八、检测口蹄疫病毒抗原的方法

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口蹄疫病毒抗体检测

2019年第7期吉林畜牧兽医·经验交流·

JingYan JiaoLiu

口蹄疫病毒抗体检测

白翠，王楠，王晶，马晓媛，于钦磊

吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062

摘要：口蹄疫是一种急性、高度接触性、烈性的传染病，是由口蹄疫病毒引起的，常常发生在偶蹄动物，偶尔也见

于人和其它动物。世界动物卫生组织已经将该病列为法定申报传染病，我国将其列为一类动物疫病。我国主要通过

实施强制免疫来预防控制该病，疫苗免疫之后所产生的抗体水平是评价免疫效果的重要手段，也可以根据免疫后的效果来制定合理免疫程序。本实验室主要通过口蹄疫液相阻断和3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒来进行抗体检测。

关键词：口蹄疫；ELISA；抗体检测

我国口蹄疫病毒流行毒株主要为A型、亚洲I型和O型，其中O型口蹄疫病毒基因型众多，流行广泛，严重危害畜牧养殖业发展[1]。

1 液相阻断ELISA方法进行抗体检测

液相阻断是应用双抗体夹心法，其试验过程是抗原吸附在载体上，也就是我们常说的包被，包被后加入待测抗体，反应后加相应酶标记抗体，生成抗原抗体复合物，再与底物发生显色反应。最后通过酶标仪的光谱吸收，测量OD值，计算抗体的量。

本实验室的试剂盒主要是使用兰州兽医研究所（兰兽研）研制开发的，该试剂盒与其它同类型试剂盒相比，许多项指标都已达到了世界口蹄疫参考实验室的同类产品水平，符合率极高。

液相阻断的难点重点在于被检血清的稀释倍数，这个在试剂盒说明书上有具体操作步骤，实验室操作人员可根据说明书进行10份或20份样品的操作。

2 3ABC非结构蛋白抗体检测

两种口蹄疫免疫抗体监测方法的比较

６试验结果判定比较
合阳性血清的多少反推出待检血清中特异性抗体
的数量。总之它是通过一系列链式抗原抗体反应来判断被检血清中的口蹄病预防控制中心，沈阳链一沈阳市动物疫疫抗体是否阻断了这个
式反应。而口蹄疫正向间接血凝试验是直接通过红血球的凝集现象来判断。２试验器材不同
３所需试剂不同
仪读，需要与计算出来的临界值相比两种口蹄疫免疫，出原始ＯＤ值后，较才能计算出结果计算结果较相对复杂。
７试验成本比较
正向间接血凝试验做口蹄疫抗体监测每份试剂需８元左右，应用液相阻断ＥＩＡ试验（盒而ＬＳ每
ＥＩＡ试验的６ＬＳ个操作步
曹
丽
的大量应用，现将两者不同之处作以比较，同仁共
参考。
１两种试验原理差别
骤中，步的在每抗原抗体血来自百度文库反
应过程中都需要将所需试剂做不同倍数的稀释，中间
口蹄疫正向间接血凝试验原理主要是将口蹄
正向间接血凝试验只需准备９Ｌ１０６孑１。Ｖ型血凝反应板，微量振荡器、量移液器。而液相阻断微

家畜传染病学实验指导：口蹄疫的实验室诊断

实验十六口蹄疫的实验室诊断

目的

初步掌握口蹄疫的反向间接红细胞凝集试验，补体结合试验，琼脂扩散试验等血清学诊断技术。

内容及方法

当根据临诊和流行病学诊断为口蹄疫后，应进一步确定病毒的型，因为疫苗及血清的正确使用有赖于定型。病毒型鉴定的方法有以下几种。

一、口蹄疫病毒感染相关抗原琼脂免疫扩散试验

本方法用于检测被检动物血清中是否含有口蹄疫病毒感染相关(VIA)抗体(口蹄疫多型抗体)，以证实被检动物是否感染过口蹄疫病毒。本试验适用于易感动物的检疫、疫情监测和流行病学调查。

(一)材料准备

1．Tris一盐酸缓冲液

Tris 2.42g

Nacl 3.8 g

NaN3 0.2g

无离子水加至100ml，用HCl调pH至7.6。

2．器材平皿(直径5.5 cm)、吸管、金属打孔器外径4mm、模板，在有机玻璃板上按以下规格打孔，一个中心孔和6个外周孔，所有孔的直径为4mm，中心孔边缘到外周孔的距离均为4mm。

3．VIA抗原见使用说明书。

4．标准阳性血清．用A或O型口蹄疫病毒高免兔血清。

5．微量流射器或盐水接头若干及乳胶头。

6．印相暗盒或台灯(供观察沉淀线用)。

(二)操作方法

1．被检血清和阳性血清均以56℃灭能30min。

2．琼脂糖平板的制备取琼脂糖1g，Tris—盐酸缓冲液100ml，装入三角瓶中，于沸水中加热或高压，将琼脂糖彻底融化。然后吸取7ml琼脂液加到平皿里，制成3mm厚的琼脂板。待琼脂完全凝固后，加盖置于湿盒中，贮藏在4℃冰箱中备用。

3．打孔将模板放在琼脂板上，用打孔器通过模板的孔在琼脂板上打孔，并挑出孔中的琼脂块。

口蹄疫的诊断及防治方法

前言

口蹄疫病毒(foot and mouth disease，FMDV)作为人畜共患的急性接触性传染病，在世界许多国家和地区广泛流行。在国际贸易日趋繁荣、物资交流和旅游活动日益便捷的情况下，很多国家都有可能再度遭到口蹄疫的侵袭。口蹄疫严重危害畜牧业的发展，给牧区造成严重的经济损失，也可使对外贸易和旅游业遭受惨重损失。全世界每年由此造成的经济损失可达数百亿美元，口蹄疫的暴发已经影响到国际关系、国家名誉和经济发展，在某些流行过程中病毒还可发生变异，也给防控和消灭口蹄疫带来困难。

【摘要】由口蹄疫病毒引起的偶蹄兽的一种急性热性高度接触性传染病。本病传染性极强，发病率几乎达100%，往往造成广泛流行，引起巨大的经济损失和社会影响。了解其病毒的本质和流行规律、病源及传播方式、临床诊断的表现及防治措施等对该病的控制有现实意义。本文对其国内外的研究做一综述，为口蹄疫的防治工作提供基础依据。

【关键词】口蹄疫流行诊断防治

【正文】

1.口蹄疫(FMDV)的简介

口蹄疫病毒(FMDV)属微RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，有个血清型和65个以上的亚型。是引起多种动物发生口蹄疫的病原。

1.1病毒特性

病毒颗粒呈球形，二十面体对称，无囊膜，核酸类型为单股正链RNA，核酸分子量2.4～2.8-l×106d，长2.62um，呈细丝状，有感染性，并能起而RNA作用。病毒在胞浆内增殖。

FMDV具有四种主要多肽，即VP1、VP2、VP3、VP4。

FMDV在血清学上分为7个型，即A、O、C、SAT，(南非1型)、SAT2(南非2型)、SAT3(南非3型)和AsiaⅠ(亚洲1型)，每一型又有许多亚型。目前7个型至少可分为65个亚型，其中A型有32个，O型有11个，C型有5个，SAT1有7个，SAT2有3个，SAT3有4个，Asia I有3个。各型间无交叉免疫原性，在同型内的亚型间有部分交叉免疫原性。病毒型和亚型的鉴定主要根据抗原差异，不同型之间完全没有抗原关系，可用各型标准血清来鉴定病毒型。

简述口蹄疫免疫抗体监测的方法及意义

一、检测方法

特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。

1.中和抗体

中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。

病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。

2、结构蛋白抗体

在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原

含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。

中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测动物组织中的口蹄疫病毒

疫病防治ＬＩＶＥＳＴＯＣＫＡＮＤＰＯＵＬＴＲＹＩＮＤＵＳＴＲＹＮｏ．７，２０２３应用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测动物组织

中的口蹄疫病毒

叶尔保勒，阿斯喀·夏热甫汉

伊宁海关技术中心，新疆伊宁８３５０００

摘　要　为探究ＲＴ－ＰＣＲ技术在口蹄疫病毒中的应用，采集４家养殖场不同猪、牛、羊群血清样本共３００份，检测口蹄疫Ｏ／ＧＸ／０９－７株，按照病料处理、标准品ＲＮＡ制备、ＤＮＡ的聚合酶链式扩增、回收纯化、感受态细胞制备、阳性菌液保存步骤，以仪器（试剂）默认值为参考，判断检测结果。检测结果表明猪阳性率病例数为２例，阳性病例占比为１．９２％（２／１０４），牛羊阳性率较低，各为１例，阳性病例占比分别为０．９８％（１／１０２）、１．０６％（１／９４），总检出率１．３３％（４／３００）。相关部门和技术人员应根据口蹄疫检测结果，依据阳性病例数量、日龄、高发时段、高发动物类型等，第一时间做好消毒、扑杀、净化等一系列处理工作，以进一步控制疫情蔓延。

关键词　口蹄疫病毒；ＲＴ－ＰＣＲ技术；检测；优势

ｄｏｉ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０２３．０７．０２９

!　引言

口蹄疫主要由口蹄疫病毒而引起，该病毒为当前世界已知最小的动物病毒，主要发生于偶蹄兽中，是一种热性、急性传染病，具有高度接触性面源传染特点，患病动物口腔黏膜、乳房皮肤、蹄部和舌面部发生溃烂与水疱，因此也被称为口疮、蹄癀，一旦大规模发生将直接降低畜禽养殖质量和养殖场经济效益。而在众多病毒检测方法中，ＲＴ－ＰＣＲ技术凭借高灵敏度、高特异性、易操作、一步法可检测大量样本、环境污染小等优势，被广泛应用于动物口蹄疫病毒检测中，以保证相关部门能在第一时间发现、清除与净化口蹄疫病毒，最终保证畜禽健康养殖，避免疫病流行。"　(,-&'(技术简介

口蹄疫疫苗146S检测方法研究进展

分析后计算１４６Ｓ峰区面积和比重，所得疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗等，
数据有显著差异，Ｓｈｉｒａｉ认为可用这种在此基础上我国形成了比较完善的方法来代替动物攻毒保护『生试验，从多口蹄疫灭活疫苗质量监控体系。近
１４６Ｓ抗体，并利用这一特性进行单向疫疫苗进行逐批检验，这就要求疫苗免疫扩散试验检测疫苗中的ｌ４６Ｓ抗厂家必须进行严格的质量监控，积极原，提出可以与本动物攻毒保护性试配合兽药监察检验机构的工作，加强
科技与推广ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｍｏｔｉｏｎ
☆ 中国畜牧业
对口蹄疫疫苗中各血清型病毒的主要度梯度法定量检测口蹄疫１４６Ｓ抗原，４６Ｓ粒子的含量都有具体的操作较为复杂，对仪器设备有较高要１．补体结合试验。１４６Ｓ病毒粒免疫原１求，而且不能进行大批量检测，这对子是口蹄疫的主要免疫原，生产过程参数和标准。中这种病毒粒子任何形式的降解都会
验比较，确定相关性，以一定大小的口蹄疫疫苗的质量控制。

口蹄疫监测诊断作业指导书

一、口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体检测酶联免疫吸附试验

1.适用范围

用于检测猪、牛、羊血清中的口蹄疫病毒VPI结构蛋白抗体，与猪、牛、羊口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒联合使用，可区分口蹄疫病毒感染动物及疫苗免疫动物。检测猪血清应用猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒；检测牛、羊血清应用牛、羊口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒。

2.检测试剂

口蹄疫病毒VP1抗原包被板、样品稀释液、酶结合物、阴性对照、VP1阳性对照、酶结合物稀释液、TMB底物A液、TMB底物B液、终止液（l.OMHZSO。）、浓缩洗涤液、稀释板、一次性封板膜、微孔定位标签。

3.检测步骤

3.1使用前将试剂盒恢复到室温，避免阳光直射或放置在30℃以上的环境中。

3.2取出试剂盒中的样品稀释液。A1、B1两孔作为阴性对照，Cl、D1两孔作为阳性对照孔，其余孔作检测孔，每孔一个样品。

3.3在稀释板的各孔中加200样品稀释液。在相应各孔中分别加入10此对照血清或被检血清样品。用加样器重复吹吸数次。稀释每

个样品时必须使用不同的吸头。

3.4取出抗原包被板。

3.5分别从稀释板上取稀释后的对照血清和被检血清各100此，加至抗原包被板的相应孔中，加益或封膜后，置37士2℃下孵育60士5分钟。

3.6洗涤工作液配制：按需要量，用去产离子水或双蒸水将洗涤液作25倍稀释。

3.7用洗涤工作液洗涤抗原包被板，每孔300吨，洗涤6次，拍干。

3.8酶结合物工作液配制：用酶结合物稀释液将酶结合物作100倍稀释，现配现用。

口蹄疫疫苗抗原含量检测方法

作者：赵颖慧何召庆

来源：《兽医导刊》 2015年第11期

赵颖慧何召庆/ 中国动物保健有限公司

口蹄疫（Foot-and-Mouth disease virus，FMDV）是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病，对畜牧业有着巨大的危害。目前大多数国家采取计划免疫为主的

措施预防和控制口蹄疫，口蹄疫疫苗的质量是保证控制措施实施的重点，而抗原含量直接决定

口蹄疫疫苗的质量和免疫效力。

口蹄疫疫苗的生产需要按照GMP 要求对工艺流程实行全程监控，包括病毒液收获、病毒液

过滤、灭活、浓缩之后活病毒或灭活病毒含量的监测，对于口蹄疫抗原含量的检测分为生产过

程中的检测及成品疫苗中抗原量的监督控制。鉴于我国目前的特殊情况，急需建立一种检测口

蹄疫病毒灭活疫苗中病毒抗原含量的实验室检测方法, 配合其它方法以提高口蹄疫疫苗质量监

管力度, 确保我国重大动物疫病强制性免疫防控措施的贯彻执行。

一、ELISA 方法

用纯化好的FMDV 灭活抗原对Balb/c 系小鼠进行三次免疫，首免采用颈背部皮下多点注射，使用弗氏完全佐剂乳化抗原；两周后采用腹腔注射进行第二次免疫，使用弗氏不完全佐剂乳化

抗原；两周后采用尾静脉注射再进行加强免疫；3 d 后进行融合。采用经典的融合方法进行杂

交瘤细胞的融合与筛选操作，使用间接夹心ELISA 方法对分泌抗口蹄疫146 S 抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞进行检测。采用有限稀释法对筛选出来的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，并进行扩

大培养及大量冻存，使用腹水法大量生产单抗。使用间接ELISA 法测定腹水型单克隆抗体及细

免疫层析技术在口蹄疫POCT中的应用研究

免疫层析技术在口蹄疫POCT中的应用研究口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种高度传染性疾病，广泛流行于猪、牛、羊等偶蹄类动物中，给畜牧业带来了严重的经济损失。因此，及早、

快速、准确地对口蹄疫病毒进行检测具有重要意义。免疫层析技术（Immunoassay）是一种基于抗体与抗原的特异性反应的检测方法，在口

蹄疫POCT（Point-of-Care Testing）中也得到了广泛的应用。本文将重

点介绍免疫层析技术在口蹄疫POCT中的应用研究。

口蹄疫病毒的快速检测主要是针对病毒衣壳蛋白（VP）进行的。可以

使用免疫层析技术制备VP的特异性抗体，将其固定于试纸上的特定位置。在样本中加入病毒衣壳蛋白，则衣壳蛋白与特异性抗体发生特异性的结合

反应。然后通过信号标记的方式（如胶体金标记、碳纳米管标记等）产生

可见的结果，从而确定样本中是否存在口蹄疫病毒。这种方法具有操作简便、快速、便携、结果直观等特点，在现场或者偏远地区也可以进行检测。

另外，免疫层析技术还可以用于口蹄疫病毒抗体（IgM和IgG）的快

速筛查。在感染后，机体会产生特异性的抗体来抵御病毒的侵袭。因此，

通过检测口蹄疫病毒抗体可以判断动物是否感染了病毒。免疫层析技术可

以制备口蹄疫病毒抗体的特异性抗原，将其固定在试纸上的特定位置。当

样本中存在特异性抗体时，抗原与抗体发生特异性的结合反应。通过信号

标记的方式（如胶体金标记、碳纳米管标记等）产生可见的结果，从而确

定样本中是否存在口蹄疫病毒抗体。这种方法同样具有操作简便、快速、

便携、结果直观等特点。

值得一提的是，免疫层析技术在口蹄疫POCT中的优势还有一些其他

口蹄疫灭活疫苗146S_抗原含量测定及疫苗质量评估

DOI：10.16174/j.issn.1673-4645.2023.03.014

收稿日期：2022-12-08

作者简介：高旭（1971-），甘肃庆阳人，总经理，主要从事兽用生物制品质量控制与企业管理

通信作者：王江辉（1983-），河南灵宝人，技术服务总监，主要从事动物疫病防控技术与兽用生物制品研发

口蹄疫灭活疫苗146S 抗原含量测定及疫苗质量评估

高

旭1李浩欣1郭龙飞1王江辉2*

(1申联生物医药(上海)股份有限公司,上海210424;

南京农业大学,江苏南京210095)

摘要:世界范围内预防口蹄疫的有效方法是进行疫苗免疫,因此,口蹄疫疫苗的质量成为预防口蹄疫的关键,口蹄疫疫苗中146S 的含量直接决定口蹄疫疫苗的质量和免疫效力。蔗糖密度梯度离心法(sucrose density gradient cen⁃trifugation,SDGC )是公认的经典测定口蹄疫146S 抗原含量的方法,但存在检测耗时长、过程复杂、重复性差等缺点,影响疫苗的质量检测。使用高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC )检测口蹄疫灭活疫苗146S 抗原含量,是一种简便、快速、高效、干扰少的测定方法。申联生物医药(上海)股份有限公司(以下简称“申联生物”)通过市场调研,检测了23份市场流通的口蹄疫灭活疫苗,使用HPLC 法检测,其中22份146S 含量满足国家要求,合格率为96.65%,但不同企业不同批次疫苗146S 含量之间仍存在较大差异。关键词:高效液相色谱法;口蹄疫灭活疫苗;146S 中图分类号:S828;S852.65

口蹄疫病毒抗原

口蹄疫病毒抗原ELISA、病毒分離及RT-PCR敏感性之比較

報告人：黃郁珳助理研究員（豬瘟研究組）

壹、緒言

口蹄疫(Foot and mouth disease；FMD)是㆒種急性偶蹄類動物傳染病，會造成嚴重之經濟損失。口蹄疫病毒(FMDV)是屬於正股單鏈RNA病毒，歸類於小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)、口瘡病毒屬(Aphthovirus)。FMDV共㈲O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3等㈦種血清型，各血清型病毒間無交叉免疫保護作用。而口蹄疫的實驗室診斷以抗原鑑定為主，目前本所使用的口蹄疫抗原鑑定方法包括病毒分離(Virus isolation)、抗原-酵素結合免疫吸附試驗(antigen enzyme-linked immunosorbent assay；Antigen-ELISA)、反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction；RT-PCR)等。病毒分離是根據世界動物衛生組織（O.I.E）出版的「陸生動物的診斷測試及疫苗手冊」㆗口蹄疫的抗原診斷方法進行，以單層BHK21及EBK等㈱化細胞分離試材㆗的口蹄疫病毒。而抗原-酵素結合免疫吸附試驗則是利用抗原抗體間專㆒性鍵結的㈵性，檢測所稀釋試材㆗的口蹄疫病毒抗原，且鑑定其血清型別。反轉錄聚合酶連鎖反應是利用㆒對方向相反的寡核苷酸引子，先利用反轉錄酶將待測RNA轉錄成cDNA，再經由DNA聚合酶的作用，反覆進行變性作用、煉合作用及延展作用等㆔步驟，而將㈵定的DNA片段大量複製，從而提升檢測病毒核酸之敏感性達百萬倍之多。由於口蹄疫疫情的控制，首重快速而準確的診斷。本所目前使用的㆔種口蹄疫診斷技術均是世界動物衛生組織（O.I.E）出版的「陸生動物的診斷測試及疫苗手冊」㆗所列舉之檢測方法，但是該手冊㆗並未針對其敏感性詳加描述，然而，在初步的診斷結果㆗，敏感性與診斷的準確度相關，若敏感性太低，將造成假陰性的診斷結果。因此，為了解此㆔種口蹄疫診斷技術之敏感性，乃進行此㆒實驗。

牛羊O型口蹄疫ELISA试验的抗体检测

622023.8

牛羊O型口蹄疫ELISA试验的抗体检测

高　波

（瓦房店市动物疫病预防控制中心，辽宁瓦房店 116300）

口蹄疫是由口蹄疫病毒引发的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫是人畜共患传染病，被国际兽医组织确定为一类传染病，主要侵害偶蹄兽，它的临诊特征为体温升高、精神不振、流涎，在唇部内面、齿龈、舌面、蹄部、乳房处皮肤出现水疱，水疱逐渐破裂后，体温达到正常。口腔内出现水疱期间，趾间、蹄冠的较软皮肤也出现水疱，破裂的水疱短时间形成烂斑，随后逐渐康复，若护理不当，激发感染化脓菌，形成溃疡坏死，甚至会出现蹄甲脱落。有的病牛在康复过程中，病情由好转变为加重，全身衰竭，心脏停搏而死亡。此病传染性极强。感染后传播速度快，对人畜危害严重，因此，做好此疫病的预防、控制、消灭措施显得格外重要。

口蹄疫病预防主要是通过疫苗的免疫使牛羊体内产生抗体，来保护牛羊不再发病，免疫质量好坏决定抗体的保护程度。通常采用酶联免疫液相阻断法检测牛、羊血清中的口蹄疫O型抗体。检测出抗体的OD值，通过OD值来判断牛羊抗体的保护率。如果抗体的OD值下降，已经不在保护范围内，就应该立即进行牛羊的疫苗免疫接种。不及时免疫，有可能造成牛羊发病，直接造成养殖户的经济损失。

现接到检测任务，需要将20份牛血清做O型口蹄疫抗体检测，介绍如下。

1 检验原理

采用酶联免疫液相阻断法。牛羊待检样品中O型抗体的含量与显色OD值呈负相关，通过与病毒抗原对比来判断抗体效价。试剂盒在22℃的实验室回温1小时。利用回温时间准备试验用的器材。100微升单道移液器、12道移液

检测口蹄疫血清抗体的方法

〔一〕口蹄疫正向间接红细胞凝集试验〔间接血凝试验〕

该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物〔细胞毒〕经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。

该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。

1．试验材料 V型96孔110。医用血凝滴定板、玻璃板〔与血凝板大小相同〕、微量移液器〔10~100微升〕、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管〔内径1.5毫米，长度100毫米〕、铝质试管架〔40孔〕、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。

2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。

（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法

接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。

①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升参加第1孔，混匀后从中取出50微升参加第2孔，混匀后从中取出50微升参加第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：

64、1：128、1：256。

②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液1.5毫升，再加阴性血清0.1毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。

③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液3.1毫升，第2~5管分别加稀释液0.5毫升，取阳性血清0.1毫升参加第1管混匀后从中取出0.5毫升，参加第2管混匀后从中取出0.5毫升，参加第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。

口蹄疫病毒粒子检测方法

常用方法

一、蔗糖/氯化铯梯度密度梯度超速离心法

原理：146S抗原在特定条件下分布在特定浓度的介质中，于259nm处产生最大紫外吸收峰（用OD259表示），OD259与146S浓度成正比。

操作步骤：将口蹄疫病毒样品置于蔗糖密度梯度中离心，在离心力的作用下，样品中的病毒粒子将沉降到相应的密度梯度层内，经紫外分光光度计259纳米检测时有最高吸收峰，而在其他级份层没有吸收峰。收集146S吸收峰级份，用紫外分光光度计进行检测，即可对146S含量进行定量。采用这种简单的方法可以快速测定出在紫外分光光度计图表中病毒峰区域的146S病毒粒子含量，并且可以用于监测生产过程中病毒和抗原的收获量，当然也可以用于成品疫苗中146S抗原含量的测定。

此法的优点是：简单，检测所需的成本低

此法的缺点是：受人为影响大，不能分型检测，且操作较为复杂，对仪器设备有较高要求。

二、高效液相色谱法

原理：以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入紫外检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

此法的优点是：设备自动化程度高，人为影响少，操作简便，重复性好，成本低且耗时短，可用于大批量连续检测。

此法的缺点是：不能区别不同血清型的抗原。

三、单克隆抗体夹心ELISA定量检测法

原理：制备针对口蹄疫病毒146S特异位点的单克隆抗体，然后包被ELISA板，应用酶联免疫吸附原理，根据显色情况判定146S病毒粒子的含量。

此法的优点是：检测速度快，适合大批量检测。

检测口蹄疫血清抗体的方法

（一）口蹄疫正向间接红细胞凝集试验（间接血凝试验）

该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物（细胞毒）经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。

该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。

1．试验材料V型96孔110。医用血凝滴定板、玻璃板（与血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管（内径毫米，长度100毫米）、铝质试管架（40孔）、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。

2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。

（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法

接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。

①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，混匀后从中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：

64、1：128、1：256。

②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液毫升，再加阴性血清毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。

③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液毫升，第2~5管分别加稀释液毫升，取阳性血清毫升加入第1管混匀后从中取出毫升，加入第2管混匀后从中取出毫升，加入第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。