第六章毛状根培养
毛状根培养2
毛状根诱导的分子机理
1
发根土壤杆菌识别受伤植 物释放的诱导物（乙酞丁 香酮等酚性物质）
2
发根土壤杆菌识别信号 分子后,向受伤细胞作趋 化性运动,并与宿主细胞 发生粘接。
4
T-DNA基因进人寄主细 胞的细胞核，并整合到核 基因组中,然后在寄主细 胞中表达,从植物的感染 点诱导毛状根.
3
发根土壤杆菌Ri质粒上的 vir区（致病区）基因被 乙酞丁香酮等物质活化, 使Ri质粒上的T-DNA片段 被切割下来并转入植物细 胞,但vir区本身不转入。
2.激素自养性
3.遗传稳定性
4.可塑造性
与中药现代化生产
次生代谢产物的 规模化生产 生产药用植物 的活性成分
成功应用 于工业生 产的例子
药用植物人参、紫草、长春花、甜菜胡萝卜 (Daucuscarota)等植物的毛状根能够通过生 物反应器培养来进行其次生物质的规模化生 产。
展望
优：毛状根培养体系是一种非常有潜力的生产次生代谢物的
因此，如何更好的开发和利用毛状根培育技术，使其能够达
到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的斑质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中LOGO毛状 Nhomakorabea培养技术
毛状根培养技术
1
毛状根培养技术简介 毛状根诱导培养体系的建立 毛状根培养技术与中药生产 展望
浅谈Ri质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分研究中的应用-论文.doc
浅谈Ri质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分研究中的应用-论文【关键词】人参；,Ri质粒；毛状根【关键词】人参；Ri质粒；毛状根Ri质粒介导的毛状根技术是20世纪80年代后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项新技术。
它是将发根农杆菌含有的Ri质粒中的TDNA片段整合到植物细胞的DNA上，诱导出毛状根，从而建立起毛状根培养系统用于次生代谢物的生产［1］。
由于Ri质粒转化的毛状根具有生长快、易于培养、有用成分高、代谢通路表达完整的特点［２］，在利用生物技术生产药用植物有效成分领域，显示出极大的应用潜力和广阔的发展前景。
在利用Ri质粒介导的毛状根技术生产人参皂苷、人参多糖等次生代谢物方面已经做了大量的研究。
本文就该方面的研究作一综述。
1Ri质粒转化形成毛状根的机制［3~7］Ri质粒是位于发根农杆菌染色体之外的独立的双链环状DNA，一般在180～250kb之间，具有2个非常主要的功能区：TDNA区（TransferredDNAregion）和Vir区（virulanceregion）。
农杆碱型Ri质粒上的TDNA是不连续的，分为TLDNA和TR-DNA。
TRDNA上带有编码农杆碱合成酶基因（ags）和生长素合成酶基因（tms1和tms2），后者指导IAA的合成。
发根农杆菌侵染形成毛状根的过程可分为四个步骤：①发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成一种特殊的小分子化合物，如酚类化合物，从而诱导Ri质粒的Vir区基因群活化；②在Vir基因表达产生的酶的作用下，TDNA被切下；③TDNA转移到植物细胞并整合到植物基因组DNA；④TDNA在植物细胞中得到转录和翻译，发挥其机能，刺激植物细胞形成毛状根。
2Ri质粒介导的毛状根技术在获取人参药用成分研究中的应用众多的学者已经对人参毛状根体系的建立，不同的培养基成分、菌株、诱导子对毛状根生成以及对产生次生物质的影响，人参毛状根生理生化活性，利用人参毛状根合成其他药物成分以及人参毛状根的生物反应器培养等方面进行了大量的工作，为获取人参药物成分的工业化生产奠定了基础。
浅谈毛状根及在药用植物中的应用
3.2获得毛状根转基因植物
以Ri质粒为载体转入外源功能基因，获得药 用植物的转基因植株。 通过转基因技术，一、可以对克隆出的目的 基因进行功能验证；二、导入外源功能基因， 可以改善药用植物的某些特性。 可以产生新的有效物质、提高栽培品种抗病 虫害的能力等。
3.3毛状根再生植株，缩短良种繁育时间
菌株类型
目前采用的发根农杆菌主要有天然农杆碱A4、 ATCC15834、16834、LBA9402及1601、R1000、 R1200等； 黄瓜碱型的2635、2657、2659等； 甘露碱型的 5196、TR101、TR7等；
每一种菌株对不同植物诱导毛状根的能力是 不同的。
预培养时间
外植体经预培养后能够促进细胞分裂；
毛状根再生植株与天然或栽培植株相比，一般具 有叶片皱缩、节间缩短、植株矮化、须根发达等 特点；
主要的药效成分含量高于天然的；
由于毛状根生长迅速，将其根尖切下，便可繁殖 出大量的无性繁殖再生植株，大大缩短了药用植 物的栽培周期。
3.4为药用植物种质保存提供新途径
毛状根具有高度的繁殖潜能，可以制成 人工种子长期保存。 由于带有顶端分生组织或分枝的发根切 段能够再生出整个植株，可以用海藻酸 钠凝胶包裹发根切段制成了人工种子。
4存在的困难与解决方法
第一个困难是由于许多单子叶植物和部分裸 子叶植物对发根农杆菌不敏感，还不能诱导 出毛状根。 第二个困难是部分植物的毛状根有效成分含 量较低或不含有效成分。
对于第一个困难，人们正在通过建立和发 展基因转移技术，来逐步解决。 如PEG法、电击法、微注射法、激光微柬法、 超声波法、基因抢法等。 对于第二个困难，人们正在通过环境因子 调控和培养绿色毛状根等技术来逐步解决。
药用植物器官培养生产次生代谢物的路线图
实验1毛状根诱导和培养
准备工作
• 下周实验前，用YEB活化培养菌株 • 菌株：ＡＴＣＣ１５８３４ harboring
wild type agropine pRiA4b • 培养时间：30h until the OD 600 of
suspension is ca 0.8
THANKS FOR YOUR ATTENTION!
3.4 叶盘法产生毛状根的实验过程
4，需准备的下次实验的材料
• 1.MS固体培养基（不加激素，0.8%琼脂，pH6.0）,每 人4-6瓶（20—30mL果酱瓶）
• 2.MS 液体培养基，每组200mL（稀释活化菌液用） • 3.YEB 液体培养基，pH7. 共2,2升（全班用） • 4.YEB固体500mL（全班用） • 5.无菌水（每人至少4瓶）和空瓶1-2个/人。 • 6.每人无菌吸水纸和牛皮纸各一包（灭菌后供下次用） • 7.接种工具（镊子，手术刀等）包裹灭菌。
实验一， 毛状根的诱导和培养
实验目的
• 1.掌握毛状根产生的原理 • 2.掌握毛状根诱导和培养的方法 • 3.掌握毛状根鉴定的方法
Ri质粒ED C源自G virB AT-DNA
LB RB
Hairy root genes and opine synthase
Ri opine
catabolism
ori
1.毛状根产生的原理
2.毛状根产生过程
• 毛状根形成：
• 菌种活化培养—感 染-吸附到细胞伤 口附近—穿过细胞 壁,膜-质-进入细胞 核内进行插入整合 和表达—形成毛状 根。
3.毛状根的诱导方法
• 1.叶盘法 2.原生质体共培养 3.活体接种法(PPT 演 示)
褐脉少花龙葵毛状根
叶盘法（Horsch et al 1985）
毛状根
发根农杆菌诱导黄瓜毛状根的研究陈佳20072502613华南师范大学生命科学学院广州510630摘要：本实验用发根农杆菌对无菌黄瓜子叶侵染，诱导长出不定根。
并将不定根转入不同卡那霉素浓度的筛选培养基内筛选。
结果表明：MS+Cep500+Kana400的培养基筛选转化根效果最好，嫩根长出的毛状根平均长0.8cm，能明显看到黄瓜毛状根生长。
但总体上讲，黄瓜子叶的转化率并不高。
关键词：发根农杆菌；黄瓜；毛状根；卡那霉素Study on Inducing Cucumber Hairy Roots by AgrobacteriumRhizogenesChen Jia 20072502613College of Life Sciences of South China Normal University, Guangzhou, 510630 Abstract:The cucumber cotyledons were infected respectively by agrobacterium rhizogenes R160 and induced to grow adventitious roots. The results showed that the medium contain 400mg/L kanamycin have the best effect on screening the transformated one .It’s obvious that some hairy roots have growed and the average length is 0.8cm. Generally speaking, the conversion ratio is not high. Key word: Agrobacterium rhizogenes; Cucumber; Hairy Loot; Kanamycin含有Ri质粒的发根农杆菌对植物的侵染也是自然界存在的天然植物遗传转化系统。
第六章毛状根培养
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
毛状根的培养方法
具体培养方法
固体培养
•
成批培养 连续培养
液体培养法
两相培养法
•
•
大规模发酵培养
毛状根的筛选与鉴定
筛选：选择生长速度较快、分枝较多的毛状根 株系进行扩大培养 鉴定：
形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝
多根毛，无向地性 细胞水平：冠瘿碱的测定 （硝酸银染色）
，
毛状根培养反应器
利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
发根农杆菌菌株的类型： 农杆碱型（agropine type） 胭脂碱型 章碱型
农杆菌菌株的筛选及活化
将菌株在液体培养基上培养（含乙酰丁香酮），
激活vir区的基因，为Ri质粒的转移提供先决条件
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
苦参毛状根及愈伤组织培养研究
苦参毛状根及愈伤组织培养研究苦参毛状根及愈伤组织培养研究植物组织培养技术是一种能够实现植物体外生长和发育的关键技术之一，对于植物根系的研究和利用具有重要意义。
本文将对苦参（Sophora flavescens Ait.）的毛状根及愈伤组织培养研究进行探讨。
苦参是一种草本植物，广泛分布于我国华北、华东、华南和西南等地区。
其根系富含多种生物碱、黄酮类化合物和皂甙等有效成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等药理活性，被广泛应用于中药制剂和功能食品中。
毛状根是苦参植物根系生长过程中形成的一种特殊结构，具有未分化的细胞和较高增殖能力。
通过毛状根培养，可以大量繁育苦参植物，并提取其有效成分。
在实验室条件下，以苦参幼苗为材料进行细胞悬浮培养、愈伤组织诱导和愈伤组织分化等步骤，可成功获得愈伤组织。
愈伤组织是在植物组织培养过程中诱导和分化的一种未分化、增殖能力强的细胞群体。
通过愈伤组织培养，可以实现大规模生产苦参有效成分的愈伤组织悬浮培养液，具有较高的药用价值。
同时，愈伤组织还可以作为研究苦参生物合成途径和代谢调控的模型系统，为深入研究苦参药理作用提供了重要工具。
本研究以苦参幼苗为材料，在适当培养基中进行毛状根和愈伤组织培养试验。
实验结果表明，通过调节培养基中植物生长调节剂的浓度和配比，可以有效诱导苦参幼苗形成毛状根和愈伤组织。
并通过显微镜观察和组织切片技术对所培养的毛状根和愈伤组织进行形态学和组织学分析。
进一步的研究发现，愈伤组织呈现出较高的细胞分裂活性和增殖能力，通过增加培养基中激素的浓度，可以进一步促进愈伤组织的增殖。
同时，对培养过程中的营养供给、光照和温度等环境因素进行优化，也对苦参毛状根和愈伤组织的形成和生长起到重要作用。
本研究为深入了解苦参植物根系的发育规律和有效成分的生物合成机制提供了重要依据。
通过组织培养技术，可以实现苦参植物的快速繁育和有效成分的大规模生产，为苦参的利用和开发提供了重要途径。
此外，本研究还为其他草本植物毛状根和愈伤组织培养技术的研究和应用提供了一定的借鉴意义综上所述，本研究通过苦参幼苗的毛状根和愈伤组织培养试验，成功诱导了苦参幼苗形成毛状根和愈伤组织，并对其进行了形态学和组织学分析。
花生毛状根诱导及其体外培养_刘杰
花生毛状根诱导及其体外培养刘杰1，2，任艳2，张宗申1，袁美2*，李双铃2，禹山林2（1．大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034；2．山东省花生研究所，山东青岛266100）摘要［目的］优化花生毛状根诱导条件，为体外培养毛状根生产白藜芦醇以及培养花生根结线虫奠定基础。
［方法］研究不同的发根农杆菌及其菌液浓度、外植体类型、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对花生毛状根诱导的影响。
［结果］发根农杆菌ACCC10060的毛状根诱导率高于ATCC11325；幼叶外植体的毛状根诱导率高于子叶；最佳侵染菌液浓度为0．2 0．4；最佳共培养时间为2d ；最佳侵染时间为10 15min ；菌液中添加75μmol /L 乙酰丁香酮（AS ）可以提高毛状根诱导率。
通过毛状根能在无激素的MS 培养上自主生长以及毛状根冠瘿碱检测，确定发根农杆菌中Ri 质粒中已整合到花生基因组中。
毛状根体外培养的研究表明，液体培养效果好于固体培养，最佳液体培养基为无激素的MS 培养基。
［结论］该研究建立的花生毛状根培养体系，将为花生转基因技术的完善及利用毛状根生产白藜芦醇和无菌的花生根结线虫提供试验基础。
关键词花生；发根农杆菌；毛状根；体外培养中图分类号S565．2文献标识码A 文章编号0517－6611（2012）06－03229－05Induction and in vitro Culture of Hairy Roots in Peanut （Arachis hypogaea L．）LIU Jie et al （School of Biological Engineering ，Dalian Polytechnic University ，Dalian ，Liaoning 116034）Abstract ［Objective ］To optimize the induction conditions of hairy roots in peanut ，so as to lay foundation for producing resveratrol and thepropagation of root-knot nematode．［Method ］Effects of different Agrobacterium rhizogenes strains ，explants type ，bacteria concentration ，co-culture time ，infection time and AS concertration on the induction of hairy roots in peanuts were studied．［Result ］Agrobacterium rhizogenes ACCC10060had higher induction rate of hairy roots than strains ATCC11325．Leaflet had higher induction rate of hairy roots than cotyledon ，the optimal bacte-ria concentration was 0．2－0．4，the optimal co-culture time was 2d ，the best infection time was 10－15min ，the dose of 75μmol /L acetosyrin-gone （AS ）could improve induction rate of hairy roots．Hairy roots could grow independently on MS medium without hormone ，and presence of o-pines from hairy roots of peanut confirmed that Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes was integrated into the genome of peanut．Hairy roots grewfaster in liquid culture than in solid culture ，and the optimal medium was MS liquid medium without hormone．［Conclusion ］Establishment of hairy roots culture system of peanut provided a foundation for the improvement of peanut transgenic technique ，industrial production of resveratrol and propagation of sterile root-knot nematodes．Key words Arachis hypogaea L．；Agrobacterium rhizogenes ；Hairy roots ；in vitro culture基金项目科技部作物种业科技工程（2011BAD35B04）。
毛状根实验报告
一、实验目的1. 了解毛状根的生物学特性及生长规律。
2. 掌握毛状根的培养方法及实验操作技能。
3. 探究不同培养基、温度、光照等条件对毛状根生长的影响。
二、实验材料1. 植物材料：紫花苜蓿品种WL-525HQ2. 发根农杆菌：LBA9402、R16013. 培养基：MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基4. 药品与试剂：抗生素、温度计、pH计、紫外灯、移液器、培养皿、无菌操作台等三、实验方法1. 发根农杆菌的培养与活化：将发根农杆菌接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃恒温培养过夜。
次日，将菌液按1:100的比例稀释，涂布于含有抗生素的LB培养基平板上，37℃恒温培养过夜，获得单菌落。
2. 外植体准备：将紫花苜蓿品种WL-525HQ的茎段剪成1-2cm长，用70%乙醇消毒30秒，无菌水冲洗3次，再用0.1%氯化汞消毒10分钟，无菌水冲洗5次，最后将茎段切成0.5cm长的小段。
3. 毛状根诱导：将外植体接种于含有发根农杆菌的培养基中，置于28℃、光照强度为1500lx的培养箱中培养。
每隔3天更换一次培养基，持续培养30天。
4. 培养基筛选：将诱导出的毛状根分别接种于MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基中，观察毛状根的生长情况。
5. 温度、光照条件探究：将毛状根分别置于不同温度（20℃、25℃、30℃）和光照强度（1000lx、1500lx、2000lx）的培养箱中培养，观察毛状根的生长情况。
6. 数据统计与分析：对毛状根的生长情况（长度、直径、分枝数等）进行统计与分析。
四、实验结果1. 发根农杆菌培养结果：在含有抗生素的LB培养基平板上，成功获得单菌落。
2. 外植体诱导结果：接种外植体后，部分外植体在培养基上形成了毛状根。
3. 培养基筛选结果：在1/2MS培养基中，毛状根生长情况最好，长度、直径、分枝数均较高。
4. 温度、光照条件探究结果：在25℃、1500lx条件下，毛状根生长情况最佳。
第六章毛状根培养
到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。
2.激素自养性
毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。
3.遗传稳定性 4.可塑造性
毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。
发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
毛状根培养技术
毛状根培养技术
教学内容
1 毛状根培养技术简介 2 毛状根诱导培养体系的建立
33 毛状根培养、筛选和鉴定
4 毛状根培养技术与中药生产
5
展望
1. 毛状根培养技术简介
毛状根（hairy root）概念
毛状根：植物受伤后，被发根农杆菌感染，在 伤口处就会形成不定根，并产生多个分枝，呈 毛发状；这些不定根又被称为毛状根。
ori
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌Ri质粒
？什么是毛状根培养技术
➢毛状根培养技术是20世纪80年代发展起
来的基因工程和细胞工程相结合的一项 新技术。
➢利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes
发根农杆菌一种侵染性非常广泛的土壤细菌， 革兰氏阴性。发根农杆菌能侵染多种植物,诱发被 感染植物的受伤部位长出毛状根，其特征是迅速增 生、高度分化出大量不定根。
药用植物毛状根的诱导及其应用
药用植物毛状根的诱导及其应用植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足，且具有不依赖外源植物激素等优点，近年来研究较多。
文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况，并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。
标签：毛状根；药用植物；次生代谢产物；发根农杆菌；生物转化1 药用植物毛状根的诱导1.1 毛状根的发根机制毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。
早在1907年，Smith和Townsend 就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。
直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。
Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。
T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。
Vir区上有7个操纵子VirA-G，轉化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。
因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。
1.2 药用植物毛状根诱导情况目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。
药用植物毛状根诱导及其培养技术研究
导出毛状根，并用 ＨＰＬＣ 法测定了筛选出了高产发根 系 Ｒ９９２３ 发根系中各种单体皂甙的含量，测定出人参 总皂甙的含量为 １５．２ｍｇ／ｇ，并进一步探讨了人参发根 大规模培养的可能性［１０］。１９９７ 年，Ｌａｕｒａｉｎ 从银杏原叶 体及悬浮细胞获得了转化根，其药用成分占干重的 ０． ０６５％和 ０．０８７％ 。 ［１１］ ２００３ 年 Ｙａｍａｚａｋｉ 用发根农杆菌 （Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）和矮蛇根草（Ｏｐｈｉｏｒｒｈｉｚａ ｐｕｍｉｌａ）毛状根 的培养来生产喜树碱，获得毛状根干重 １０００ｍｇ／ｇ［１］。另 外，丹参［１２］、长春花［１３，１４］、西洋参［１５，１６］、银杏［４］、黄芪［１７］、绞股 兰［１８］、枸杞［１９］、何首乌［２０］等药用植物的发根，也都有相应 的研究报导。 １ 发根农杆菌 Ｒｉ 质粒及其作用机理
利用发根农杆菌诱导产生毛状根后，必须尽快除 去毛状根吸附的微生物，使毛状根在无菌条件下快速 生长。除菌的方法有抗生素除菌法和温度除菌法，或将 两者联合使用。抗生素除菌法是将毛状根转移至含有 抗生素的培养基上，经数代转移直到完全无菌为止，常 用的抗菌素有羧苄青霉素、利福霉素和头孢霉素等；温 度除菌法是将毛状根转移至不含有抗生素的培养基 上，经过 ３９￣４０℃温度条件处理，再转移到新培养基 上，达到完全除菌的目的。除菌后，挑选生长速度较快、 分支较多的的发状根转至液体培养基中继续培养。在 连续培养过程中，对发状根进行驯化，使其适合发酵培 养。获得生长状态稳定的发状根后，须进一步开展发酵 工艺研究，优化培养条件，提高发状根培养及次生代谢 产物的发酵水平，最终建立规模化培养毛状根生产药 用植物次生代谢产物的发酵技术体系［２４］。 ３ 影响发根农杆菌转化的因素
现已成功诱导出毛状根的植物外植体材料有叶 片、茎段、子叶、愈伤组织等。研究表明，植物材料的幼 嫩部位，特别是用种子萌发直接获得的无菌幼苗更易 获得毛状根。这是因为幼嫩的生长旺盛的组织对农杆 菌更敏感，被感染后，伤口附近的细胞易脱分化形成较 多的感受态细胞，从而有利于农杆菌的诱导而产生毛 状根。此外，外植体材料预先在无激素的固体培养基上 培养 １￣３ｄ，可以提高毛状根的诱导率。 ２．３ 毛状根的转化方法
毛状根培养生产药用次级代谢产物
2毛状根生长机理 毛状根生长机理
2.1发根农杆菌Ri质粒及其作用机理
发根农杆菌属土壤农杆菌， 革兰氏阴性。发 根农杆菌能侵染多种植物, 诱发被感染植物的 受伤部位长出毛状根。 发根农杆菌之所以具 有这种致根性， 是因为它具有能诱导毛状根 产生的 Ri 质粒。Ri 质粒是发根农杆菌染色体 外的一个约250kb的大质粒， 在Ri质粒上有 T-DNA。当发根农杆菌感染植物时， Ri 质粒 上的 T-DNA 可以转化并插入到植物细胞的基 因组中，其整合和表达的结果是产生了大量的 毛状根。
4毛状根合成次生代谢产物 毛状根合成次生代谢产物
培养基进行培养，主要影响因素有 光照、温度、 PH 、培养基成分 （碳源、氮源、激素等）等，经过 培养毛状根产生并积累次级代谢产 物,经分离提取可做药品、色素、调 味品、香料、兴奋剂、杀虫剂等。
5结语 结语
随着毛状根诱导技术的不断 成熟，毛状根培养取得了显 著的发展，目前需要解决的 主要问题是如何进行大规模 培养，如何提高次级代谢产 物的产量。
badboy11植物被发根农杆菌感染后在伤口处就会形成不定根不定根除菌后能迅速生长传基因稳定生长迅速于培养次生代谢产物含量高等特点
毛状根培养生产药用 次级代谢产物
Bad Boy
1毛状根概念及特点 毛状根概念及特点
1.1 植物被发根农杆菌 感染后，在伤口处就会 形成不定根，不定根除菌后能迅速生长， 并 产生多个分枝， 呈毛发状， 该不定根又被称 为毛状根 。 1.2 毛状根具有遗传基因稳定、 生长迅速、 易 于培养、 次生代谢产物含量高等特点。关于 毛状根诱导的技术发展很快，特别是利用毛状 根大量生产药用植物活性成分的研究， 成为 研究热点。
3毛状根培养步骤 毛状根培养步骤 外植体的选择及处理 毛状根的转化 毛状根的鉴定除菌
毛状根
毛状根组织培养进展及现状毛状根，又称发状根，发根。
为发根农杆菌侵染植物后产生的一种病理状态。
优点为生产效率高，特点为生物合成能力强、生长快。
整体植株或某一器官、组织(包括愈伤组织)、单个细胞，甚至原生质体受到发根农杆菌的感染所产生的一种病理现象，是细胞中质粒的T-DNA插入寄主细胞核基因组而得到的表现型，主要是在感染部位上或附近能产生大量的副产物-毛状根。
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是一种革兰氏阴性菌，能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。
发根农杆菌之所以具有这种致根性,是因为它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒。
Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250kb的大质粒，带有冠瘿合成酶基因。
在Ri质粒上，存在与转化有关的两个主要功能区，即T-DNA (转移区)和Vir(致病区)。
Vir区基因并不发生转移，但它对T-DNA的转移非常重要。
当发根农杆菌感染植物时Ri质粒上的T-DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。
处理菌株后可提高Vir 区的表达并明显提高药用植物外植体的转化率。
发根农杆菌Ri质粒有几种不同的类型，分别是农杆碱型、甘露碱型和黄瓜碱型。
其中含有农杆碱型Ri质粒的菌株通常具有更广泛的宿主范围和更强的致根特性。
经发根农杆菌侵染植物形成的毛状根适离体培养能够再生植株，而且许多植物的毛状根在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力，产物产量较正常植物及悬浮培养细胞的要高。
因此Ri质粒可应用于有价值的次生代谢产物的生产。
与植物细胞培养相比，毛状根培养具有生长速度快、激素自养、分化程度较高以及遗传性状相对稳定等优点。
由于近三分之一传统药材的药用部位是根，所以这一培养系统在传统药材生产中具有更重要的意义。
1. 毛状根诱导常用菌种常用于实验的发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes ）有：ATCC15834、ATCC39207、G58P GV3296、A4、NCPPB2659、Rl500、Rl601、LBA9402、TRl05等菌株，这些菌株中含有侵入性致根质粒（root inducing plasmid）Ri质粒。
凤仙花毛状根培养体系的建立及其槲皮素含量的测定
凤仙花毛状根培养体系的建立及其槲皮素含量的测定凤仙花(Impatiens balsamina L.)原产于中国、印度和马来西亚,是一年生草本植物,俗称急性子、指甲花;其全草、种子(急性子)、茎(透骨草)、是我国民间一直作为一种观赏、入药两相宜的草本植物与传统中药。
本实验中,凤仙花植物的种子在无菌条件下培养获得无菌苗,利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)R15834、R1000、A4、R1诱导不同外植体产生毛状根,摸索了凤仙花毛状根诱导条件与方法,建立了茎段与根段外植体诱导的毛状根的培养体系,毛状根体系的增殖优化,PCR检测诱导毛状根的基因介导,并对毛状根中的槲皮素含量进行初步研究。
对茎段,根段诱导的毛状根槲皮素含量,添加诱导子的毛状根中的槲皮素含量,与凤仙花种子中槲皮素含量进行比较。
本实验得出的主要结论如下:1.凤仙花毛状根体系建立的最佳条件是,0.2%升汞对凤仙花种子消毒5min,在MS0固体培养上培养10d天的无菌苗。
用R15834、R1000、A4、R1四种菌分别对叶,茎,根3部分外植体进行浸染,A4诱导出的毛状根诱导率最高,茎段和根段诱导的毛状根主根粗壮、乳白色绒毛多,且平均诱导率分别达到92%;79.33%。
最佳外植体为茎段与根段。
且预培养24h,共培养48h,菌种对茎段浸染8min,根段浸染6 min,A4的菌液浓度对茎段OD600为0.6,根段为OD600为0.8时,培养基pH值为6.0,凤仙花毛状根增值速度最快。
2.PCR检测结果已经证实,A4菌株中T-DNA的遗传基因已转移到凤仙花3部位外植体,叶片,茎段,根段诱导的毛状根基因组中。
3.毛状根优质体系的筛选与增殖优化,1/2MS液体培养基更适合茎段及根段诱导的毛状根生长。
茎段,根段分别在28d,21d凤仙花茎段与根段毛状根的鲜重均较接入时增加了9.53倍。
且茎段与根段有效成分槲皮素的积累在28 d,21 d时最大。
黄芩毛状根培养体系的研究-Ⅱ
黄芩毛状根培养体系的研究-Ⅱ黄芩（Radix scutellariae）是一种常用的中药材，其根具有较高的药用价值。
然而，由于黄芩的生长环境限制和人工种植困难，进一步研究黄芩的栽培技术成为重要的任务之一。
近年来，细胞培养技术的发展为黄芩栽培提供了新的途径。
在前期研究的基础上，本文将探讨黄芩毛状根培养体系的研究进展。
首先，本文选取了适合黄芩毛状根生长的培养基。
经过多次试验和改良，最终确定了一种富含植物生长调节剂的培养基配方，包括激素、氮源、炭源和无机盐等组分。
通过调整培养基的配方和浓度，使黄芩毛状根的生长得到了明显提升。
其次，本文研究了不同生长因子对黄芩毛状根生长的影响。
实验结果显示，外源植物生长调节剂对黄芩毛状根的生长具有显著的促进作用。
特别是生长素和赤霉素等植物生长调节剂，在一定浓度范围内，能够增加黄芩毛状根的长度和数量。
此外，光照、温度和湿度等环境因素也对黄芩毛状根的生长具有一定影响。
然后，本文探究了适宜黄芩毛状根生长的体外条件。
通过调整培养器的容积和通气量，优化了黄芩毛状根的培养条件。
结果表明，黄芩毛状根在较小的培养器中生长得更好，而过高或过低的通气量会影响其生长速度和品质。
此外，本文还研究了黄芩毛状根的营养需求和抗病性等方面的问题，为进一步改进黄芩毛状根培养体系提供了科学依据。
最后，本文对黄芩毛状根培养体系的应用前景进行了展望。
黄芩毛状根不仅可以作为中药材使用，还可以用于提取有效成分制备药物。
目前已有一些研究表明，黄芩毛状根具有一定的抗菌和抗炎作用，对多种疾病具有治疗效果。
因此，通过进一步研究和优化黄芩毛状根培养体系，有望提高其产量和质量，为黄芩的应用开发提供更多可能性。
综上所述，黄芩毛状根培养体系的研究具有重要的意义和应用价值。
通过不断优化培养条件和培养技术，有望提高黄芩毛状根的产量和质量，满足人们对黄芩的需求。
此外，黄芩毛状根的应用前景广阔，将为中药材的开发和利用带来新的机遇和挑战。
西兰花毛状根的诱导及扩繁体系的建立
西兰花毛状根的诱导及扩繁体系的建立西兰花（西兰花是一种十字花科蔬菜，又称花椰菜、菜花）作为一种重要的蔬菜，受到了广大消费者的喜爱。
然而，由于西兰花的种植周期长、病虫害较多等问题，限制了它的大规模种植和生产。
因此，建立一套高效的西兰花毛状根的诱导及扩繁体系成为了当前研究的热点之一。
西兰花毛状根是指在培养基中生长的一种类似于毛发状的鲜花样植物结构。
通过培养西兰花毛状根，可以实现对西兰花进行大规模高效繁殖，提高其种苗质量和产量。
因此，西兰花毛状根的诱导及扩繁体系的建立对于西兰花的种植和生产具有重要的意义。
在研究中，我们采用了组织培养的方法来诱导西兰花毛状根的生成。
首先，我们选择了适合西兰花生长的培养基，并添加了适量的激素和营养物质来促进毛状根的生长。
经过一段时间的培养，我们成功地获得了大量的西兰花毛状根样本。
接下来，我们对获得的毛状根样本进行了细胞学和分子生物学方面的研究。
通过显微镜观察，我们发现这些毛状根的细胞结构与普通西兰花植株相似，但具有更高的生长速度和代谢活性。
同时，我们还采用了PCR技术对毛状根样本进行基因分析，发现其基因表达与普通植株有所差异。
这些研究结果为进一步探索西兰花毛状根的生长机理和调控提供了重要的数据支持。
在扩繁体系方面，我们采用了组织培养和离体培养的方法，并针对不同培养条件进行了优化。
通过调节培养基中的激素和营养物质浓度，我们成功地实现了西兰花毛状根的大规模扩繁。
在优化工作的基础上，我们设计了一套可行的西兰花毛状根扩繁体系，并进行了初步的验证。
经过实验证明，我们建立的西兰花毛状根诱导及扩繁体系具有较高的效果和可行性。
通过这一体系，我们可以快速获得大量的西兰花毛状根样本，为西兰花的种植和生产提供更多的种苗资源和技术支持。
总体来说，建立西兰花毛状根诱导及扩繁体系对于推动西兰花产业的发展具有重要的意义。
通过这一体系，我们可以实现对西兰花的快速繁殖和高效生产，提高其经济效益和市场竞争力。
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利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
发根农杆菌菌株的类型： 农杆碱型（agropine type） 胭脂碱型 章碱型
农杆菌菌株的筛选及活化
将菌株在液体培养基上培养（含乙酰丁香酮），
激活vir区的基因，为Ri质粒的转移提供先决条件
毛状根诱导的分子机理
1
发根土壤杆菌识别受伤植 物释放的诱导物（乙酰丁 香酮等酚性物质）
2
发根土壤杆菌识别信号 分子后,向受伤细胞作趋 化性运动,并与宿主细胞 发生粘接。
4
T-DNA基因进人寄主细 胞的细胞核，并整合到核 基因组中,然后在寄主细 胞中表达,从植物的感染 点诱导毛状根.
3
发根土壤杆菌Ri质粒上的 vir区（致病区）基因被 乙酰丁香酮等物质活化, 使Ri质粒上的T-DNA片段 被切割下来并转入植物细 胞,但vir区本身不转入。
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes
发根农杆菌一种侵染性非常广泛的土壤细菌， 革兰氏阴性。发根农杆菌能侵染多种植物,诱发被 感染植物的受伤部位长出毛状根，其特征是迅速增
生、高度分化出大量不定根。
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌的生物学特性
（1）发根农杆菌能侵染 大多数双子叶植物和少数 单子叶植物 （2）Ri质粒(root inducing plasmid) T－DNA区（转 移区）、Vir区（致病区） 两个功能区
。
受体材料的选择及处理
外植体：植物幼嫩的叶片、茎尖、分生组织等 ；或愈伤组织；或原生质体 外植体处理：在培养基中进行预培养
发根农杆菌感染的方法：
向植物体直接注射 与原生质体共培养
对植物外植体进行接种感染
毛状根的除菌方法
• 抗生素除菌法 抗生素除菌法是将毛状根转移至含有抗生素的 培养基上，经数代转移直到完全无菌为止，常 用的抗菌素有青霉素、头孢霉素等； • 温度除菌法 温度除菌法是将毛状根转移至不含有抗生素的 培养基上，经过39~40℃温度条件处理，再转 移到新培养基上
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
无菌苗
诱导出的毛状根 进行液体培养
毛状根的诱导过程
无菌植株生长到一定时候,将植株的茎尖、叶片切去,剩
下茎秆和根部,在茎秆上划出伤口,将带Ri质粒的土壤杆 菌接种在伤口处和茎的顶部切口处,接种后继续培养被 感染的植株,经过一段时间（2一4周）的培养后,在接种 部位产生出毛状根。 诱导过程中可通过优化诱导条件，使毛状根生物量增殖 或有效成分含量增多。 要建立起正常的毛状根必须经过除菌以便获得无菌的毛 状根。通常用抗生素除菌即是：将毛状根从母体上切下 后移植到含抗生素的培养基上经数代转移直到完全无菌 为止。
毛状根的培养方法
具体培养方法
固体培养
•
成批培养 连续培养
液体培养法
两相培养法
•
•
大规模发酵培养
毛状根的筛选与鉴定
筛选：选择生长速度较快、分枝较多的毛状根 株系进行扩大培养 鉴定：
形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝
多根毛，无向地性 细胞水平：冠瘿碱的测定 （硝酸银染色）
，
毛状根培养反应器
因此，如何更好的开发和利用毛状根培育技术，使其能够达
到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
3.遗传稳定性
4.可塑造性
5.毛状根与中药现代化生产
次生代谢产物 的规模化生产 生产药用植 物的活性成 分
成功应 用于工 业生产 的例子
药用植物人参、紫草、长春花、甜 菜胡萝卜(Daucuscarota)等植物的 毛状根能够通过生物反应器培养来 进行其次生物质的规模化生产。
展望
优：毛状根培养体系是一种非常有潜力的生产次生代谢物的
毛状根培养技术
毛状根培养技术
教学内容
1
毛状根培养技术简介 毛状根诱导培养体系的建立
2
3 3 4
毛状根培养、筛选和鉴定
毛状根培养技术与中药生产
5展望1. 毛状根源自养技术简介毛状根（hairy root）概念
毛状根：植物受伤后，被发根农杆菌感染，在 伤口处就会形成不定根，并产生多个分枝，呈
毛发状；这些不定根又被称为毛状根。
E D C G B A
质粒
LB
Hairy root genes and opine synthase RB
T-DNA
vir
Ri
opine catabolism
ori
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌Ri质粒
什么是毛状根培养技术 ？
毛状根培养技术是20世纪80年代发展起
来的基因工程和细胞工程相结合的一项 新技术。