速度较快
❖排阻极限大，分离范围广，适合分离大分子物质。
小结
❖ 凝胶层析的原理：分子筛效应 ❖ 凝胶层析有效分配系数（Kav）：被分
离的化合物被凝胶排阻的程度。 ❖ 层析实验操作过程中的注意事项。 ❖ 实验结果：观察到蓝色蛋白洗脱快，黄
溶质在固定相中的浓度（Cs）
K=
溶质在流动相中的浓度（Cm）
☻K值大：被固定相吸附的牢固，随流动相的移动速度较慢。
☻若混合物中各组分K值相差较大, 则能较易地分离，反之，K值相差较小，分离效果差。
离子交换层析(ion exchange chromatography)
用离子交换剂（在惰性载体上引入带有电荷的活性基团）作固定相，与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法。
重点1
凝胶层析的原理
分子筛效应
❖ 比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，首先流出。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内部，然后再扩散出来，经历的流程长，流动速度慢，后流出。
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
❖分离原理在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的
配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离纯化。
1. Incubate crude
2. Wash away non bound
sample with the
sample components from

层析分离纯化技术

Sulfonate
-SO3-
离子交换层析
离子交换层析原理——蛋白质滴定曲线
+
stability range denaturation
与阳离子交换
蛋白
介质结合
质
pI
净电
2
荷
与阴离子交换 10 pH
介质结合
stability range
- denaturation
离子交换层析原理
离子交换层析
Products:
原理与操作
层析技术
• Ion Exchange (IEX)－离子交换 –电荷 – 可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化
• Size Exclusion (SEC)－分子筛（或凝胶过滤） –分子大小 – 用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化
• Affinity (AC)－亲和 –生物相互作用 – 用于复杂样品的最早捕获或中间纯化
50um
Macro-Prep high S Macro-Prep CM
Macro-Prep 25 Q Macro-Prep 25 DEAE Macro-Prep 25 S
25um
UNOsphere Q 120um UNOsphere S 80um
离子交换层析
UNOsphere Q/S性能参数
• 更高的选择性和分辨率 • 10% 穿透载量:
+
++
+
+ +
+
+
+ +
+
++
++
Regeneration

《层析分离技术》课件

总结与展望
1 优势和局限性
层析分离技术具有高效、可靠、灵活等优势，但也存在一些局限性。
2 发展趋势
层析分离技术在分离纯化效果、自动化程度和快速分析方面的发展具有很大潜力。
层析分离技术的应用
1
蛋白质纯化技术
层析分离技术在蛋白质纯化过程中起到关键作用，实现高效的纯化和分离。
2
生物大分子制备
层析分离技术被广泛应用于生物大分子的制备过程，如核酸提取和多肽纯化。
3
制药过程中的应用
总站式层析技术在制药过程中用于分离和纯化药物及其他有关的化合物。
4
其他应用领域
层析分离技术还在食品工业、环境监测等领域得到广泛应用。
应用
层析分离技术广泛应用于蛋白质纯化、生物大分子制备等领域。
层析分离技术的基本原理
1 分子相互作用
层析分离技术基于分子之间的相互作用，如电荷、亲疏水性等。
2 物质分子分配系数
物质分子在不同相之间的分配系数决定了其分离程度。
3ห้องสมุดไป่ตู้层析柱构成要素
层析柱由填料、梯度溶剂和流动相等要素构成，起到分离和纯化作用。
层析分离技术的分类
分离机理
按照分离机理，层析分离技术可分为吸附层析、分配层析和离子交换层析。
层状介质特性
根据层状介质的特性，可将层析分离技术分为薄层层析、柱层析和高效液相层析。
介质形态
介质形态包括液态层析、凝胶层析和纤维素层析等。
操作方式
操作方式包括亲和层析、吸附剂层析和凝胶过滤层析等。
《层析分离技术》PPT课件
层析分离技术是一种基于分子之间相互作用的分离技术，通过物质分子在不同相之间的分配系数实现分离和纯化的方法。

蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)

而增加
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强，因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）

蛋白质化学中的层析技术PPT课件

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蛋白质化学中的层析技术PPT 课件
目
CONTENCT
录
• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子大小差异的分离技术。通过不同孔径的凝胶介质，不同大小的分子会以不同的速度通过凝胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、多糖等大分子物质的分离和纯化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层析、电泳等新型层析技术逐渐兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应用范围越来越广泛，成为生物化学领域中重要的分离分析方法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。

层析法-理论ppt课件

方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁珠分离法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层析纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离
纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜层析法薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品层析后
实验：胡萝卜的柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层，再把样品点在薄层板上，点样的位置靠近板的一端。然后将板的这端浸入适当的溶剂(流动相)中，使溶剂在薄层板上扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反复进行，而将样品各个组分分离出来。

《层析分离纯化技术》课件

环境监测
用于检测水、空气和土壤中的有害物质和污染物。
研究进展和未来发展方向
1 新材料的开发与应用
开发更高选择性和吸附能力的固定相材料。
2 设备结构的改进
优化层析柱和设备，提高分离效率和纯化效果。
3 过程优化和工程化程度的提高
改善工艺流程，实现规模化生产和自动化控制。
总结
层析分离纯化技术的优势和局限性
样品的制备和预处理
对待纯化的样品进行适当的处理和准备，如使用化学流动相的组成和pH等参数，将目标物质与固定相分离。
层析分离纯化技术的应用
生物制药领域
用于纯化和提纯生物药物，如蛋白质、抗体和基因治疗药物。
食品工业
用于分离和提取食品中的有益成分，如香料、色素和保健品。
通过溶液中正负离子的交换作用实现分离。
凝胶过滤层析
利用固定相的多孔性进行分子大小和形状的分离。
亲和层析
利用样品与固定相之间的特异性识别作用进行选择性分离。
层析分离纯化的步骤
1
样品的装载
2
将处理好的样品加载到层析柱中，通常
使用压力或重力驱动样品流经固定相。
3
分离产物的回收
4
从洗脱液中回收目标物质，并将其纯化和浓缩。
优势：高效、选择性强、适用广泛。局限性：操作复杂、需专业知识。
对未来发展方向的展望
层析分离纯化技术将继续发展，应用于更多领域并提高纯化效率和节约资源。
层析分离纯化技术
层析分离纯化技术通过物质的相互作用及其差异在固定介质中的分离来实现物质的纯化和分离。
简介
层析分离纯化的概念和作用：通过固定相和流动相之间的互作用分离混合物，广泛应用于生物制药、食品工业和环境监测等领域。

生物大分子分离纯化技术之层析(色谱)技术(56页)

生物大分子分离纯化技术
当流动相中所含的混合物经过固定相就会与固定相发生作用。由于混合物中各组分在结构和性质上存在差异，它们与固定相发生作用的大小、强弱就有差异。因此，在同一条件下，不同组分在固定相中滞留时间不同，从而按先后不同次序从固定相中流出。这种借在两相间分配的原理而使混合物中各组分离的技术，称为色谱分离技术或色谱法，又称色层法、层析法。
生物大分子分离纯化技术
塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也不能完全满足塔板理论的前提假设。如塔板理论认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建立平衡，还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有径向扩散，这些都是不符合色谱柱实际情况的，因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高，客观地评价色谱柱地柱效，却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃柱在室温及常压下进行起来，又补充了气相色谱法的内容。根据液相色谱的特点，可称做高效、高压、高速和现代液相色谱法。液相色谱法不论在仪器还是柱填料方面均发展很快。
生物大分子分离纯化技术
层析（色谱）法分类
样品中的离子与离子交换树脂上的离子的交换反应过程可用下式表示：
阳离子交换
树脂-SO3-H++M+ 阴离子交换
树脂-SO3-M++H+
树脂-NR3+Cl-+X- 树脂-NR3+X-+C1-
生物大分子分离纯化技术
(四)空间排阻色谱法 (五)亲和色谱法
生物大分子分离纯化技术
塔板理论
塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。

层析分离纯化技术策略共58页PPT资料

8
pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变
滴定曲线
3
+
pH
10
稳定性范围
不同 pH 下的分离情况
1
蛋白质净电荷
用阳离子交换
用阴离子交换
2
-
1
2
9
pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变
流动相的 pH 选择性
Abs
Abs
Abs
Abs
V
V
V
V
+ 阳离子
表面净电荷
0
pH
阴离子
-
Abs
Abs
Abs
3
沉淀蛋白质的方法
(1) 盐析法 (2) 有机溶剂沉淀法 (3) 重金属盐沉淀法 (4) 加热变性沉淀法
4
蛋白质纯化策略
融合蛋白质
简单纯化
一步亲和层析 90 - 97 % 纯度
更高纯度
多步纯化
表达
非融合蛋白质
5
粗提中度纯化精细纯化
三步纯化策略
高效纯化策略
分辩率精细纯化
纯化
分解目标分子
17
预防措施
膜过滤、离心、匀浆
离心、如可跟目标分子兼容，可用有
机溶剂
添加硫酸链霉素、硫酸精蛋白或锰盐沉淀核酸、添加核
酸酶
添加蛋白酶抑制剂、用亲和层析去除蛋白酶、缩短粗分时间、低温操作
粗提
目的
纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白
酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析
Step
12
三步纯化策略
层析填料的颗粒大小
精细纯化中度纯化

《生物分离层析技术》PPT课件

吸水量为50%时仍为粉末状，当其吸水量在17%以上时，硅胶就失去其吸附作用，作为载体使用，此时硅胶层析则为分配层析。
（二）硅藻土具有微孔结构，不具吸附作用，是现在使用最多的载体。其处理和装柱方法基本同硅胶相似。
（三）纤维素
三、分配柱层析的固定相与展开剂
（一）固定相
常用的固定相有水、各种缓冲溶液、酸的水溶液、甲酰胺、丙二醇以及为水所饱和的有机溶剂等。有时也采用“反相层析法”，即用有机溶剂为固定相，而以水或水溶液或与水混合的有机溶剂为流动相。
（一）离子交换柱层析的操作 1．层析柱 2．平衡缓冲液 3．上样 4．洗脱缓冲液 5．洗脱速度 6．样品的浓缩、脱盐（二）离子交换柱层析的应用 1.水处理 2.分离纯化小分子物质 3.分离纯化生物大分子物质
第五节凝胶柱层析
一、凝胶层析的原理
凝胶层析又称分子排阻层析、分子筛层析或凝胶过滤。它是指混合物随流动相经固定相（凝胶）的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分
• 3、用一块比管径略小的圆形滤纸吸附被分离物溶液，溶剂挥发后，放在载体上，然后加流动相洗脱。
四、分配柱层析的特点与应用
• （一）特点： • 分配柱层析具有载体来源容易、分离成本
低、流速快等特点,适用于分离极性比较大、在有机溶剂中溶解度小的成分，或极性很相似的成分。 • （二）应用： • 分配柱层析多用于分离亲水性的成分，如苷类、糖及氨基酸类。
离的技术。
固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于凝胶颗粒之外，因而具分子筛的性质。又因整个层析过程一般不变换洗脱液，好像过滤一样，故也称凝胶过滤。

3-13-常见分离纯化技术原理

常见分离纯化技术原理---介绍离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、分配层析和电泳原理1、离子交换层析法⏹原理:根据离子间作用力的不同而将物质分离的方法⏹离子交换剂可解离出阴离子或阳离子，当待分离的溶液中含有阳离子时可以与阳离子交换剂的阳离子交换吸附在离子交换介质上，带电量不同的物质与离子交换剂的结合力不同，解离的条件不同，可通过改变条件，促使其解离和分部收集待分离物。

Sampleapplication and wash Elution Equilibration Regeneration-------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++anion exchanger bead ----------离子交换层析步骤和发生的变化2、凝胶过滤层析技术●概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。

●原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外,在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。

⏹凝胶过滤法测定相对分子量◆蛋白质分子通过凝胶的洗脱体积取决于它的斯脱克半径；◆如果未知蛋白与理想的非水化球体有相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与球体相同的的斯脱克半径；◆因此，实验中只要测得标准蛋白的洗脱体积，再测得未知蛋白的洗脱体积就可以得到它的相对分子量。

3、疏水作用层析⏹非极性氨基酸残基组成的疏水区域可使蛋白质结合非极性分子，利用这种相互作用蛋白质可被吸附在基质上。

⏹在不带电荷的载体上偶联疏水基团而形成疏水吸附剂⏹利用载体和样品疏水基团间的相互作用使它们吸附在一起，然后改变层析条件，减弱疏水作用，使吸附的蛋白质从吸附剂上解吸下来。