腈水合酶产生菌Rhodococc_省略_sp_HUST_1发酵条件的优化_朱婷婷

合集下载

腈水解酶重组茵发酵产酶条件的优化及应用

２１，ｏ２Ｎ．０２ＶＩ９ｏ３亿与生物互程．
Ｃｈｍｉｔｙ＆Ｂｉｅｎｉｅｉｇｅｓｒｏｇｎｅｒｎ
ｄｉ１．９９ｊｉｓ．６２４５２１．３０６ｏ：０３６／．ｓｎ１７ —５２．０２０．０
腈水解酶重组茵发酵产酶条件的优化及应用
解酶基因的工程菌Ｅ．ｏｉＬ１Ｄ３／Ｅ８（）ｃｌＢ２（Ｅ）ｐＴ２ｂ＋一
Ｒ一一）扁桃酸的生产方法主要有化学法和生物（一
法，中生物法中的腈水解酶催化法由于底物价廉、其反应条件温和、环境污染小、化率高、物光学纯度高，转产
Ｘｅ［ ¨ 通过大规模的筛选和育种，得一株ｕ等１］获高活性的立体选择性腈水解酶菌株Ａ．ａｃｌｆｅａｉｓ
ＺＵＴ１，利用该腈水解酶进行了生物催化外消旋ＪＢ０并扁桃腈生产Ｒ一一）扁桃酸的研究。用ＰＲ方法扩增（一Ｃ出Ａ．ａｃｌＪｆｅａｉＺＵＴＢ０腈水解酶基因，将其插入ｓ１并
到重视。
到表达载体ｐＴ８（中，ＰＧ诱导后，水解酶Ｅ２ｂ＋）ＩＴ腈
在大肠杆菌胞内进行了活性表达，有较高的活具
性川。，
作者在此优化了含有Ａ．ａｃｌｓＪｆｅａｉＺＵＴＢＯ腈水Ｉ

Rhodococcussp_SHZ_1腈水合酶的高酶活发酵工艺_王超

Rhodococcus sp.SHZ 21腈水合酶的高酶活发酵工艺3王　超1,2,张根林1,2,李　春3,吴　丽1,21(石河子大学食品学院,新疆石河子,832003)　2(石河子大学绿色合成与转化实验室,新疆石河子,832003)3(北京理工大学生命科学与技术学院,北京,100081)摘　要　通过研究发酵过程中溶氧、生物量、腈水合酶活力以及残糖的变化规律和搅拌速度、通气量、接种量及诱导剂对产腈水合酶的影响,确立了5L 发酵罐中Rhodococcus sp.SHZ 21腈水合酶的高酶活发酵工艺参数。

结果表明,发酵过程中溶氧控制在30%以上有利于菌体快速生长和腈水合酶的合成。

在p H 712,温度30℃的发酵条件下,适宜的腈水合酶合成工艺条件为:接种量10%,通气量110vvm ,搅拌速度采用由初始的200r/min 调至500r/min 的变速调控方式,同时于48h 补加产酶诱导剂,发酵液腈水合酶的最高酶活力达到了9500U/mL ,是摇瓶培养时最高酶活力8208U/mL 的112倍,且比未进行工艺优化时最大产酶期缩短了20～24h ,其最佳产酶期为52～60h 。

关键词　腈水合酶,诱导剂,发酵,Rhodococcus sp 1SHZ 21第一作者:硕士研究生(李春教授为通讯作者)。

　3国家自然科学基金资助项目(No.20466002),新世纪优秀人才支持计划(NCET -04-0989),新疆维吾尔自治区重点攻关项目(No.200332109)收稿日期:2006-10-30,改回日期:2007-01-22 腈水合酶((Nit rile Hydratase ,N Hase )是微生物在进行肟或脲代谢过程中产生的一种蛋白质,可以将腈类物质的腈基(-CN )催化水合为酰胺(-CON H 2)[1]。

利用这种酶催化丙烯腈(Acrylo nit rile ,AN )合成丙烯酰胺(Acrylamide ,AM )是一种安全、高效、节能的生产工艺。

腈水合酶催化反应条件的研究

腈水合酶催化反应条件的研究刘舒;沈旭丰;孙先锋【摘要】Taking the enzyme of free cell as the catalyst, the effects of dilution factor, concentration of acrylonitrile, temperature, pH value, concentration of cells and concentration of acrylmide on the activity of nitrile hydratase were studied. The result shows that the temperature, the concentration of acrylonitrile and the concentration of gcrylamide are the most important among these factors. The activity of nitrile hydratase is 4 901U/mL(broth) at the reaction temperature 28℃ t he concentration of acrylonitrile is 40g/L;the activity of nitrile hydratase in the solution of 40% acrylamide is just 40% of that in solution of 5% acrylamide. It is found that the activation energy of the nitrile hydratase is 40. 291kJ · mot1 through the research at the different reaction temperature.%以自由细胞的酶作为催化剂,研究了菌体稀释倍数、丙烯腈浓度、温度、pH值、菌悬液用量和丙烯酰胺浓度对腈水合酶活性的影响,结果表明,温度、丙烯腈浓度和丙烯酰胺浓度是影响酶活性的主要因素.反应温度在28℃时酶活性达到最大为4091U/mL菌液,丙烯腈浓度采用40g/L.当反应体系中丙烯酰胺浓度为40％时,其酶活只有丙烯酰胺浓度为5％时酶活的39.2％.对不同反应温度下酶活的研究,得出腈水合酶催化反应的活化能为40.291kJ · mol-1.【期刊名称】《纺织高校基础科学学报》【年(卷),期】2012(025)001【总页数】6页(P83-87,106)【关键词】丙烯酰胺;腈水合酶;丙烯腈;催化反应【作者】刘舒;沈旭丰;孙先锋【作者单位】西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048【正文语种】中文【中图分类】Q559在微生物转化生产丙烯酰胺的过程中，酶催化反应是关键环节，因此研究酶催化反应的条件成为必然．腈水合酶（Nitrile hydratase，EC4．2．1．84）是以硫原子和半胱氨酸－亚磺酸残基（Cysl12）为绝对中心的一类可催化腈水解的酶．随着科研人员对腈水合酶结构、催化机理、生物合成调节以及酶学性质的深入研究，腈水合酶已被成功应用于工业生产丙烯酰胺上．最早提出用微生物法生产酰胺的是法国研究者Galzy及其研究组，他们发现了一种能催化腈水解的微生物Brevbacteriu m R312，可催化合成丙烯酰胺（A M），但是酶活很低［1］．1982年，京都大学山田秀明研究组发现了Pseudomonas Chlor aphis B32，经过驯化其酶活达到1 260个单位［2］．1988年，山田秀明等发现了一种性能更好的腈水合酶产生菌Rhodococcus r hodococcus J1，其酶活达到了1 630个单位，一度成为日本酰胺生产的工程菌．高活力菌种的成功应用，使日本日东公司年产量从最初的0．4万t／a迅速提升至3万t／a［3］．采用酶生物催化剂代替化学催化剂已成为绿色化学发展的方向之一［4］．与化学法相比，微生物法制备丙烯酰胺具有反应在常温常压下进行、选择性高、活性高、能耗低、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点［5］．目前，国内用生物法生产丙烯酰胺多采用海藻酸盐包埋法固定化细胞的工艺，而该工艺本身存在通透性差、固定化细胞强度小以及引入离子等问题，另外在固定化阶段会损失相当一部分酶活．正由于酶活的损失，一批固定化的细胞往往水合反应3批左右就需要更新［6］．利用自有细胞直接进行水合反应并实现连续化生产能较好地解决以上问题．本文对诺卡氏菌Nocar dia sp．ZT－2自由细胞的腈水合酶反应条件进行了研究，以期优化酶反应条件，提高酶活性．1 实验1．1 原料丙烯腈（上海三浦化工有限公司，分子量53．06，化学纯）、丙烯酰胺（北京化学试剂公司，分子量71．08，分析纯）．1．2 实验菌株诺卡氏菌Nocar dia sp．ZT－2（从咸阳第二印染厂污水处理厂的活性污泥中筛选，由西安工程大学生物工程实验室保藏并鉴定．）1．3 培养基1．3．1 斜面培养基（g／L）牛肉膏5，蛋白胨1，Na Cl 5，琼脂4，p H 7．2．1．3．2 发酵培养基（g／L）葡萄糖20，酵母膏5，尿素6，味精（谷氨酸钠）1，KH 2 PO4 0．5，K 2 HPO4 0．5，M gSO4·7 H 2 O 0．5，Co Cl2·6 H 2 O 0．08 mmol／L，吐温80 1，p H 7．2．1．4 自由细胞的培养方法将菌株从斜面接种于250 mL发酵摇瓶中，装液量为25 mL发酵培养基，在28℃下培养96h，摇床转速为180r／min．1．5 生物量的测定将发酵液稀释一定倍数后，在460n m波长下测量吸光度值．根据测定的菌体干重和吸光度标准曲线，一个OD值相当于每L发酵液有0．45g干菌重量．1．6 操作过程1．6．1 菌悬液的制备取一定量的发酵液，在6 500r／min条件下离心8 min，弃上层清液，用p H＝7．0的磷酸缓冲液洗涤菌体．在同样条件下重复离心分离和洗涤两次，制成与原发酵液菌体浓度相等的菌悬液，冰箱保存备用．1．6．2 催化水合反应取19 mL 50 mmo L p H为7的磷酸缓冲溶液和1 mL纯丙烯腈，放入250 mL具有磨口玻璃塞的三角瓶中，恒温至28℃．取一定量的菌悬液根据具体实验要求稀释适当数倍，取1 mL于三角瓶中，准确反应5 min，然后加入1 mL 4 mol／L的盐酸终止反应［7］．1．7 酶活测定方法除在丙烯酰胺浓度对产物影响中丙烯酰胺生成量用液相色谱测定外，其余丙烯酰胺生成量及所有酶活的测定采用KBr O3－KBr法．液相色谱操作条件如下：流动相为甲醇∶水＝15∶85，流速1 mL／min，温度25℃，检测波长205n m．产物计算方法为：采用外标法以峰面积为标准配置各种浓度梯度的丙烯酰胺标准样品，拟合出丙烯酰胺标准校正曲线．KBr O3－KBr 法测定丙烯酰胺生成量及酶活：丙烯酰胺的生成量（mg）＝0．5×71．0×C（V 0－V）×V 2／V 1，酶活＝C（V 0－V）×（1／2）×V 2／V 1×1 000／t．C为Na2 S2 O3 溶液的摩尔浓度，mol／L；V 0 为空白消耗Na2S2 O3溶液的体积，mL；V为滴定样品消耗Na2S2 O3溶液的体积，mL；1／2为反应所生成Br 2与Na2 S2 O3溶液的化学计量比；V 1为反应所取上清液的体积，mL；V 2为上清液总体积，mL；1 000为mmol转换成μmol；t为反应时间，min；0．5为生成丙烯酰胺的摩尔数；71．0为丙烯酰胺的分子量．2 结果与讨论表1 菌液稀释倍数与酶活稀释倍数4 8 12 16 20 30 40酶活／U·mL－1 2 853 2974 2 910 2 737 2 658 2 808 2 5302．1 稀释倍数对酶活的影响因为培养所获得的菌液酶活都比较高，而在后面的研究中，为了更好地反映各种因素对催化反应的影响，是不期望反应过快的，所以需要对菌液进行稀释．因此，分别将菌液稀释4，8，12，16，20，30，40倍，水合反应后分别测量此时的酶活，然后将测得的酶活乘以稀释倍数，换算得到原始的酶活．换算后结果如表1所示．以稀释16倍的酶活为1，求出不同稀释倍数下的相对酶活U，然后作图，结果如图1所示．从图1可以看到，菌液经稀释后，对折算的原始酶活，在稀释4～12倍之间，酶活相对偏高但在1．1以内；而在16～30倍之间折算的酶活相对偏差较小，误差保持在±10%以内．可以认为，在研究的范围内，稀释倍数对于酶活可以用折算的办法来补偿．2．2 丙烯腈浓度对酶活的影响在催化水合反应中，丙烯腈是一种底物，其浓度对酶活可产生两种影响．一方面，由于底物与中间络合物（ES）生成的三元复合物（SES）不可分解成产物，且具有生理毒性，浓度过高对菌体有害，会造成酶活的快速下降；另一方面，从反应动力学的角度来讲，底物浓度的提高又有利于提高反应速率［8－10］．恰是这两种影响正好相反，所以研究丙烯腈浓度对酶活的影响十分必要．在总体积为25 mL，反应温度为28℃，p H 为7．0情况下，分别考察丙烯腈浓度为10g／L，20g／L，30g／L，40g／L，50g／L，60g／L，80g／L，100g／L，120g／L，140g／L，160 g／L时对水合反应体系中反应速率的影响，结果如图2所示．图1 稀释倍数对酶活的影响图2 丙烯腈浓度对酶活的影响如图2所示，当丙烯腈浓度小于40g／L时，酶活随浓度的增加而快速上升；而在丙烯腈浓度40g／L至120g／L之间，随着浓度的增加，其酶活增加比较平缓，并且在丙烯腈浓度120g／L时，酶活达到最大，为4 125 U／mL，然后酶活随丙烯腈浓度的增加而缓慢降低．可以看出，在丙烯腈浓度大于60g／L以后，酶活还能随着浓度的增加而上升，但是上升幅度比较小，说明高浓度底物已开始对酶活产生抑制作用了．本实验中，丙烯腈浓度最大为160g／L，但此时还观察不到对酶活明显的抑制作用．这说明在本研究的范围内，菌株ZT－2所产的酶对底物的耐受性是比较强的．在后续的实验中，采用丙烯腈浓度为40g／L，虽然丙烯腈浓度在120g／L时所产酶活最高，但相比40g／L时的酶活仅提高了31%，而底物用量却是前者的3倍之多，也就是说丙烯腈转化率降低了．可见采用高的底物浓度并不是最佳选择．根据丙烯腈浓度与酶活的关系，可求得腈水合酶催化反应的米氏常数．求得的米氏常数K m＝14．048g／L，表示的是反应速率达到最大速率一半时的底物浓度．2．3 温度对酶活的影响由图3可见，从18℃到28℃之间，酶活随着反应温度的升高而加快，在28℃时达到最大，测定的酶活为4 091 U／mL菌液；而当反应温度大于30℃后，酶活下降非常快，到40℃时酶活只有28℃时的44．83%，不及其一半，表观酶活仅为1 834 U／mL菌液．分析其原因，可能是酶在高温下失活所造成的．由阿累尼乌斯公式可知，反应速率常数k的对数应该与1／T成正比，反应速率常数k与表观酶活r 成正比．因而，在低于301 K时，以ln（r／U·mol－1）对1／T 作图，可得到一条直线，如图4．直线拟合结果由此可以算出反应的活化能为E a＝40．291kJ·mol－1．2．4 p H对酶活的影响目前从文献报道来看，水合反应大都在中性环境下进行，在此环境下反应速率达到最大值，多数研究者得到的结果也多在7～7．5之间达到最大反应速率［13－14］．为此，本实验在总体积为25 mL，反应温度为28℃，丙烯腈浓度为40g／L的情况下考察了p H 为5，6，6．5，7．0，7．5，8．0，9．0时对酶活的影响情况．结果如图5所示．由图5可知，p H在低于6．5时，酶活随p H的升高而逐渐增大，而在6．5～7．0时，酶活快速上升；当体系p H超过7．5时酶活迅速下降，在7．0～7．5这个区间内酶活维持在较高水平，说明反应体系的p H处在中性范围有利于酶的高效表达，从而获得较高的酶活．因此在以后的研究中水合反应体系的p H为7．3．图3 温度对酶活的影响图4 温度与酶活的线性拟合注：粗线为拟合曲线，细线为数据点连线．2．5 菌悬液用量对反应速率酶活的影响酶作为生物催化剂，其催化反应的速度直接取决于酶浓度［15］．本实验考察在总体积为25 mL，反应温度为28℃，丙烯腈浓度为40g／L，p H为7．3的情况下菌体加入量对酶活影响．实验中发现当菌悬液加入量大于20 mL时，酶活开始下降，估计是受到底物限制的原因．所以只研究了菌悬液加入量为2 mL，5 mL，8 mL，11 mL，14 mL，17 mL，20 mL时对产酶的影响．图5 p H对腈水合酶活性的影响图6 菌悬液用量对反应速率的影响由图6可知，酶活随着菌悬液用量的增加而逐渐增大，在菌悬液加入量为20 mL 时，酶活达到了最高值．这符合酶促反应动力学的基本原理，也就是当底物过量时，酶活随着菌液量的增加而增大，当底物浓度限制时，酶活有最大值．当菌悬液加入量V cell大于20 mL时，酶活开始减少．当V cell＝20 mL时，其最大酶活达5 308 U／mL．以菌悬液V cell加入量对酶活作图，并进行拟合，得到直线方程通过拟合方程可以知道一定体积下菌体加入量的酶活，因而在实际生产中，在保证后期分离及生产成本的前提下，采用合理的菌悬液用量可以保持相对较高的酶活性．2．6 丙烯酰胺浓度对产物的影响产物丙烯酰胺（A M）是一种高毒性的物质，对细胞有较大的生理毒性，能够破坏酶的三维结构并在产物释放前与酶形成中间产物EP的复合物，从而使酶不能与底物接触，降低了酶与底物接触的机会，抑制了酶的活性，也就降低了整个反应的速率［16－17］．在不同丙烯酰胺浓度的水合反应体系中得到丙烯酰胺浓度结果如表2所示．表2 丙烯酰胺浓度对酶活的影响反应前A M浓度／*************反应后AM浓度／% 2．04 6．94 11．73 16．65 21．42 31．18 40．76由表2可知，丙烯酰胺作为反应的产物，其浓度的增加能够极大地抑制酶的活性．当其在体系中的浓度低于20%时，对酶活的影响并不是特别明显，若以添加丙烯酰胺为5%的体系作为标准，其相对酶活都在70%以上．而当其浓度大于30%时，酶活急剧下降，到浓度为40%时，相对酶活已不足40%，说明丙烯酰胺浓度的增加能够极大地抑制体系的酶活，降低反应速率．因此，在实际生产中，及时分离出反应体系中生成的丙烯酰胺是非常必需的，也是目前亟待解决的问题．3 结论底物和产物浓度、催化反应温度、反应p H、菌悬液加入量是影响丙烯腈水合酶活性的主要因素，其中反应温度、底物和产物浓度是影响酶活的关键性因素．对于温度的选择，需要从两个影响方面权衡优化得出，一是温度升高有利于获得较高酶活，二是较高的温度会使酶失活．对于底物浓度，也应从两方面加以考虑，一方面底物浓度的增加有利于反应速率的提高，另一方面底物浓度的增加会抑制酶活性．产物浓度在水合反应中应保持在较低浓度范围，其在体系中的浓度低于20%，相对酶活能保持在70%以上，但是当体系中丙烯酰胺浓度大于20%时，酶活下降非常迅速．本文所得到的对酶活影响的参数，对工业用微生物法生产丙烯酰胺的操作条件优化提供了依据．【相关文献】［1］ OHTSUKA Y，HASGA WA J，NAKATSUJI H et a1．Density functional st udy on geo metry and electronic str ucture of nitrile hydratase active site model［J］．J Inter Quan Chem，2002，90（3）：1 174－1 187．［2］刘金元，王慧琴，徐淑霞，等．腈水合酶研究进展［J］．安徽农学通报，2008，14（4）：111－113．［3］罗积杏，薛建萍，沈寅初．我国生物法生产丙烯酰胺的现状及其研发概况［J］．上海化工，2007，32（2）：17－21．［4］王浩．腈水合酶产生菌的分离筛选及其特性研究［J］．微生物学杂志，1996，16（4）：12－17．［5］胡常伟，李贤均．绿色化学原理和应用［M］．北京：中国石化出版社，2002：98－99．［6］陈跖，孙旭东，史悦，等．微生物法生产丙烯酰胺的研究（Ⅱ）［J］．生物工程学报，2002，18（2）：225－230．［7］邓林，刘延岭，王忠彦，等．产腈水合酶菌株的驯化选育及其产酶条件的优化［J］．食品与发酵工业，2005，31（1）：53－56．［8］ Y Reddy，S Kalju Kahn，ZHENG Y J，et al．Protein engineering of nitrile hydratase activity of papain：molecular dynamics study of a mutant and wild－type enzy me ［J］．Journal of the American Chemical Society，2002，124（44）：12 979－12 990．［9］ CHEN Zh，SUN X D，SHI Y，et al．Study on production of acrylamide by microbial method（11）－enzy me catalytic kinetics and de－active dynamics of nitrile hydratase ［J］．生物工程学院，2002，18（2）：225－230．［10］ ALIKIN V N，ALIAGA A，TERESA M，et al．Detoxification and recycling of wastes from biotechnological manufactuer of acrylamide［J］．Ekologiyai Pro myshlennost Rossii，2005，12：14－16．［11］ RUI A Pereira，GRAHA M Dan，RAINEY Fred A，et al．A novel ther mostablenitrile hydratase［J］．Extremophiles，1998，2（2）：347－357．［12］ PADMAKUMAR R，ORIEL P．Bioconversion of acr ylonitrile to acr ylamide using a ther mostable nitrile hydratase［J］．Applied Biochemistry and Biotechnology，1999，77（9）：671－679．［13］ YASUO Kato，TAKASHI Tsuda．Yasuhisa asano nitrile hydratase involved in aldoxi me metabolis m fro m Rhodococcus sp．Stran YH3－3，purification and characterization ［J］．European Journal of Biochemistry，1999，263：662－670．［14］ NAGASA WA Tor u，NANBA Hir onori，RYUNO Koichiro，et al．Nitrile hydratase of pseudomonas chloror aphis B23，purification and characterization［J］．European Jour nal of Biochemistr y，1987，162：691－698．［15］ JUNA C，OL MSTEAD M M，MASCHARAK P K．A synthetic analogue of the active site of Fe－containing nitrile hydratase with car boxa mido N and t hiolato S as donors：synthesis，str uct ure，and reactivities［J］．Jour nal of the American Chemical Society，2001，123（14）：3 247－3 259．［16］ LIU M，LI Ch，HUANG Y．et al．Impr oving the acrylamide－tolerance of nitrile hydratase in Nocar dia sp．by extreme cultivation［J］．过程工程学报，2004，4（3）：250－255．［17］ ASTAUROVA O B，LEONOVA T E，POLIAKOVA I N，et al．Adaptation of r hodococcus r hodochrous M8，a pr oducer of acrylamide，to changes in ammoniu m concentration in the growt h mediu m［J］．Prikladnaya Biokhi miya Mikrobiologiya，2000，36（1）：21－25．。

腈水合酶产生菌Rhodococcuss p.HUST-1发酵条件的优化

微生物法生产丙烯酰胺与化学法相比具有高效性、选择性、应条件温和、高反成本低和环境污染小等优点，多年来一直是研究的热点之一．国上海生物化学工程研究中心筛选到了一株产丙烯腈水合酶的高效菌株我Ｎｏａｄｉｐ．６１３Ｅ李文忠等筛选到了一株高腈水合酶活力的棒状杆菌ＺＢ２［王浩等筛选到了一株ｃｒａｓ８．６Ｂ．１引，
关键词：腈水合酶；发酵条件；丙烯腈
中图分类号：
文献标识码：Ａ
பைடு நூலகம்
腈水合酶可催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺．７年，１３法国研究者Ｇｌ及其研究组发现了一种能催化丙９ａｙｚ烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物ＢｅｂｃｒｍＲ１￣从而开始了微生物法生产丙烯酰胺的研究．ｒａｔｉ３２ｖｅｕ，由于
１３菌体浓度和腈水合酶活性的测定４０ｉ测定菌液浊度，．６ｎＢ根据Ｏ４和菌体干重标准曲线计算菌体浓度．Ｄ０６
酶活采用国际单位，义２定８℃下每分钟生成１ｍｏ丙烯酰胺为１根据Ｇ１０５３８，溴化法测定．ａｌｔＵ．Ｂ２０．—９用比酶活定义为１ｍ菌体具有的腈水合酶活性．ｇ
攻关项目（０Ａ４Ｓ４）哈尔滨市青年科学研究基金（０４ＦＸ０１￣新余高等专科学校重点校级课题（Ｊ７９资助项目．２０ＡＣ￣９，４）２０ＡＱＪ）４ｘ０３）

产腈水合酶菌株的驯化及其产酶条件优化研究

产腈水合酶菌株的驯化及其产酶条件优化研究邱峰;李志东;李娜;张洪林;王战勇;邱江【期刊名称】《矿冶》【年(卷),期】2006(15)3【摘要】以Nocardia sp LNSY06为出发菌株,通过逐渐增加培养基中丙烯腈的浓度重复继代培养,得到1株酶活为62.5U/mg的腈水合酶高活力菌株,酶活比出发菌株提高了15倍.研究结果表明:驯化的最优条件为:葡萄糖为20g/L,诱导剂脲为0.06g/L,Co2+为0.3g/L,丙烯酰胺为10%,反应pH为7,温度为28℃,底物丙烯腈体积分数＜4%,产物丙烯酰胺的质量分数＜20%.【总页数】5页(P52-55,37)【作者】邱峰;李志东;李娜;张洪林;王战勇;邱江【作者单位】辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁,抚顺,113001;辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁,抚顺,113001;辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁,抚顺,113001;辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁,抚顺,113001;辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁,抚顺,113001;抚顺石油三厂,辽宁,抚顺,113001【正文语种】中文【中图分类】TQ920.1【相关文献】1.产腈水合酶菌株的驯化选育及其产酶条件的优化 [J], 邓林;刘延岭;王忠彦;胡承;孙勇;段洪武2.腈水合酶生产菌株产酶条件的优化 [J], 庄贤军;马骏;吴丛伟3.产几丁质酶菌株 S68-CM5产酶条件优化研究 [J], 胡基华;曹旭;孟力强;陈静宇;姜威;刘宇帅;张淑梅;李晶4.产几丁质酶菌株SWCH-6的选、鉴定及其产酶条件的优化研究 [J], 王海东;陈飚;伦镜盛;王成;胡忠5.一株产腈水合酶菌株酶活高效表达条件的研究 [J], 李志东;李娜;张洪林;王战勇;邱峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

产腈水合酶菌株的驯化及其产酶条件优化研究

ｃｎｉｉｓｏｈｅｔｅｔａｔｎｒｔｒｓｆｌｗｓｌｃｓ０／ｕｅ０ｇＬ，ｃｙｏ＜４，ｃｙａｄｏｄｔｎｆｔｅｂｓｘｒｃｉａｉａｅａｏｌｏｏｏｏ：ｇｕｏｅ２ｇＬ，ｒａ０．６／ａｒｌｎ％ａｒｌｍｉｅ＜２％，ｏ０３／ｐ７ｇＬ，Ｈ０ａｄｔｍｐｒｔｒ８
产腈水合酶菌株的驯化及其产酶条件优化研究
邱峰李志东，，李娜张洪林王战勇，，，邱江
（．宁石油化工大学环境工程系，宁抚顺１３０；．顺石油三厂，宁抚顺１３０）１辽辽１０１２抚辽１０１
Ｆｓｕ１０１ＬａｎｎＣｉａ；．ｕｈｎＯｉＰａｔ．，ｕｈｎ１３０，ｉｏｉｇ，ｈｎ）ｕｈｎ１３０，ｉｏｉｇ，ｈｎ２ＦｓｕｌｌｎＮｏ３Ｆｓｕ１０１ＬａｎｎＣｉａ
ＡＢＴＳＲＡＣＴ：Ａａｔｒａｓｒｉａｉｇｈｇｅｉｉｙｒｔｓｃｉｉｎｃｙｏｉｉｏｃｎａｉｎｄｔｌｒｂｃｅｉｌｔａｎｈｖｎｉｈｒｎｔｌｈｄａａｅａｔｔａｄａｒｌｎｔｌｃｎｅｔｒｔｅｏｅ — ｒｅｖｙｒｅｏａｃ，ｕｅｅｃｒｉｐＬｎｅｎｍｂｒｄＮｏａｄａｓＮＳ６，ｅｅｏｅｙｒｐａｅｕｃｌｕｉｇｏｔｉｈｒｔｏｔｉｉｇａｒ — Ｙ０ｉｄｖｌｐｄｂｅｅｔｄｓｂｕｔｒｎｆｉｎｔｅｂｏｈｃｎａｎｎｃｙｓ

Alcaligenes sp.腈水解酶组成型毕赤酵母表达条件的优化

Alcaligenes sp.腈水解酶组成型毕赤酵母表达条件的优化张新红;朱富成;常飞;徐涛【期刊名称】《新余学院学报》【年(卷),期】2022(27)6【摘要】以实验室前期构建的组成型胞外表达Alcaligenes sp.腈水解酶重组菌株Pichia pastoris X33/pGAPza-rDNA-NIT为研究对象,对该菌株的发酵培养基进行筛选,以最适发酵培养基为基础,通过对发酵培养基组分和表达条件进行优化,提高腈水解酶的表达量并检测其催化性能。

结果表明,甘油培养基d效果最佳,腈水解酶体积酶活可达1.03 U/L,OD600为18.36。

经发酵表达条件优化后,在蛋白胨25 g/L、酵母粉10 g/L、甘油20 g/L、MgSO41 g/L、磷酸盐20 mmol/L、培养基初始pH 8.0、装液量20%、诱导温度26℃、发酵时间72 h条件下,腈水解酶体积酶活达1.75 U/L,OD600为45.7,分别是优化前的1.7倍和2.5倍。

在此基础上,利用腈水解酶进行扁桃腈催化形成R-扁桃酸的进程研究,反应2h产率可达95.1%,e.e.值达100%,此结果可为工业化应用提供参考,可为腈水解酶的研究进一步奠定基础。

【总页数】7页(P24-30)【作者】张新红;朱富成;常飞;徐涛【作者单位】合肥学院生物食品与环境学院;皖西学院生物与制药工程学院【正文语种】中文【中图分类】Q814.9;Q815;Q819【相关文献】1.来源于Thermomyces sp.的植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达2.鸡α－干扰素在毕赤酵母中的表达及其表达条件优化3.优化合成有机磷水解酶opd p基因r在毕赤酵母中的表达4.透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究5.响应面法优化CALA在毕赤酵母中的组成型表达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

腈水解酶重组菌发酵产酶条件的优化及应用

·Ｌ－１，ＮａＣｌ１０ｇ· Ｌ－１，卡那霉素５０ｍｇ· Ｌ－１，１２１ ℃灭菌２０ｍｉｎ。
初始发酵培养基：蛋白胨１０ｇ·Ｌ－１，酵母浸出汁５ｇ·Ｌ－１，ＮａＣｌ１０ｇ·Ｌ－１，ｐＨ值７．５，１２１ ℃ 灭菌２０ｍｉｎ。１．３方法
初始培养方法：从甘油管或斜面挑取重组工程菌至装液量为５０ｍＬ（２５０ｍＬ三角瓶）的种子培养基中，３７ ℃培养１２ｈ后，取１ｍＬ种子液于装液量为１００ｍＬ（５００ｍＬ三角瓶）的发酵培养基中，３７ ℃ 培养４ｈ后加诱导剂乳糖２．０ｇ·Ｌ－１，转入２８ ℃ 诱导培养１６ｈ后离心收集菌体。
高速离心机，美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ；ＦＡ２００４型电子分析天平，上海精密仪器仪表有限公司；ＳＰＤ－２０Ａ
基金项目：国家８６３计划资助项目（２００９ＡＡ０２Ｚ２０３）收稿日期：２０１１－１２－２２作者简介：吴乔（１９８６－），男，湖南岳阳人，硕士研究生，研究方向：生物催化与转化；通讯作者：郑裕国，教授，博士生导师，Ｅ－ｍａｉｌ：
玉米浆粉浓度对菌株生长和产酶的影响见图１。
图１玉米浆粉浓度对菌株生长和产酶的影响Ｆｉｇ．１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｒｎｐａｓｔｅｐｏｗｄｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎｓｔｒａｉｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
对映体过量值（ｅ．ｅ．值）来评价。

腈水合酶产生菌的分离筛选和酶反应条件的优化

腈水合酶产生菌的分离筛选和酶反应条件的优化秦智;蒋忠平;朱婷婷;张云天;孙晓君【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2008(036)002【摘要】从化工废水处理厂的活性污泥中分离和筛选到一株腈水合酶产生菌HUST-1.经初步鉴定,菌株HUST-1属于红球菌属(Rhodococcus sp.).对菌株(Rhodococcus sp.)HUST-1所产腈水合酶的反应条件进行研究,结果表明,该菌株的最优酶反应条件:丙烯腈加入量为5%,反应温度为28 ℃,pH值为7.0,反应时间为15 min.在最优酶反应条件下,菌株(Rhodococcus sp.)HUST-1的最高比酶活可达119 U·mg-1,比优化前提高24.5%.【总页数】3页(P61-62,72)【作者】秦智;蒋忠平;朱婷婷;张云天;孙晓君【作者单位】哈尔滨理工大学,哈尔滨,150040;哈尔滨理工大学,哈尔滨,150040;哈尔滨理工大学,哈尔滨,150040;哈尔滨理工大学,哈尔滨,150040;哈尔滨理工大学,哈尔滨,150040【正文语种】中文【中图分类】TQ920.1【相关文献】1.2,2-二甲基环丙腈水合酶产生菌的氮离子注入选育及突变株产酶条件研究 [J], 吴玉峰;郑裕国;沈寅初2.一株腈水合酶产生菌的筛选及培养条件的优化研究 [J], 刘士妤;许隽波;赵金爽3.腈水合酶产生菌 Rhodococcus sp.HUST-1发酵条件的优化 [J], 朱婷婷;秦智;孙晓君;蒋忠平4.腈水合酶产生菌的分离筛选及其特性研究 [J], 王浩5.生淀粉糖化酶产生菌Aspergillus niger(6#)的分离筛选及其产酶条件 [J], 肖长清;戚天胜;赵海因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

高分子量腈水合酶工程菌生产烟酰胺的工艺建立

高分子量腈水合酶工程菌生产烟酰胺的工艺建立郭军玲;王哲;刘中美;周哲敏【摘要】为提高表达玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)来源的高分子量腈水合酶大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-nhhBrbsArbsG(BAG)的菌体酶活,建立了合适的烟腈全细胞催化工艺以及重组工程菌的高密度发酵工艺.采用正交试验L9(34)对摇瓶培养基中各组分进行优化,比较烟腈底物流加和底物分批补料工艺,对重组菌进行分批补料高密度发酵培养.培养基优化后其菌体生物量提高到4.42 gDCW/L,细胞比酶活提高到30.91 U/mgDCW;与烟腈底物流加相比,烟腈分批补料工艺更适合烟酰胺的生产,通过此工艺的反应,摇瓶发酵后的BAG能够生产390 g/L烟酰胺;对BAG进行5L发酵罐分批补料扩大培养,菌体生物量最高达到73.97 gDCW/L(OD600=200),细胞比酶活最高为42.70 U/mgDCW,单位发酵液酶活最高为2 813 U/mL,用较高密度的发酵罐培养后重组菌进行烟腈催化反应,产物质量浓度能达到537 g/L,是已报道的大肠杆菌重组表达腈水合酶产烟酰胺所得终质量浓度的最高水平.%To increase the biomass and the activity of Escherichia coli BL21 (DE3) /pET-24a(+)-nhhBrbsArbsG (BAG) expressing high molecular mass nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J1 and establish proper process of whole-cell catalysis of 3-cyanopytidine and high cell-density cultivation,we used orthogonal experiment (L9 (34)) to optimize elements in culture media.After comparison of substrate-flow and substrate fed-batch process,technology of fed-batch was applied to achieve high cell-density cultivation.After the optimization of culture media,the biomass and the specific activity of BAG in the flask reached 4.42 g DCW/L and 30.91 U/mgDCW,respectively.As amore appropriate process,substrate fed-batch process was applied to produce nicotinamide using BAG,and the yield of nicotinamide reached 390 g/L.After the high cell-density cultivation of BAG in 5 L bioreactor,the biomass of cell attained 73.97gDCW/L (OD6o0 =200),the specific activity and the total activity reached 42.70 U/mg DCW and 2813U/mL,respectively.When high density of BAG after fermentation in the tank was used to catalyze 3-cyanopytidine,537 g/L of nicotinamide was obtained,which was the highest yield of nicotinamide among all the reported production from recombinant E.coil expressing nitrile hydratase.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)002【总页数】7页(P8-14)【关键词】腈水合酶;大肠杆菌;全细胞催化;底物分批补料;高密度发酵【作者】郭军玲;王哲;刘中美;周哲敏【作者单位】江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)是一种能够催化腈类物质生成酰胺类化合物的金属酶[1]，主要用于工业上丙烯酰胺和烟酰胺的生产[2]。

腈水合酶产生菌 Rhodococcus sp.HUST-1发酵条件的优化

腈水合酶产生菌 Rhodococcus sp.HUST-1发酵条件的优化朱婷婷;秦智;孙晓君;蒋忠平【期刊名称】《江西师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2008(032)006【摘要】Rhodococcus sp.HUST-1在Co2+的诱导下产腈水合酶,催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺.对菌株HUST-1的产酶条件进行优化.研究表明,发酵过程中培养基中的碳氮源、诱导剂浓度以及培养条件影响腈水合酶的高效表达.在葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、Go2+0.08 mmol/L、酪氨酸0.2 g/L、pH 7.0、培养温度28℃时,HUST-1所产腈水合酶总酶活达1 012.7 U,比优化前提高了47.1%.【总页数】4页(P667-670)【作者】朱婷婷;秦智;孙晓君;蒋忠平【作者单位】哈尔滨理工大学,化学与环境工程学院,黑龙江,哈尔滨,150040;新余高等专科学校太阳能科学与工程系,江西,新余,338000;哈尔滨理工大学,化学与环境工程学院,黑龙江,哈尔滨,150040;哈尔滨理工大学,化学与环境工程学院,黑龙江,哈尔滨,150040;哈尔滨理工大学,化学与环境工程学院,黑龙江,哈尔滨,150040【正文语种】中文【中图分类】O6【相关文献】1.腈水合酶产生菌的分离筛选和酶反应条件的优化 [J], 秦智;蒋忠平;朱婷婷;张云天;孙晓君2.Rhodococcus ruber TCCC28001产丙烯腈水合酶过程调节及转化条件研究 [J], 张锦丽;王敏;钟莉萍;李晓丹3.腈水合酶产生菌发酵条件的优化及其酶学性质研究 [J], 赵霞;王纯利;娄恺4.Rhodococcus sp.SHZ-1腈水合酶的高酶活发酵工艺 [J], 王超;张根林;李春;吴丽5.一株腈水合酶产生菌的筛选及培养条件的优化研究 [J], 刘士妤;许隽波;赵金爽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

腈水合酶研究进展

腈水合酶研究进展摘要从腈水合酶的结构、分布、酶学性质及其基因克隆和生产中的利用形式等方面简要阐述了腈水合酶的研究进展。

关键词腈水合酶；酶学性质；基因克隆腈水合酶（Nitrile hydratase，EC4.2.1.84）是一类可以催化腈类物质转化成相应酰胺类物质的酶[1]，其最初是由日本学者Asano发现并命名的。

微生物的腈水合酶作为生物催化剂应用在有机物合成的工艺上具有巨大的潜力，它的反应条件温和、产率高、副产物少、产物的自聚损失少，具有区域选择性、立体选择性和光激活性，可广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。

更重要的是，它环境污染小、成本低、符合绿色化工发展理念，有着化学方法无法替代的优越性，从而促进了精细化工产品、可降解塑料和手性药物以及维生素等方面的研制和开发。

因此，20多年来一直受国内外研究者的广泛关注。

1腈水合酶的产生菌及其结构无论是腈类物质还是酰胺类物质对人体来说都是极其有毒的[2]，然而有些微生物却能利用它们作为自身生长的碳源和氮源。

原因就在于这些微生物能够自身合成降解腈类物质的酶—腈水合酶（NHase），腈水合酶是某些微生物在进行肟或尿代谢过程中所产生的一种蛋白[3]。

目前已知可产腈水合酶的菌株有红球菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、棒状杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、短杆菌等。

可见产腈水合酶的菌的分布相当广泛[4]。

不同菌株的腈水合酶在结构上存在着一定的差异，但是也存在来自不同菌株的腈水合酶在结构上的相同。

尽管不同菌株的腈水合酶在氨基酸序列上存在差异，但是它们仍然存在着一个共同点，那就是在酶的活性部位都含有螯合的金属离子作为辅助因子。

根据所含辅助因子的不同，腈水合酶可分为2类，一类为高分子量腈水合酶（H-NHase），其所含金属离子为钴；另一类为低分子量腈水合酶（L-NHase），其所含金属离子为铁。

尽管铁型和钴型腈水合酶在氨基酸序列上具有极大的同源性，但这2种酶在生物转化活性和底物特异性上还是有着很大的差异。

1株腈水合酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学特性

1株腈水合酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学特性张玉香;韩平平;李晋;申杰;李娜;陈国忠;张娟;冯志彬【摘要】从济宁农田土壤分离筛选产生腈水合酶的菌株,利用薄层层析法(TLC)初步判断产酶能力,液体发酵复筛测定酶活力,筛选到酶活力达到3.6 U/mL的菌株Jn-102.通过菌体形态及菌落特征、生理生化及16S rDNA序列分析鉴定菌株Jn-102为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai).对其所产腈水合酶进行酶学性质分析,结果表明酶的最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,在40℃以下和pH6.0～8.0范围内酶活力较稳定,具有较宽的底物谱,对芳香腈有较好的水合作用,以对羟基苯乙腈为底物时Km值和Vmax值分别为21.3 mmol/L和60.2 μmol/(min· mg),Co2+和Mg2+等对酶活力有轻微的促进作用,而Zn2对酶活力有强烈的抑制作用.阿氏芽孢杆菌Jn-102是1株腈水合酶活力较高的生产菌株,具有潜在的研究和应用价值.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)023【总页数】6页(P128-133)【关键词】阿氏芽孢杆菌;腈水合酶;对羟基苯乙腈;酶学性质;底物特异性【作者】张玉香;韩平平;李晋;申杰;李娜;陈国忠;张娟;冯志彬【作者单位】鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025;鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025;鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025;鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025;鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025;鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025;鲁东大学农学院,山东烟台264025;鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025【正文语种】中文【中图分类】TS201对羟基苯乙酰胺是合成肾上腺素受体阻滞药阿替洛尔及其衍生物的关键中间体,因此对羟基苯乙酰胺的合成一直广受关注[1-4]。

对羟基苯乙酰胺的生产方法主要有化学合成法和生物转化法。

腈水合酶生产菌工业发酵技术研究

腈水合酶生产菌工业发酵技术研究周云霞;吴金海;高俊;李红梅;刘晶【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2008(25)11【摘要】研究了腈水合酶生产菌的培养基组成、灭菌操作、种子质量控制以及pH 值控制等方面对工业发酵的影响,培养基各主要成分的最佳含量为:氯化钴16×10-6,尿素0.90%,酵母膏0.70%,味精0.85%,葡萄糖2.2%,确定了科学的灭菌操作方法、种子质量控制方法以及pH值调控方法,并在生产实际应用中取得了显著效果,发酵周期可缩短20h以上,酶活提高40%以上.【总页数】4页(P51-53,67)【作者】周云霞;吴金海;高俊;李红梅;刘晶【作者单位】大庆炼化公司,黑龙江,大庆,163411;大庆炼化公司,黑龙江,大庆,163411;大庆炼化公司,黑龙江,大庆,163411;大庆炼化公司,黑龙江,大庆,163411;大庆炼化公司,黑龙江,大庆,163411【正文语种】中文【中图分类】TQ920.1【相关文献】1.食用菌菌渣生产水体缓释肥的发酵技术研究 [J], 刘润叶2.腈水合酶生产菌工业发酵技术研究 [J], 周云霞;胡毅;高俊;李红梅;刘晶3.四川省食品发酵工业研究设计院酿酒科技杂志社四川省白酒酿造产业技术研究院国家固态酿造工程技术研究中心酿酒生物技术及应用四川省重点实验室关于举办“全国酒类生产技术高级研讨班(第五十六期)”的通知 [J],4.“双乳酸菌发酵碎鲜辣椒制品工业化生产工艺技术研究”通过省级成果鉴定 [J], 武小松5.四川省食品发酵工业研究设计院《酿酒科技》杂志社四川省白酒酿造产业技术研究院国家固态酿造工程技术研究中心酿酒生物技术及应用四川省重点实验室关于举办“第五十一期全国酒类生产技术高级研讨班”的通知 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

腈水合酶产生菌的分离筛选和酶反应条件的优化

维普资讯
第３６卷第２期２００８年２月东北林业 Nhomakorabea大
学
学
报
Ｖｏ．．１３６Ｎｏ２Ｆｅ２Ｈ８ｂ．０Ｏ
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＮＯＲＨＥＴＦＴＡＳＯＲＥＴＳＲＹＵＮＩＥＲＳＴＶＩＹ
ｆｒｐｔｍｉａｉｎ．ｏｅｏｉｚｔｏ
ＫｅｏｄｓＮｉｒｌｙｄｔｓｙｗｒｔｉｅｈｒａａｅ：Ｒｈｏｏｏｃｓｓ．；Ｅｎｚｍａｉｅｃｉｎｃｎｔｏｓｄｃｃｕｐｙｔｃｒａｔｏｏｄｉｉｎ
丙烯酰胺作为一种重要的酰胺类化合物，主要用于制造聚合物或共聚物，作为水处理剂及造纸、钻井等的助剂或添加剂。目前随着国内三次采油的广泛应用，丙烯酰胺的需求量日益增长，其市场前景非常乐观。采用生物法生产丙烯酰胺是利用生物细胞产生的腈水合酶将丙烯腈转化为丙烯酰胺。该工艺的优点在于反应在常温常压下进行，应条件比较温反和、丙烯腈转化率高、操作简单、生产成本低、无污染等。腈水合酶是生物催化法生产丙烯酰胺的催化剂，能使它丙烯腈发生水合反应生成丙烯酰胺，因此腈水合酶高产菌的筛选和腈水合酶反应活性的高效表达是提高丙烯酰胺生产效率的关键。我国上海生物化学工程研究中心筛选到了一株产腈水合酶的高效菌株（ｏａｄｐ）６—１３３，文忠等对Ｎｃｒｉｓ．８ａ６李ＬＪ棒状杆菌ＺＢ一１水合酶的形成条件进行了研究Ｊ邓林Ｂ２腈，等筛选到了一株腈水合酶高效菌（ｈｄｃｏｕｐ）Ｌ一１并Ｒｏｏｃｃｓｓ．Ｙ，通过腈水合酶的酶学性质确定了腈水合酶的最适温度为３０ ℃ 。笔者报道了从活性污泥中分离和筛选的一株腈水合Ｊ酶高产菌，并对该菌株腈水合酶催化丙烯酰胺生成的酶反应条件进行了优化研究，项研究为提高丙烯酰胺的生产效率这提供重要的研究基础。

腈水合酶的发酵研究

腈水合酶的发酵研究阮继红(江西农科化工有限公司江西南昌330045)摘　要:N ocardia spl63#在含有脲和钴的培养基中发酵生产腈水合酶,可以催化丙烯腈水合为丙烯酰胺。

调节培养条件使发酵液的酶活力达到815万u/m1。

温度28-30℃,反应体系呈中性酶活性很高并且稳定。

关键词:腈水合酶　培养条件　发酵丙烯酰胺是一种用途广泛的精细化工产品,主要用于生产聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺可用作“三次采油”驱油剂,水处理,造纸增强剂,高吸水性卫生用品和胶粘剂等。

本研究采用腈水合酶(Nitrile hydrates NHaze)以丙烯腈和水为底物,催化丙烯腈水合用于生产丙烯酰胺[1]CH2=CH-C N+H2O NHazeCH2=CH-C ONH2腈水合酶是一类能催化腈类化合物转化为相应的酰胺类化合物的同工酶,本文采用的菌株N ocardia spl63 #通过改变碳源,诱导剂的用量、PH、温度、氧气、培养时间寻找菌体生长及产酶最佳条件。

N ocardia spl63#菌是己知高效的腈水合酶菌,也是许多企业普遍采用的一种微生物。

微生物法生产丙烯酰胺(AM)是AM的第三代生产技术,具有常温、常压下反应,转化率高,无副反应产物,产品纯度高,为生产高分子量聚丙烯酰胺的理想原料[2-3]。

1　实验1.1酶的发酵条件斜面培养基(%):牛肉膏0.5,蛋白胨10,NaCl0.5,葡萄糖0.1,琼脂2.0,PH7.2。

用湿热法121℃灭菌25min,接种后培养4d,保存于4℃。

发酵培养基(%):葡萄糖 2.0,K2HP40.05, K H2PO40.05,谷氨酸0.1,MgS O4.7H2O0.05,脲0.7,C oCl2・6H2O0.001(以上试剂均为分析纯),酵母浸膏(生化试剂)0.5,PH7.5,121℃灭菌15min。

菌体浓度721型分光光度计在460nm下测定0D 值,以未接种培养液做空白对照。

1.2产物浓度的测定及酶活的计算将1ml菌液加入PH=7.2磷酸缓冲19ml,放入28℃,叵温水浴振荡器中,加入丙烯腈1000ul,震荡反应5分钟用6N盐酸终止反应。

腈水合酶高产菌株的诱变选育及发酵条件的优化

（庆炼化公司，龙江大庆１３ｌ）大黑６４１
俊
摘
要：用微波和化学诱变剂Ａ对菌株Ｎｏａｄａｓ．Ｄ０进行了复合诱变，过多次传代实验，ｃｒｉｐＴ６经获得一株稳定高产
腈水合酶的菌株Ｎｏａｄａｓ．Ｄ７７。在优化的发酵培养条件下，２０ｍ角瓶中培养基装量２Ｌ接种量９、ｃｒｉｐＴ８９即５Ｉ三５ｍ、培
致率盟麓死＝
１３３化学诱变剂Ａ诱变．．
Ｘ０１０
斜面及分离培养基（Ｌ）葡萄糖１，母膏ｇ・：０酵
３Ｎａ，ＨＰ，ｇＯ・７Ｏ．，脂２。，Ｃ１Ｋ２ｏ４２ＭＳ１Ｈ２０２琼０
大功率为７０Ｗ、冲频率为２５０脉４０ＭＨｚ的家用微波炉）小火照射，，每照射１０ｓ冷却１０ｓ再照射，照射时
间累计，别为１、Ｏｓ３、０Ｓ５、Ｏｓ然后分０Ｓ２、０ｓ４、Ｏｓ６。将菌悬液移人无菌试管中冰镇２ｈ再转接人后培养，摇瓶，８、２・ｍｉ振荡培养约２ｈ将培养液２ ℃ ２０ｒｎ。
１实验 Biblioteka １１菌种．诺卡氏菌Ｎｏａｄａｓ．Ｄ６菌体酶活性为ｃｒｉｐＴ０，
２１・～，大庆炼化公司科研中心单体研究室８４ＵｍＬ由保藏。

灭菌温度对产腈水合酶菌发酵生产的影响

TECHNOLOGY AND INFORMATION科学与信息化2022年3月下 173灭菌温度对产腈水合酶菌发酵生产的影响钟山金周建荣潘海祥周建春江苏昌九农科化工有限公司江苏如东 226499摘要本文通过菌株Nocardia.sp.163在发酵罐培养时培养基灭菌温度的试验，发酵培养42h后，发酵液通过离心和微滤膜清洗降低色度后，分批投入水合反应釜进行水合反应，计算生产一吨丙烯酰胺消耗发酵液量；筛选到一优良的消毒温度在该温度消毒后培养的发酵液酶活提高了67%，在催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺的反应中消耗发酵液的量降低了32%。

关键词灭菌温度；腈水合酶；培养基；消耗发酵液量Effects of Sterilization Temperature on Fermentation Production of Nitrile Hydratase Bacteria Zhong Shan-jin, Zhou Jian-rong, Pan Hai-xiang, Zhou Jian-chunJiangsu Changjiu Agrochemical Co., Ltd., Rudong 226499, Jiangsu Province, ChinaAbstract In this article, the sterilization temperature of the culture medium of strain Nocardia.sp.163 in the fermenter culture is tested. After 42 hours of fermentation, the fermentation broth is centrifuged and washed with microfiltration membrane to reduce the color, and then put into the hydration reactor in batches for hydration reaction, the amount of fermentation broth consumed to produce one ton of acrylamide is calculated; an excellent disinfection temperature is screened, the enzyme activity of the fermentation broth cultured after disinfection at this temperature increases by 67%, and the amount of fermentation broth consumed in the reaction of catalyzing the hydration of acrylonitrile to generate acrylamide decreases by 32%.Key words sterilization temperature; nitrile hydratase; culture medium; consumption of fermentation broth引言腈水合酶（nitrile hydratase ，NHase ）是生物催化法生产丙烯酰胺（acrylamide ，AM ）的催化剂，能催化丙烯腈（acrylonitrile ，AN ）水合生成丙烯酰胺[1-2]。

腈水合酶生产菌工业发酵技术研究

腈水合酶生产菌工业发酵技术研究水合酶是一类特殊的酶，它们可以在水中进行反应，既能降低反应所需的能量，又能用来催化复杂的化学反应。

因此，水合酶在生物化学，制药，食品和环境工程等领域有着广泛的应用。

其中，脯氨酸水合酶（laminin hydrolase）以其独特的结构和功能而受到研究者的关注。

本研究的主要目的在于研究有机氨基酸水合酶的生物合成及其生产工艺。

其中，发酵技术是关键。

研究表明，水合酶的工业发酵由两步进行：菌株的筛选和发酵参数的优化，也就是发酵生物质的种类和数量，发酵温度和时间，呼吸率，pH等。

首先，研究者收集了来自不同物种，如野生菌株、培养菌株、变异与调整菌株的大量微生物。

然后，通过分离和纯化技术，从微生物源中筛选出有机氨基酸水合酶产生菌株，通过观察菌体表面轻附着、协同生长和氨基酸水合酶产物生成等方法筛选出候选菌种，优选出较高水合酶活性的株系。

其次，为了获得高浓度的水合酶产物，利用发酵技术优化发酵条件也很重要。

首先，研究者选择优化的培养基，使微生物生长快速，有利于氨基酸水合酶的合成。

其次，采用响应面设计，根据发酵温度、时间等参数的影响，逐步优化发酵条件，以达到较高氨基酸水合酶产量。

最后，不断改善菌株的稳定性，增加其产量和活性，并考虑生物降解能力等因素，以确保有机氨基酸水合酶工业发酵的成功。

总之，有机氨基酸水合酶生产的发酵技术研究主要包括：首先，针对不同的应用，筛选出具有最佳活性的微生物菌株；其次，优化发酵条件，获得较高水合酶产物浓度；最后，不断改善菌株稳定性，以获得最佳水合酶活性。

此外，研究者应以可行工艺为基础，密切跟踪材料及设备的质量控制，以确保生物合成有机氨基酸水合酶工艺运行良好。