层析分离纯化技术PPT课件
层析分离纯化技术
软件系统
DuoFLow
纯化平台的硬件结构——
层析介质与层析柱，原理与技术
层析介质
离子交换层析介质
Unosphere Q，S MacroPrep High Q,High S,DEAE,CM
亲和层析
Profinity IMAC金属螯合介质 Profinity Epoxide环氧亲和介质 Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝胶 Affi-Prep多粘菌素介质 Affi-Gel硼胶 Affi-Gel配体固定化活化介质
离子强度
洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.
在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留 行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质 保留值减小。
缓冲液与pH
+
蛋
白
质
净 电
2
荷
离子交换层析
碱性蛋白，采用 阳离子交换
阳离子交换
pI＝5.5
pI＝7.5
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Setup –select hardware
实验一鸡卵类粘蛋白的分离与纯化(共23张PPT)
5的磷酸盐缓冲液平衡，洗去未被吸附的杂蛋白。 紫外分光光度法鉴定样品含量及纯度；
出柱外。而盐或其他小分子物质因进入凝胶颗粒的微 5)透析除盐 将层析收集的蛋白溶液放入透析袋内，对蒸馏水进行透析，间隔1h更换一次蒸馏水，直至经1%AgNO3检查无氯离子为止（过夜）
凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化
【基本原理】
蛋白质混合溶液在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白 选择合适的pH值，三氯乙酸浓度和丙酮浓度，可以从蛋清中获得鸡卵黏蛋白的粗提液。
1）凝胶的处理 量取100mL Sephadex G-25凝胶，加入200mL磷酸盐缓冲液，沸水浴中1h。 鸡卵类黏蛋白纯品的制备 凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化
凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化
4)上样 取样品溶解液上Sephadex G-25层析柱。 控制流速15d/ min，收集蛋白峰。即可得到鸡卵类黏蛋
白粗提液。并准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。
鸡卵类黏蛋白纯品的制备
【基本原理】
初步提取得到的鸡卵类粘蛋白，经DEAE-纤维素 离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白。得 到鸡卵类粘蛋白的纯溶液。然后经透析、丙酮沉淀 、抽真空干燥即可获得鸡卵类粘蛋白纯品。
4) 离心管中加入20mL蒸馏水溶解，将溶解液用 2）装柱 将脱气后的DEAE-纤维素装入柱内。
酶的分离纯化层析技术PPT讲稿
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现，诺贝尔化学奖
塔板理论
将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏 塔的塔板间移动，在每一个塔板内不同组分分 子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动 相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下 一个塔板，并不断形成新的平衡
液相色谱 液-固层析 液-液层析
气相色谱 气-固层析 气-液层析
两种固定相：(固定相不一定是固体) *固体吸附剂作为固定相 *吸附在固体上的液体（硅胶吸附的水作固定相， 以氯仿作流动相，分离羊毛中的氨基酸 ）
（2）按层析原理分类：
吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能 的差异，达到分离鉴定的目的。
常温
化工分析，环境 生物分子，蛋白核 酸，医药
层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物物理理、、化化学学性性质质 （如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分 配系数等）的差异使各组分在两相（固定相和流 动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同 的速度移动而达到分离的目的。
层析法的分类
（1）按流动相状态分类：
高效液相色谱采用了压 力泵及填有很细的颗粒 高效色谱柱。High Performance Liquid Chromatography.
液相色谱与气相色谱法比较
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解
层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。按层析原理可将层析分为以下9种：
1、亲和层析
利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理
特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质ppt课件
气-固层析 气相层析
层析
液相层析
气-液层析 液-固层析
液-液层析
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
层析的分类
二、按操作方式分类
1 柱层析
1
22 纸层析
3 薄层层析
4
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
教学重点：
凝胶层析的原理和实验步骤。
教学难点：
掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。
教学对象：
临床医学五年制本科
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
3-13-常见分离纯化技术原理
常见分离纯化技术原理
---介绍离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、分配
层析和电泳原理
1、离子交换层析法
⏹原理:根据离子间作用力的不同而将物质分离的方法
⏹离子交换剂可解离出阴离子或阳离子，当待分离的溶液中含有阳离子时可以与阳离子交换剂的阳离子交换吸附在离子交换介质上，带电量不同的物质与离子交换剂的结合力不同，解离的条件不同，可通过改变条件，促使其解离和分部收集待分离物。
Sample
application and wash Elution Equilibration Regeneration
---------------------------------------------
----------++++++++++++++++++++++++++++++anion exchanger bead ----------
离子交换层析步骤和发生的变化
2、凝胶过滤层析技术
●概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。
●原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外,在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
⏹凝胶过滤法测定相对分子量
◆蛋白质分子通过凝胶的洗脱
体积取决于它的斯脱克半径；
◆如果未知蛋白与理想的非水
化球体有相同的洗脱体积，
则认为这种蛋白质具有与球
体相同的的斯脱克半径；
离子交换柱层析法分离纯化蛋白质
离⼦交换柱层析法分离纯化蛋⽩质
离⼦交换柱层析法分离纯化蛋⽩质
⼀、实验⽬的
学习层析技术，掌握离⼦交换柱层析法分离纯化蛋⽩质的操作⽅法。
⼆、基本原理
离⼦交换层析是依据各种离⼦或离⼦化合物与离⼦交换剂的结合⼒不同⽽进⾏分离纯化的。离⼦交换层析的固定相是离⼦交换剂，以液体为流动相。离⼦交换剂由⼀类不溶于⽔的惰性⾼分⼦聚合物基质，通过⼀定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成。离⼦交换剂可以分为三部分：⾼分⼦聚合物基质、电荷基团和平衡离⼦。电荷基团与⾼分⼦聚合物共价结合，形成⼀个带电的可进⾏离⼦交换的基团。平衡离⼦是结合于电荷基团上的相反离⼦，它能与溶液中其它的离⼦基团发⽣可逆的交换反应。平衡离⼦带正电的离⼦交换剂能与带正电的离⼦基团发⽣交换作⽤，称为阳离⼦交换剂；平衡离⼦带负电的离⼦交换剂与带负电的离⼦基团发⽣交换作⽤，称为阴离⼦交换剂。假设以RA+代表阳离⼦交换剂，其中A+代表平衡离⼦，A+可以与溶液中的阳离⼦B+发⽣可逆的交换反应，其反应式为
RA+ + B+↔ RB+ + A+
上述反应能迅速达到平衡，平衡的移动遵循质量作⽤定律。
下⾯以阴离⼦交换剂为例简单介绍离⼦交换层析的基本分离过程。
阴离⼦交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离⼦结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离⼦进⾏可逆的置换反应⽽结合到离⼦交换剂上，⽽正电基团和中性基团则不能与离⼦交换剂结合，随流动相流出⽽被去除。通过选择合适的洗脱⽅式和洗脱液，如增加离⼦强度的梯度洗脱。随着洗脱液离⼦强度的增加，洗脱液中的离⼦可以逐步与结合在离⼦交换剂上的各种负电基团进⾏交换，⽽将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离⼦交换剂结合⼒⼩的负电基团先被置换出来，⽽与离⼦交换剂结合⼒强的，需要较⾼的离⼦强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离⼦交换剂结合⼒从⼩到⼤的顺序逐步被洗脱下来，从⽽达到分离⽬的。
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2001.11.28 Shanghai Pudong
1
概述
1
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2
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3
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11
GST 融合蛋白的检测
检测方法
GST 96 孔板 ELISA 检测试剂盒
GST 酶测定检测模组 功能测定
注意
适合筛选表达系统和层析组份 当表达蛋白的含量不明或需要高灵敏度 时特别有用
快速测定；适合筛选用途 可以有效评估纯化出来的 GST 融合蛋白 的活性，但可能需要自行设计和优化
12
GST融合蛋白的检测
4 CV结合缓冲液, 8 ml 样品, 10 CV结合缓冲液, 5 CV洗脱缓冲液, 5 CV结合缓冲液(CV = 柱体积)
ÄKTA™explorer 10
Elution buffer
% Elution buffer
3.0 2.5
Wash
2.0 1.5 1.0 0.5
100
2.7 mg
pure GST
3:
洗脱GST 融合蛋白
kD
94 67 43 30 20.1 14.4
12 3
Glutathione Sepharose™ Fast Flow
适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用， 并用作放大
• 每毫升填料可以纯化 12 mg 融合蛋白 • 装在 XK 空柱中和 ÄKTA™ 平台纯化
系统连接使用 • 高流速 • 兼容尿素，盐酸胍等
Mr 37 000
PreScission™ Protease:
Mr 46 000
5
任何规模纯化都比较简单
预装柱/填料
GST MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 GST 融合蛋白的量
〈 400 µg
GSTrap™ 1 ml
10 - 12 mg
GSTrap 5 ml
提供分子量大小和 % 纯度讯息. 可检测融合蛋白和污染物.
13
GST 96-孔板 ELISA 检测试剂盒
• 快速酶测定 • 每块板可检测 50 样品 • 适合筛选表达系统和层析组
份
14
(His)6 融合蛋白的纯化和检测
Ni2+ Ni2+
重组蛋白 His His His His His His
Ni2+
6
GST MicroSpin™ Purification Module
适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化
• 立即可用, 50 预装柱含缓冲 液和所需试剂
• 可纯化每柱 400 µg, 体积达 400 µl 样品
7
GSTrap™ 柱
适合快速和重复性高的要求
• 20 分钟内 • 每 1 ml 柱 12 mg 或 每 5 ml 柱 60 mg • 使用针筒，蠕动泵，或者 ÄKTA™ 系统 • 添加剂兼容
50 - 60 mg
Glutathione Sepharose™ 4B 8 mg / ml
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow
10 -12 mg / ml
注意
立即可用, 预装柱, 缓冲液和试剂 和 MicroPlex™ 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理〈 48 样品) 立即可用, 预装柱 立即可用, 预装柱 可自行装柱 可自行装柱，使用层析系统快速纯化， 适合放大
IgG Sepharose 6 Fast Flow
IgG Sepharose 6 Fast Flow
4Байду номын сангаас
GST 融合蛋白的纯化
Glutathione Sepharose™
Mr 26 000
GST
重组蛋白
10C
酶切位点
Factor Xa:
Mr 17-20 000 / 28-30 000
Thrombin:
pRIT2T (利用温度改变诱导) 蛋白 A 的 IgG 结合区
纯化
GST MicroSpin™ Purification Module, GSTrap™, Glutathione Sepharose™ Fast Flow
His MicroSpin Purification Module HisTrap™, HiTrap™ Chelating, Chelating Sepharose Fast Flow
Ni2+
15
任何规模纯化都比较简单
预装柱/填料
His MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 融合蛋白的量
〈 100 µg
8
GSTrap™
结合缓冲液平衡 加样后用结合缓冲液冲洗 用洗脱缓冲液洗脱
3 min 废液
5-15 min 收集
9
2 min 收集组份
GSTrap™
柱: 样品: 结合缓冲液: 洗脱缓冲液 流速: 层析 步骤:
系统:
A 280
3.5
GSTrap 1 ml 8 ml 大肠杆菌表达含 GST 融合蛋白胞浆萃取液 PBS, pH 7.3 50 mM Tris™-HCl, pH 8.0 ＋ 10 mM 还原谷胱甘肽 1 ml/min
80
fusion
protein
60
40
20
0
0
5.0
10.0
15.0
20.0
ml
5.0
10.0
15.0
20.0
min
10
SDS PAGE analysis
1:
低分子量标记 (LMW) Calibration kit,
还原, Amersham Pharmacia Biotech
2:
胞浆萃取液, 1 g /10 ml
蛋白质纯化策略
融合蛋白质
简单纯化
一步 亲和层析 90 - 97 % 纯度
更高纯度
多步纯化
表达
非融合蛋白质
3
粗提 中度纯化 精细纯化
三步纯化策略
简易纯化选择
载体和标记
pGEX 谷胱甘肽 S-转移酶
PQE 6 x 组氨酸
pET 6 x组氨酸
pEZZ 18 (非诱导性表达) 蛋白 A 的 IgG 结合区
检测方法
使用抗-GST 抗体和 ECL™ 检测系统的 免疫印迹法
注意
高度特异, 只检测 GST 融合蛋白 使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以 使背景大大减低，甚至去掉 ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力 ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏 度 需要更高灵敏度时使用 ECL Plus.
SDS-PAGE ＋Coomassie™ 考马氏染色或银染