9.核酸生物合成ppt

37℃转化率核苷酸数／ ℃转化率核苷酸数／ 酶分子·分钟 酶分子 分钟 3′ → 5′外切活性 外切活性 5′→3′外切活性 外切活性 切刻平移活性
DNA聚合9KD 400 + 600 + + + 低 修复 去除引物 填补空缺
120KD 17 - 100 + 30 + 低 不详
（二）复制过程 1、起始 、 •（1）、 （ ）、 ）、DNA复制的起始点： 复制的起始点： 复制的起始点 复制从DNA分子上的特定部位开始， 分子上的特定部位开始， 复制从 分子上的特定部位开始 复制起始点(origin of 这一部位叫做复制起始点 这一部位叫做复制起始点 replication) DNA复制从起始点开始直 DNA复制从起始点开始直 到终点为止，每个这样的DNA单位称 到终点为止，每个这样的 单位称 复制子或复制单元(replicon)。在原 为复制子或复制单元 。 核细胞中，每个DNA分子只有一个复 核细胞中，每个 分子只有一个复 制起始点，因而只有一个复制子， 制起始点，因而只有一个复制子，而 在真核生物中， 在真核生物中，DNA的复制是从许多 的复制是从许多 起始点同时开始的，所以每个DNA分 起始点同时开始的，所以每个 分 子上有许多个复制子。 子上有许多个复制子。 （2）DNA复制过程中各酶和蛋白质的作用 ） 复制过程中各酶和蛋白质的作用
（二）逆转录酶的特性： 逆转录酶的特性：
•1、RNA指导的 、 指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板， 聚合酶活性； 为模板， 指导的 聚合酶活性 为模板 催化dNTP聚合成 聚合成DNA的过程。 的过程。 催化 聚合成 的过程 •2、RNase H活性；由逆转录酶催化合成的 活性； 、 活性 由逆转录酶催化合成的cDNA与 与 模板RNA形成的杂交分子，将由 形成的杂交分子， 模板 形成的杂交分子 将由RNase H从RNA5′端 从 端 水解掉RNA分子。 分子。 水解掉 分子 •3、DNA指导的 指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第 聚合酶活性； 、 指导的 聚合酶活性 一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二 单链为模板， 为底物， 一条 单链为模板 为底物 分子。 条DNA分子。 分子 • 逆转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推 动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。 动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细 胞提取mRNA并以它为模板，在逆转录酶的作用下， 并以它为模板， 胞提取 并以它为模板 在逆转录酶的作用下， 合成出互补的cDNA library)，从中筛选特异的目的基因。 ，从中筛选特异的目的基因。
（三）DNA聚合酶的活性 聚合酶的活性
•5′→3′的聚合酶活性
–5′→ 3′方向 方向
•核酸外切酶活性
–3′→ 5′外切酶活性：校对功能，这是保证其聚合作用 外切酶活性： 外切酶活性 校对功能，
的正确性不可缺少的，因此对于 的正确性不可缺少的，因此对于DNA复制中极高的保真性 复制中极高的保真性 是至关重要的。 是至关重要的。
（1）RNA引物的生成 ） 引物的生成
（2）冈崎片段的合成 ）
（3）切除引物，补缺口。 ）切除引物，补缺口。 生成。 （4）连接酶连接。子代 ）连接酶连接。子代DNA生成。 生成
半不连续复制和冈崎片段
后随链的合成
3′
领领编 5′
3 ′ 5 ′
′ 5
5′
随随编
3′ 3′ 5′
环状DNA的滚环式复制 的滚环式复制 环状
第十章 核酸的生物合成
第一节 DNA的生物合成 （Biosynthesis of DNA） 的生物合成 ） 一、DNA半保留复制的概念 半保留复制的概念 DNA双螺旋链的氢键断开，两条链各自为模板， 双螺旋链的氢键断开，两条链各自为模板， 双螺旋链的氢键断开 以游离的dXTP为原材料，根据碱基互补的规律，酶 为原材料， 以游离的 为原材料 根据碱基互补的规律， 促合成新的互补链，合成两条DNA双螺旋链。新合 促合成新的互补链，合成两条 双螺旋链 双螺旋链中的一条链来自亲代DNA，另一 成的DNA双螺旋链中的一条链来自亲代 双螺旋链中的一条链来自亲代 ， 条链则是新合成的。 条链则是新合成的。
•
（六）真核生物DNA聚合酶 （DNA-pol） 真核生物 聚合酶 ）
• 它比原核细胞 它比原核细胞DNA复制更为复杂。将哺乳动物的 复制更为复杂。 复制更为复杂 DNA复制与 复制与E.coli相比，它具有以下特点： 相比， 复制与 相比 它具有以下特点： •1、RNA引物较小，约由 个核苷酸组成。 、 引物较小， 个核苷酸组成。 引物较小 约由10个核苷酸组成 2、冈崎片段也小，约由100～200个核苷酸组成。 、冈崎片段也小，约由 个核苷酸组成。 ～ 个核苷酸组成 原核细胞1000-2000个） （原核细胞 个 •3、复制速度较慢，每分钟约2600个碱基（细菌每分 、复制速度较慢，每分钟约 个碱基（ 个碱基 钟为16000个碱基）。这可能和组蛋白的存在有关。组 个碱基）。这可能和组蛋白的存在有关。 钟为 个碱基）。这可能和组蛋白的存在有关 蛋白的作用与解链蛋白作用相反，它可以使DNA稳定 蛋白的作用与解链蛋白作用相反，它可以使 稳定 于双股状态。 于双股状态。 4、哺乳动物DNA复制有多个起点。这对 、哺乳动物 复制有多个起点。 复制有多个起点 这对DNA链较长 链较长 而复制速度较慢的DNA复制可更为有利。 复制可更为有利。 而复制速度较慢的 复制可更为有利
2、前导链的合成 、
方向连续合成， 聚合酶Ⅲ 按5′→ 3′方向连续合成，DNA聚合酶Ⅲ催化。 方向连续合成 聚合酶 催化。
3、后随链的合成 、
先按5′→ 3′方向合成若干短片段即冈奇 先按 方向合成若干短片段即冈奇 片段，再通过酶的作用连接成长链。 片段，再通过酶的作用连接成长链。冈奇片 段延长的方向与复制叉移动方向相反。 段延长的方向与复制叉移动方向相反。
5、哺乳动物DNA聚合酶有 ，β，γ及线粒体聚合 、哺乳动物 聚合酶有α， ， 及线粒体聚合 聚合酶有 酶之分。 酶之分。 •α 与滞后链的合成有关 •β 核酸外切酶活性 与修复 有关 •γ 存在于线粒体 •δ 与先导链的合成有关 •ε 与校读、修复和填补缺 与校读、 口有关
三、逆转录作用 定义： （一）定义：
＞600KD 10-20 + 30,000 + 高 复制
对dNTP亲和力 亲和力
功能
DNA聚合酶Ⅲ (DNA polⅢ) 聚合酶Ⅲ 聚合酶 Ⅲ
这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶，它 复制过程中起主要作用的聚合酶， 这是在 复制过程中起主要作用的聚合酶 是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞ 是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞ 600kDa。整个酶分子形成一个不对称的二聚体，催 。整个酶分子形成一个不对称的二聚体， 参入DNA链的速率是最快的，约为 链的速率是最快的， 化dNTP参入 参入 链的速率是最快的 约为9000核苷 核苷 每分钟/每个酶分子 酸/每分钟 每个酶分子。 每分钟 每个酶分子。 • 在大肠杆菌染色体 在大肠杆菌染色体DNA进行复制时，DNA聚合酶Ⅲ全 进行复制时， 聚合酶Ⅲ 进行复制时 聚合酶 酶并不是单独起作用的，而是与引发体， 酶并不是单独起作用的，而是与引发体，解链酶等构 成一个复制体(replisome)。由于复制体的存在，先导 成一个复制体 。由于复制体的存在， 链和随从链可以同时复制。DNA polⅢ是由多亚基组 链和随从链可以同时复制。 Ⅲ 成的不对称二聚体， 成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链 的复制， 的复制，在φ×174的复制中观察到引发体总是伴随着 × 的复制中观察到引发体总是伴随着 DNA噜噗 噜噗(loop)的存在。 的存在。 噜噗 的存在 • 由于随从链的模板 由于随从链的模板DNA在DNA聚合酶Ⅲ全酶上绕转了 聚合酶Ⅲ 在 聚合酶 180°而形成一个噜噗，因此岗崎片段的合成方向能 °而形成一个噜噗， 够与先导链的合成方向以及复制体移动方向保持一致。 够与先导链的合成方向以及复制体移动方向保持一致。
–5′→ 3′外切酶活性：在DNA损伤的修复中可能起重要 外切酶活性： 损伤的修复中可能起重要 外切酶活性 损伤的修复
作用，对完成的 片段去除 端的RNA引物也是必须的。 引物也是必须的 作用，对完成的DNA片段去除 端的 片段去除5′端的 引物也是必须的。
DNA 聚 合 酶 活 性
（四）DNA复制的化学反应 （四）DNA复制的化学反应
为模板， 以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照 为模板 根据碱基配对原则， RNA的核苷酸顺序 其中 与A配对 ，用dCTP、 的核苷酸顺序(其中 配对)， 的核苷酸顺序 其中U与 配对 、 dGTP、dATP和dTTP4种三磷酸脱氧核苷为底物， 种三磷酸脱氧核苷为底物， 、 和 种三磷酸脱氧核苷为底物 合成与病毒RNA碱基序列互补的 碱基序列互补的DNA。由于其作 合成与病毒 碱基序列互补的 。 用与一般遗传信息流转录作用相反， 用与一般遗传信息流转录作用相反，故称之为逆 转录（反转录）作用，其酶称为逆转录酶（ 转录（反转录）作用，其酶称为逆转录酶（反转 录酶） 录酶） （reversetranscriptase）。 ）。 这种以RNA为模板合成 为模板合成DNA的反应称为在 这种以 为模板合成 的反应称为在 RNA指导下的 指导下的DNA合成。 合成。 指导下的 合成
二、DNA复制的分子机制 复制的分子机制
（一）、DNA分子的半不连续复制 ）、 分子的半不连续复制 •继DNA半保留复制学说之后，1968年R．Okazaki 继 半保留复制学说之后， 半保留复制学说之后 年 ． 发现在DNA复制过程中产生的两条 复制过程中产生的两条DNA子链，一条 子链， 发现在 复制过程中产生的两条 子链 连续合成的子链称前（ 导链（ 连续合成的子链称前（先）导链（leading strand）， ）， 另一条不连续合成的子链称滞后链（ 另一条不连续合成的子链称滞后链（lagging strand）。两条子链的合成方向都是 ）。两条子链的合成方向都是 ）。两条子链的合成方向都是5′→3′。滞后链 。 是一些不连续的片段称冈崎片段（ 是一些不连续的片段称冈崎片段（Okazaki fragments）。 ）。 •原核细胞的冈崎片段约为 原核细胞的冈崎片段约为1000～2000个核苷酸所组 原核细胞的冈崎片段约为 ～ 个核苷酸所组 真核细胞的冈崎片段约含100～200个核苷酸。 个核苷酸。 成，真核细胞的冈崎片段约含 ～ 个核苷酸 这些片段由DNA连接酶（DNA ligase）连接成 连接酶（ 这些片段由 连接酶 ）连接成DNA 也就是所谓DNA半不连续学说。实际上半不连 半不连续学说。 链，也就是所谓 半不连续学说 续复制学说是半保留学说的补充。 续复制学说是半保留学说的补充。