各细胞培养板转染配方

siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。

下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。

1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量

保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。

注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。

2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:

（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。（*siRNA的用量计算参照表1）

（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。

293细胞转染操作方法

一、转染前的细胞培养准备

1.1 细胞培养基的准备：使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基，添加10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）混合液，将其预先置于37摄氏度恒温培养

箱中加热。同时，准备冰上的无血清DMEM培养基。

1.2 细胞传代：将293细胞稳定传代到80%的密度，并将细胞分装到

培养皿中。培养皿通常使用直径为6 cm的培养皿。

1.3 细胞接种：将培养皿中的细胞用10 ml DMEM培养基吸取，将细

胞均匀分布在一个新的培养皿中。

1.4细胞培养：将新的培养皿放入37摄氏度恒温培养箱中，在5%CO2

和95%湿度条件下培养。

二、转染试剂的准备

2.1 转染物质的选择：根据实验需求，选择合适的转染试剂，如磷脂

体试剂（Lipofectamine 2000）、Calcium Phosphate（CaPO4）沉淀法、

聚乙烯亚胺（PEI）等。

2.2转染载体的制备：将所需的转染载体提取并纯化，测定其浓度和

纯度。

2.3试剂的稀释：按照转染试剂说明书的要求，将其稀释至适宜浓度。

三、转染操作的步骤

3.1细胞处理：在进行转染操作前，需要将细胞从培养皿中用无酶消化的方式将其析出，溶于含血清和无血清的培养基中，计算细胞的数量和体积，用无酶消化的方式将其析出。

3.2细胞分装：将分装的细胞放入每个培养皿中，并用光学显微镜观察细胞的黑暗度和数量。

3.3准备转染混合物：将适量的转染载体与转染试剂混合，置于室温静置15-30分钟，使其相互作用发生。

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection

以24孔板为例，其余规格的转染见表1

1 中板，细胞密度为30-50%适宜。

注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。

2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：

A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Plasmid DNA Transfection

DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3

转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。

1 中板。

贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染

悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。

2 转染。

A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

lipo2000转染protocal6孔板中文

转染6孔板

1、转染前一天，接种到6孔培养板上。（4*105/ml.）

转染时，细胞要达到90~95%的融合。细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2、溶液A：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。

3、溶液B：246 ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）（此为推荐剂量）

｛摸5个梯度分别是4 ug 质粒：4ul lipo，

4ug 质粒：6ul lipo

4 ug 质粒：8ul lipo

4ug 质粒：10ul lipo

4ug 质粒：12ul lipo

4、将溶液A与溶液B混合，室温下置20min。

5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。

6、将溶液A与溶液B的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。

7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h 检测转染水平。

8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。

分子实验室、细胞实验室常用配方

（一）WB相关试剂及常用缓冲液

●

●10%过硫酸铵溶液AP（分装保存于-20度）

AP粉末 1g

ddH20 10ml

●10％SDS（十二烷基硫酸钠）：

SDS粉末 10g

ddH20定容到 100ml

注意：用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡

●6X蛋白质sample buffer

Tris-HCl(1M,pH6.8) 30mL

SDS 10g

甘油 30mL

DTT（154.25） 9.3g

溴酚蓝 0.06g

dd H20 定容至100mL

●10XPBS缓冲液的配制：

NaCl 80g

KCl 2g

Na2HPO4 14.4g（十二水合36g）

KH2PO40 2.4g

加800 mLddH2O,根据开始的pH用NaOH或HCL调pH到7.4，调好pH再定容到1升。配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度

●PBST(1X)

PBS(1X) 500ml

Tween 20 500μl

●50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液配制1L溶液各成分的用量

Tris粉末 242g

冰醋酸 57.1ml

Na2EDTA·2H2O 37.2g

ddH20定容到 1L

●封闭液

脱脂奶粉 5g

叠氮钠 0.02g(现配现用时可不加)

PBS 定容到100mL

●脱色液：(室温)

甲醇 165mL

乙酸 50 mL

H20 785 mL

ddH20 定容至1L

●TBST(1X)

TBS(1X) 500ml

Tween 20 500μl

●Stripping buffer(可反复利用)温老师组配方

10%SDS 10ml

Β-巯基乙醇 350 l

Tris-HCI（pH6.8） 6.25ml（6.06加到50mL水）

细胞转染与筛选

细胞转染与筛选方法总结

细胞转染：对数期生长的U251细胞经含EDTA的0.25%胰酶消化后，细胞计数，接种于六孔板，每孔种植2×105个细胞，加2ml/孔完全培养基培养过夜，弃去培养基，PBS 洗3次，加入2ml/孔OPTI-MEM培养基。将3μl FUGENE HD加入94μl空白OPTI-MEM培养基中，混匀，室温放置5min，加入PEGFP-N1或PEGFP-LRIG1质粒体2μg，混匀，室温放置10min，加入六孔板中。六小时后，将细胞培养基换成DMEM完全培养基。

细胞筛选：转染后36h, 荧光显微镜下观察细胞转染情况，48h后加入G418，其终浓度为1000μg/ml。放入细胞培养箱继续培养，每两天换液，重新加入G418。待正常组细胞全部死亡（约15d）将G418浓度调整至500μg/ml，继续培养2周后，长出抗性克隆，挑取单个克隆，在96孔板中扩增，培养2周后，单个克隆已经长满整个孔，将细胞消化后转入6孔板，使用完全培养基继续培养，继而进行其他指标的检测。

细胞转染操作方法

转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

SiRNA转染protocol

siRNA转染SOP

1.细胞种板：24孔板中以5x105 细胞/孔密度进行接种（6孔板或96

孔板接种密度进行相应调整），接种孔数根据具体实验方案进行确定，接种后置于37℃，5%CO2培养箱中培养12h-16h；

2.细胞生长融合度达85-90%后即可准备进行siRNA转染，实验每组

设置3个复孔，siRNA以Nuclease-Free Water稀释至储存液浓度（浓度按照说明书指示，通常为20 μM）；

3.根据siRNA终浓度进行溶液配制（以下溶液配制以50 nM为siRNA

最终浓度，24孔板中终液体体积为500 μl为例），溶液1配制：每孔1.25 μl siRNA储存液以无血清无双抗培养基稀释至25 μl，按此比例依照孔数进行扩大，将最终液体进行充分混匀；溶液2配制：每孔2 μl Lipo 2000转染试剂（可用其他替代，用量参照说明书推荐或自行优化）以无血清无双抗培养基稀释到25 μl，按此比例依照孔数进行扩大，将最终液体进行充分混匀；上述2种溶液混匀后分别室温静置5 min；

4.将溶液1滴加至溶液2中并进行充分混合（每孔为50 μl），室温静

置20-30 min；

5.此期间可将细胞从培养箱中取出，弃去培养基，用PBS进行清洗3

次，末次清洗干净后将所有液体小心吸出，尽量不要有残留；6.静置完成后，将上述混合液滴加进去24孔板中，每孔50 μl，注意

滴加不要过快，以防冲起细胞，滴加完成后每孔加入450 μl无血清无双抗培养基，充分混匀，将板放入37℃，5%CO2培养箱中培

养6 h；

PEI转染

1.长势良好的细胞转染前一天铺板。不同培养板所需细胞数不同，见表

一。铺板后13-16小时转染最佳。待转染时，细胞融合度应在50%-80%。

2.PEI与DNA转染质量比为2.5:1。6孔板DNA转染量为3~4μg，其他

培养装置所需量见表一。取对应量的培养基，先加入DNA轻轻混匀，之后加入所需量的PEI轻轻混匀，室温静置20分钟。

3.将已经形成的复合物，均匀地滴加到培养板孔中，“十字型”轻轻地

摇晃混匀，放入培养箱中常规培养。

4.4~6小时后预热培养基，换夜。24~48小时后观察转染效率。

表一不同细胞培养装置的推荐用量

[说明]转染详细步骤大攻略

转染详细步骤大攻略

范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达

按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。具体操作步骤如下: 1)质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下:

(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。(注:如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低)

(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。(注:混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏)

(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。(注:溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清)

细胞转染与筛选

细胞转染与筛选方法总结

细胞转染：对数期生长的U251细胞经含EDTA的0.25%胰酶消化后，细胞计数，接种于六孔板，每孔种植2×105个细胞，加2ml/孔完全培养基培养过夜，弃去培养基，PBS 洗3次，加入2ml/孔OPTI-MEM培养基。将3μl FUGENE HD加入94μl空白OPTI-MEM培养基中，混匀，室温放置5min，加入PEGFP-N1或PEGFP-LRIG1质粒体2μg，混匀，室温放置10min，加入六孔板中。六小时后，将细胞培养基换成DMEM完全培养基。

细胞筛选：转染后36h, 荧光显微镜下观察细胞转染情况，48h后加入G418，其终浓度为1000μg/ml。放入细胞培养箱继续培养，每两天换液，重新加入G418。待正常组细胞全部死亡（约15d）将G418浓度调整至500μg/ml，继续培养2周后，长出抗性克隆，挑取单个克隆，在96孔板中扩增，培养2周后，单个克隆已经长满整个孔，将细胞消化后转入6孔板，使用完全培养基继续培养，继而进行其他指标的检测。

细胞转染操作方法

转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

lipo2000转染protocal6孔板中文

转染6孔板

1、转染前一天，接种到6孔培养板上。（4*105/ml.）

转染时，细胞要达到90~95%的融合。细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2、溶液A：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。

3、溶液B：246 ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）（此为推荐剂量）

｛摸5个梯度分别是4 ug 质粒：4ul lipo，

4ug 质粒：6ul lipo

4 ug 质粒：8ul lipo

4ug 质粒：10ul lipo

4ug 质粒：12ul lipo

4、将溶液A与溶液B混合，室温下置20min。

5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。

6、将溶液A与溶液B的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。

7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h 检测转染水平。

8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。

细胞转染与设计的原则

磷酸钙-DNA共沉淀法

核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na2PO4、2H2O

加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。

(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L

注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

2、操作步骤[方法一]：

(1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE 中，40mg/L。

(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为

细胞铺板

细胞铺板：

Day1，细胞长至85-95%时传代，24孔板每孔铺1.5X105细胞，加入900ul培养基；

Day2，24h之内做质粒转染，以上细胞量大约细胞密度为35%-45%；

24孔板细胞转染：

1. 转染前准备工作：1XPBS、无血清无PS的DMEM预热；操作台面、移液器紫外灭菌15min；

2. 转染前一小时：吸去原来的培养基，用1XPBS洗一次，然后换成900ul 无血清无PS的DMEM培养基，放入培养箱中；

3. 配制DNA稀释液：准备1.5ml EP管，加入50ul Opti-MEM，再加入1ug 大提质粒，弹EP管15-20下混匀；

4. 配制PEI稀释液：准备1.5ml EP管，加入50ul Opti-MEM，再加入X ul PEI（1mg/mL），弹EP管25-35下混匀；室温孵育5min；

5. 将DNA稀释液加入PEI稀释液中，并用枪头吹打15-25下混匀；再弹15-25下EP管混匀；

6. 室温孵育20-25min；

7. 将混合液逐滴加入孔中，均匀滴在孔面的各处，摇晃孔板扩散混匀；

8. 8h后将培养基换成DMEM+10%FBS+1%PS培养基；

9. 24h后观察转染效率。

细胞培养兼转染步骤

细胞复苏

1 •准备好超净台、吸管、离心管、40C的水

2.从液氮中取出要复苏的细胞，置于准备好的37° C中速溶（剧烈摇晃）

3.5ml的离心管中加入4ml的完全培养液（DMEM+抗+血清）即平时用于传代

的10%FBS勺培养液，再加入溶解的细胞液

4.lOOOrpm, 5min,离心，平时常用900rpm 5min.

5•弃上清，加入4ml的完全培养液，吹散细胞

6.分装两瓶中，然后每瓶补充培养液至卫nl/瓶

7.37 C二氧化碳培养箱松盖培养，48h|n做传代

二.细胞传代

1.培养48h内的细胞，若瓶壁上已长满细胞则应进行传代

2.吸去瓶内的培养液

3.加入lml的EDTA让EDTA可以铺过所有细胞，约作用10s

4.吸去EDTA加入lml的0. 25 %的胰酶，让胰酶没过所有细胞（可轻轻晃动）,作用约

2mino在显微镜下观察细胞，若已由成片的细胞变成单个细胞，则消化完成

5.吸去胰酶，加入4ml的培养液。用lml的吸管吹打瓶壁，让细胞脱落，吹打成单个

细胞悬液

6.将细胞悬液分成两瓶，并将每瓶培养液补充至5ml

7.37 C二氧化碳培养箱松盖培养，48h后做传代

•细胞冻存

传代至数瓶的细胞且长满瓶壁即可传代和冻存

1 •把细胞消化（与细胞传代步骤相同），计数。把细胞悬液合并到5ml离心管中，混

匀、lOOOrpm,离心5min

2.弃上清，依细胞数加入培养液（冻存管每管细胞数要达到4X ICT个）

3.分装到冻存管内（冻存管要预先冷却）

4.细胞冻存液的成分为：DMSO 100ul培养液600 ul （细胞悬液），血清300ul

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection

以24孔板为例，其余规格的转染见表1

1 中板，细胞密度为30-50%适宜。

注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。

2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：

A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Plasmid DNA Transfection

DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3

转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。

1 中板。

贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染

悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。

2 转染。

A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

细胞转染步骤

细胞转染及其筛选

1.传代：细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘

向6cm盘中加入3ml培养基,“米”字形摇晃。当细胞生长到50％-70%时，根据细胞的生长速度可进行转染

2.配置转染体系:(6cm盘)

2。4ug基因载体质粒；9ul转染试剂；200ul无血清培养基.混匀后室温静置10—15min孵育。

3.将6cm盘中的旧培养基弃去，换新的培养基3ml。

4.将配置好的转染体系加入到6cm盘中，混匀6-18h内换液。

5.12小时，换液后进行显微镜拍照观察。

6.再过6h加入G418，进行筛选(始终在6cm盘中进行）,使用G418浓度：600µg/ml

G418的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒4℃保存。

7.3-5天换液一次（换液不用PBS冲洗），此时仍要加G418，浓度不变,只到细胞呈单个

细胞那种，当细胞死的过多时,可考虑药物浓度减半.筛选出稳定表达的cell。

8.挑克隆：1制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul,在96孔板中加入

培养基150ul/孔,在加入细胞悬液10ul/孔,待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm 盘增殖。

2.伴随着细胞的生长,可能最后会变成细胞簇,故可以用黄枪头把细胞菌落挑

出，放入24孔板里面。

9.单克隆鉴定:提取细胞RNA后，进行RT-PCR检测其表达量。

10.先做RT-PCR筛选一部分,在做western继续筛选一部分.

所需物品:1。转染试剂（Attractene Transfection Regent）；2.96孔板；3。24孔板；4.6孔板；