细胞生物学第三章

• 例：荧光染料吖啶橙，可使RNA发 出红色荧光，而使DNA发出绿色荧 光。
• 结构特点：1 采用紫外光发生装置： 高压汞灯 + 激发装置 + 滤光装置
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2 透镜由石英玻璃制成，
以便减少光通路上的紫外光损耗
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3 目镜中要装压紫滤片
• 荧光显微镜目前在分子细胞生物学研究中应用 十分广泛，以荧光素标记各种探针进行基因定 位分析或对某些特定蛋白质进行定性定位检测 分析，灵敏清晰。在荧光显微镜下对样品可同 时采用两种以上荧光探针检测，依据其不同颜 色的荧光信号，我们能一次判断识别多个基因 （或蛋白）的位点，因此这是非常实用的研究 技术。例如，绿色荧光蛋白 GFP 可用于进行 活体观察。 此外， 由于在荧光标记检测实验 中， 易发生一些非检测目标出现假象的 “背 景噪音” 问题， 因而现可在荧光显微镜设备 上安装一套“数字成像处理系统”，即把图像 信息通过摄像机和电脑的图象数字化处理，使 信号反差得以放大增强，对假象削弱或消除， 从而明显提高检测的准确率和灵敏度。
细胞生物学第三章
3.荧光显微镜 fluorescence microscope
• 原理：以紫外光为光源，使被检材料中 的荧光物质激发出荧光，从而对细胞内 某些物质进行定性和定位分析。荧光现 象有两种：来自百度文库.自发荧光—细胞内某些天 然荧光物质被紫外光照射所 激 发 的 荧 光， 例，叶绿素—血红色自发荧光； 2.诱发荧光—在细胞中加入某种不会使 细胞化学组分变性的荧光染料（ 荧光 素 ）， 与细胞内某种特定成分结合在 一起，经紫外光照射激发出荧光。
• R=0.61 λ / N·A
（R是分辨距离，0.61是常数，λ是照明光波波长， N·A是显微镜物镜的镜口率—光学性能指标， 每个物镜的外壳上都标有其镜口率的数值）。
细胞生物学第三章
• ∵分辨距离R与镜口率N·A成反比关系
• ∴若把最大镜口率1.25（ 即油镜镜口 率）代入公式，可见， 最小分辨距离 ≈λ∕２ 。 由于可见光中最短波长（紫光）0.4μm （即400nm）， ∴普通光镜最大分辨 力的理论极限应为0.2μm。
• i.换用短波长的“照明光源”，来提高分 辨力。如： 紫外光显微镜、电子显微镜
• ii.应用特殊光学效应， 增强反差， 来提 高分辨能力。 如：相差显微镜、微分干 涉显微镜
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• ⒉相差显微镜 phase contrast microscope
• 原理：光波的三个光学特性：（1）光波有波 长。 对于光波波长变化，肉眼觉察为颜色变化; （2）光波有振幅。 对于光波振幅变化（即振幅 差），肉眼觉察为明暗变化； （3）光波有相位 （ 相位是指某一时刻， 光在其前进路线上的位 置）。对于光相位的变化（即相位差），肉眼是 不能觉察的。
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激光扫描共焦显微镜
Laser scanning confocal microscope
• 激光扫描共焦显微镜的物镜和聚光镜是 聚焦于同一焦点之上，故能排除焦平面 以外荧光的干扰，因此其分辨率比普通 荧光显微镜要提高1.4—1.7倍， 并还能 以“光学切片”方式去观察较厚样品之 中的内部精细结构。
• 高级研究显微镜的油镜镜口率为1.4， 则此镜的最大有效放大倍数为1400倍。
• 如果放大倍数超过限度， 则视野中物象 会变模糊 ，细微结构反倒分辨不清 ，成 为了 无效放大。 由于物镜镜口率受入射 镜口角和介质折射率的限制， 不可能再 更进一步提高了。 所以科学家们从另外 两个途径来改进显微镜：
请记 住 0.2μ !!! 这个数值就是显微
水平与亚（超）微水平的分界线。
• ∵显微镜的分辨力有一定的极限， ∴其放大率受分辨力制约而不可能无限 提高。 普通光镜放大率的经验界值： 有效放大倍数极限 ═ 物镜最大镜口率 ×1000
• 例： 普通显微镜的油镜镜口率为 1.25，故此台显微镜的最大有效放大倍 数为1250倍。
• 特点： 相差显微镜的观察效果是被检物 体比其周围背景略暗，而物体外围显现有 一圈明亮的光环。
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• 倒置显微镜则是将相差显微镜的构 件颠倒装配，本末倒置而成的，并 装有恒温设备、闭路电视和缩时摄 象机，是能够完善适用于细胞培养 的观察监视系统。
• 微分干涉显微镜却是另一种不需染 色而可以直接观察活细胞精细结构 及动态变化的技术设备，其分辨率 比普通光镜要提高一个数量级。
• 当光线穿过无色透明且非匀质的被检物体（如 活细胞），其波长和振幅都无明显变化，仅光相 位出现了一定程度的变化，此时观察会感觉反差 较小，对物体内部的结构难分辨，这就是普通光 镜不适宜用于观察活细胞的原因。
• 相差显微镜却是运用一些特殊装置，使通 过被检物体的光线分离成两组光波，并人 为地促使这两组光波之间微弱的相位差加 大，再经过光波干涉作用，使看不见的相 位差转变成可见的振幅差，从而造成反差 增强，便能够清晰看到被检物体及其内部 细微结构了。所以，相差显微镜下的样品 标本不需染色，即可以十分清晰地观察活 细胞及其内部结构的变化。
第三章 细胞生物学研究方法
• 一、细胞形态结构观察
• 〈一〉光学显微镜 • ⒈普通光镜的性能指标：放大率（放大倍
数），分辨力，清晰度、焦点深度，镜象亮度 • 分辨力（分辨率、分辨本领）：能分辨两个
物点之间最短距离的能力，通常是以分辨距离 来表示的，即分辨距离越小，则分辨力越高。
• 人肉眼分辨力测试，是规定在明视距离为25cm 所分辨的最短间距来表示，正常人肉眼分辨力的 极限值是0.1 mm毫米。显微镜的分辨力可按下 列公式来计算 :
（二）电子显微镜
• 1.透射电镜 TEM transmission electron microscope , • 透射电镜的成像光路图，与光镜的基本类似。
只不过是以电子枪所发射的高速电子流代替了 照明光源，又以三组电磁线圈所构成的磁透镜 代替了玻璃制成的聚光镜、物镜和目镜。 第 一组磁透镜能将电子流聚集到样品上 （ 故称 为会聚镜），第二组磁透镜能使穿透过样品的 电子射线折射形成初级放大象（称为物镜）， 而第三组磁透镜则是通过第一、第二中间镜和 投影镜进行连续三次的再放大，最终投射到荧 光屏上，使电子图象转变成可见的光学图象。