杆状病毒表达系统昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定
昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展_刘高强
收稿日期: 2004-02- 23 修回日期: 2004- 04- 29 * 国家自然科学基金资助项目(30070627) * * 电子信箱: gqliugq@ sohu. com
第7 期
刘高强 等: 昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展
41
表 1 一些代表性的杆状病毒基因及其功能
基因
polh p10 gp64 p619 gp41 vp39 hel dnapol lef- 1 lef- 2 lef- 3 ie- 1 ie- 2 p35 pe38
表达产物和功能
多角体蛋白; 构成蛋白质晶体起保护作用 10 k 蛋白; 与多角体膜形成、病毒多角体聚集、细胞核解体有关 BV 包膜结构蛋白; 与病毒入侵细胞有关 核心蛋白, 使病毒基因组 DNA 浓缩 PDV 结构糖蛋白 壳体主要结构蛋白 解螺旋酶, 病毒 DNA 复制和晚期表达因子, 也与 AcMNPV 的宿主域扩大有一定关系 DNA 聚合酶; 病毒 DNA 复制必需 31k; DNA 复制和晚期表达因子 24k; DNA 复制和晚期表达因子 DNA 复制和晚期表达因子 67k 蛋白; 早期转录、病毒 DNA 复制和晚期表达因子, 刺激增强子活性 47k 蛋白; 早期转录、病毒 DNA 复制和晚期表达因子, 刺激增强子活性, 也与杆状病毒宿主范围有关。 35k 蛋白; 抗细胞凋亡, DNA 复制和早、晚期表达因子 38k; 参与病毒 DNA 复制的调节, 能激活解旋酶基因的表达, 也与杆状病毒宿主范围有关。
昆虫杆状病毒表达系统具有安全性高, 对外源 基因克隆容量大, 重组病毒易于筛选, 具有完备的 翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力 等特点[1 ] , 现已成为基因工程四大表达系统( 即杆 状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统) 之一。近 年来, 昆 虫杆状病毒表 达系统的 发展很 快, 本文综述了它的最新研究进展, 并在此基础上 分析其存在的主要问题和应用前景。
杆状病毒表达蛋白
杆状病毒表达蛋白1 donor vector的构建1.1 外源基因的连接1.2 转化1.2.1 取10μL连接产物放入100μL感受态细胞中。
1.2.2 冰浴30min。
1.2.3 42℃，90s。
1.2.4 马上放入冰浴中，2min。
1.2.5 加入800μL LB培养基，37℃，150rpm摇1hr。
（LB 37℃预热）1.2.6 取200μL涂Amp+LB平板。
1.2.7 37℃，恒温培养箱，倒置培养12-16hr。
1.3 鉴定1.3.1 挑取10个单菌落于Amp+LB培养基中，37℃，225rpm，摇过夜。
1.3.2 小量提取质粒，操作步骤见附录2。
1.3.3 用SalI及XbaI双酶切鉴定连接结果。
1.3.4 取1ml菌液测序。
1.4 菌种的保存1.4.1挑取单菌落于1-2ml Amp+LB培养基中。
1.4.2 37℃，225rpm摇至平稳期。
1.4.3 0.85ml细菌培养物+0.15ml灭菌甘油，混匀。
1.4.4 -80℃保存。
2 转座2.1 转座反应2.1.1 将DH10Bac放入冰中备用。
2.1.2 轻轻混匀，取100μL DH10Bac细胞于遇冷的15ml圆底灭菌管中。
2.1.3 加入下列质粒DNA并轻混匀。
pFastBac TM construct 1ng(5μL)pFastBac TM control 1ngPUC19 control 50pg2.1.4于冰中放置30min。
2.1.5 42℃，热激45s，不要摇动。
2.1.6 马上放入冰浴中，2min。
2.1.7 加入900μL室温LB培养基。
2.1.8 37℃，225rpm摇4hr。
2.1.9准备一系列10倍稀释的细菌培养物（10-1、10-2、10-3），每板加入100μL的稀释菌液。
（平板为：50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）。
利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法[发明专利]
![利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9314c50666ec102de2bd960590c69ec3d5bbdb2d.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911359260.7(22)申请日 2019.12.25(71)申请人 乾元浩生物股份有限公司地址 100068 北京市丰台区南四环西路188号总部基地11区20号楼(72)发明人 袁野 岳建新 王飞 孙灵睿 周蕾蕾 陈秋阁 向王震 张秀美 李浩鹏 李浩哲 朱昊敏 魏杰 安铁军 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人 黄爽(51)Int.Cl.C12N 15/866(2006.01)(54)发明名称利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法(57)摘要本发明提供一种利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法。
利用本方法可进行悬浮细胞摇瓶培养及发酵罐生产。
对基于Sf9细胞悬浮培养技术的重组蛋白表达效果进行检测，目的蛋白可达到分泌型表达，无需细胞冻融及其复杂的纯化工艺。
本工艺简单，易放大，无需换液，仅使用一种培养基便能够达到细胞生长繁殖及蛋白表达的目的。
权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图2页CN 111019973 A 2020.04.17C N 111019973A1.利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)通过Bac -to -Bac系统，构建包含编码重组蛋白DNA片段的重组穿梭质粒Bacmid，然后将重组穿梭质粒Bacmid与转染试剂混匀后转染悬浮培养的昆虫细胞，当细胞活率降至60-80％时收获培养上清，即为P0代重组杆状病毒；(2)用P0代重组杆状病毒接种摇瓶中悬浮培养的昆虫细胞，在转数130-150rpm，温度27±0.5℃条件下进行摇床培养，当≥90％的细胞发生明显病变并失去活力时，收获培养上清；接种时，细胞密度为2×106-4×106个/mL，装液量为摇瓶体积的1/4～1/3。
昆虫杆状病毒表达系统研究进展
昆虫杆状病毒表达系统研究进展昆虫杆状病毒表达系统研究进展摘要：昆虫杆状病毒表达载体系统具有安全性好、重组蛋白表达量高、能同时表达多个基因、重组蛋白翻译后加工完整等特点，因而得到了广泛的应用。
随着重组杆状病毒构建技术的不断发展，昆虫杆状病毒表达载体系统的操作在逐渐简化，重组杆状病毒获得的效率也在不断提高。
昆虫细胞培养技术的改进和转基因昆虫细胞系的发展，进一步推动了昆虫杆状病毒表达载体系统在商品化药物、治疗性抗体、生物农药研发和基因治疗中的应用。
尽管仍存在着重组蛋白降解的问题，但随着分子生物学技术的发展，对杆状病毒载体的研究与改造也会更加深入，未来昆虫杆状病毒表达载体系统的应用将更为广泛。
关键词：杆状病毒；多角体启动子；转基因昆虫细胞系；疫苗；治疗性抗体。
前言作为当今基因工程四大表达系统之一，昆虫细胞杆状病毒表达载体系统(Insect cell baculovirus ex． pression vector system，IC-BEVS)的应用变得越来越广泛。
它不仅具有真核表达系统所具有的传统优势，同时兼具原核表达系统重组蛋白表达量高的特点，且能同时在一个载体上表达多种蛋白。
由于昆虫细胞易于悬浮培养，细胞培养基的改进也使得悬浮培养的细胞活率不断提高，最终得以实现昆虫细胞的大规模培养，这使得其在商业领域如生物医药、农业、疫苗研发等方面均获得了广泛的应用[1]。
1 杆状病毒的分类与分子生物学杆状病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)，分为核多角体病毒属和颗粒体病毒属，病毒粒子呈杆状，是一类专一性感染节肢动物并具有囊膜的DNA病毒。
基因组DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 kb之间。
杆状病毒基因组可在昆虫细胞核复制和转录，DNA复制后组装在杆状病毒的核衣壳内，因其具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入而成为表达大片段DNA的理想载体。
其中，目前用作外源基因表达载体的杆状病毒主要为核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
昆虫杆状病毒表达系统的研究进展与应用
凌 同 综述； 余黎 ， 白慕群 审校
兰州生物制 品研究所有 限责任公司 甘肃省疫苗工程技术研究 中心 ， 甘肃 兰州 ７ ３ ０ ０ ４ ６
摘要 ： 昆虫杆 状病 毒表达载体系统具有安全性好 、 重组 蛋 白表 达量高 、 能同时表 达多个基 因 、 重组 蛋 白翻译 后加工 完整等特点 ， 因而得到了广 泛的应用 。随着重组杆状病毒构 建技术 的不断发展 ， 昆虫 杆状病毒表 达载 体系统 的操
Ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ａ ｕ ｔ ｈ ｏ ｒ ： Ｙ Ｕ Ｌ ｉ ， Ｅ— ｍａ ｉ ｌ ： ４ ７ ９ ０ １ ６ ５ ２ ＠ｑ ｑ ． ｃ ｏ ｍ ；Ｂ Ａ Ｉ Ｍｕ — ｑ ｕ ｎ， Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ： ８ ４ ０ ７ ９ １ ０ ５ １ ＠ｑ ｑ ． ｃ ｏ ｎ ｒ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｉ ｎ ｓ ｅ ｃ ｔ － ｂ ａ ｃ ｕ ｌ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍｓ ａ ｒ ｅ ｂ ｅ ｃ ｏ ｍｉ ｎ ｇ ｗ ｉ ｄ ｅ ｌ ｙ ｕ ｓ ｅ ｄ ｄ ｕ ｅ ｔ ｏ ｉ ｔ ｓ ｓ ａ ｆ ｅ ｔ ｙ ，ｈ ｉ ｇ ｈ ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ｙ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ，ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｍｏ ｒ ｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｏ ｎ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｓ ａ ｍｅ ｔ ｉ ｍｅ ａ ｎ ｄ ｃ ｏ ｍｐ ｌ ｅ ｔ ｉ ｏ ｎ ｐ ｏ ｓ ｔ — ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｌ ａ ｔ ｅ ｍｏ ｄ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ．Ａｓ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｆ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｂ ａ ｃ ｕ ｌ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｈ ａ ｓ ｂ ｅ ｅ ｎ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｅ ｄ，ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｉ ｎ ｓ ｅ ｃ ｔ — ｂ ａ ｃ ｕ ｌ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ
Bac-to-bac中文说明书
Bac-to-bac中⽂说明书Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的⽅法产⽣重组杆状病毒。
此⽅法基于让已经转⼊杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座⼦的表达框的质粒在Ecoli中扩增。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产⽣包含⽬的位点的表达结构，这个⽬的基因的产⽣被杆状病毒特意位点启动⼦控制。
*⼀个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产⽣重组杆粒。
*⼀个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产⽣重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素⼄酰转移酶。
Bac-to-Bac表达系统的优点：使⽤这个系统产⽣重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使⽤同源重组产⽣重组杆状病毒所需的4-6周相⽐，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和⾮重组病毒的⼏率*可以快速同时进⾏⼤量重组，适合表达功能性研究的蛋⽩选择pFastBac菌体（Vector）：⼤量的pFastBac菌体都适于进⾏Bac-to-Bac表达系统。
选择对于你的需要最合适的菌体。
指南⽤途：指南提供了⼀个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆⽬的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最⾼效的DH10Bac TM产⽣重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆⾍细胞产⽣重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使⽤病毒株感染昆⾍细胞表达⽬的重组蛋⽩重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是⽤来帮助你产⽣重组杆状病毒，在昆⾍细胞中进⾏⾼⽔平表达⽬的基因的系统。
虽然他可以帮助你很容易的产⽣杆状病毒表达你的重组蛋⽩，但是使⽤这系统更倾向于有杆状病毒⽣物学和昆⾍表达背景的使⽤者。
昆虫杆状病毒表达系统的研究及其新进展
江西农业学报 ２ ０ １ （ ） ９ ９ ０６，８ ５ ：６— ９
ＡｃａＡｇｉｕｔｒｅＪａ ｇ ｉ ｔ ｒｃ ｕａ ｉｎ ｘ ｌ
昆虫 杆状 病 毒 表达 系统 的研 究及 其新 进 展
孙阳 。 张淑颖
（． １ 莱阳农学院 生命科学学 院， 山东 青岛 ２６０ ；． ６１９２ 云南农业大学 植保学 院。 云南 昆明 ６００ ） ：２ １ ５
杆状病毒在其生活史 中共有两种形式的表型存在 ， 在感染的初期 （ ２ｈ ， ０～ ４ ） 主要 以细胞 释放型病毒粒子（ｅ — ｃｌ ｌ
ｒｅｓｄｖｕ ，Ｒ ） ｅ ａｅ ｉ ｓＣ Ｖ 为主 ， ｌ ｒ 也称为胞外型病毒 （ｘａｅ ｕ ｒ ｉ ｓＥ Ｖ） ｅｔｅｌ ｌ ｒ ，Ｃ 或出芽型病毒 （ ｕｄｄｖ ｓＢ ） 在感染 的晚 ｒ ｌａ ｖ ｅ Ｂ ｄｅ ｉ ，Ｖ ； ｅ ｒ
具有结构蛋 白的作用。
在杆状病毒所表达的一系列蛋白中， 有一类蛋白具有较高的表达量 ， 并且均为病毒基 因组复制所非必需， 其中最
具代表性的有多角体蛋白与 ＰＯ蛋 白， Ｉ 均属于晚期表达的蛋白 ， 受晚期启动子的调控。昆虫的杆状病毒表达系统正是 利用了这类蛋白的优点 ， 从而提供了外源 Ｄ Ａ插入座位。 Ｎ
１ 昆虫杆状病毒表达系统的分子基础
昆虫杆状病毒是有囊膜的 ｄＤ Ａ大形病毒 ， ｓＮ 能够感染包括鳞翅 目、 膜翅 目、 双翅 目、 鞘翅 目及毛翅 目等 ７个 目的
６０ ０ 多种昆虫。目前 已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿 丫纹夜蛾核型多角体病 毒（ ｃ Ｎ Ｖ） 家蚕核多角体病毒 ＡＭ Ｐ 、 （ｍ Ｐ 、 Ｂ Ｎ Ｖ）黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒（ ｐ Ｎ Ｖ）舞毒蛾多核衣壳核 多角体病毒（ ｄ Ｎ Ｖ 、 ＯＭ Ｐ 、 Ｌ Ｍ Ｐ ）甜菜夜蛾多核衣 壳核多角体病毒 （ｅ Ｎ Ｖ）棉铃虫核型多角体病毒 （ ａ Ｐ ） ＳＭ Ｐ 、 Ｈ Ｎ Ｖ 以及斜纹夜蛾核型多角体病毒 （ｐｔＮ Ｖ 。 Ｓｌ Ｐ ） Ｍ
杆状病毒表达系统 杆状病毒滴度测定 全攻略
细胞因子的ELISA检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不 同），严格按要求操作。 标准曲线是判定实验的质量。
外周血单核细胞的分离 ：
细胞因子的定量PCR检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并 测定 RNA浓度和纯度。 （3）取0.5 µ g RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR：
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
Bac-to-bac中文说明书
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。
此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。
*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。
*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。
Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。
选择对于你的需要最合适的菌体。
指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。
虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。
测定杆状病毒滴度方法的研究进展
中性 红 染料 的第 二层琼 脂 糖凝 胶 ，７ 孵育 １ ２℃ ２—２ ４ 小时 ， 肉眼观察 进行 噬斑计 数 ； 计 算病 毒滴 度 。 ⑥ 病毒滴 度 ＝最高 稀 释倍 数 的蚀 斑数 × 高稀 释 最 倍数 ×接种 病 毒量 ｍ／ Ｌ ｌ￣
用前景。为了在 Ｂ Ｖ Ｅ Ｓ中最大程度地表达重组蛋 白 质， 确定杆状病毒与细胞 的合适 比例 ， 称为感染复数 （ ｕｔ ｌ ｉ ｆｉ ｅ ｔ ｎ ＭＯ ） 非 常 重 要 的 ， 达 Ｍ ｌｐｉ ｔ ｏ ｆｃ ｏ ， Ｉ 是 ｉ ｃｙ ｎ ｉ 为 到 在合适 的 ＭＯ Ｉ时感 染 细 胞 ， 必需 测定 病 毒 滴 度 。 这 对 于病毒 的扩 增 和获得 新 的病 毒 液时进 行重 复性 表达重 组 蛋 白是 必 不 可 少 的 ， 此本 文 就 测定 杆 状 因 病毒滴度方法的研究进展作一综述。
杆 状 病毒 表 达 载体 系统 （ ａｕ ｖ ｕ ｘｒｓｉ Ｂ ｃｌ ｉ ｓｅｐｅｓ ｎ ｏｒ ｏ ｖｃｏ ｓ ｍ， Ｅ Ｓ 是 一个 以杆 状 病毒 为 外 源基 因 ｅｔ ｓ ｔ Ｂ Ｖ ） ｒｙ ｅ
载体 ， 以昆虫细 胞 为 受体 的表 达 系 统 ， 具 有安 全 、 它
４ ￣ 同时使 Ｓ －０ ．ＩＳ Ｍ 培 养液预 热 ４ ￣ 等 体 ０Ｃ， Ｆ９ ０ Ｉ Ｆ ０Ｃ，
１ 蚀斑 检测
删＝壹 痘避 蒜
该方 法 的缺点是 ： 需 时 间长 ， ① ６～７天 ； 易 受 ②
Ｓ９细 胞 的质 量 、 层 细胞 密度 、 ／ 单 琼脂 糖 的一致 性 、 孵 育 时 间和操作 者 的熟 练 程 度 等 多种 因素 影 响 ， 验 试 结 果重 复性差 异较 大 。 １２ 使 用 Ｂ半 乳糖 苷酶 的蓝 白斑 计数 ． ． 携 带 ｌｃ ａＺ基 因 的转 移 载 体 与杆 状 病 毒 共 转 染
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法摘要本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。
该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。
说明定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法技术领域[0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。
背景技术[0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。
杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白；[2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。
杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。
[0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定) PPT
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较：
空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周
2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent
3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变慢 或不增殖
脱落 或
融合(VSV/G)
裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状 病毒滴度测定)
杆
昆虫细胞的培养
状
病 重组pFastBac质粒的构建
毒
表
重组Bacmid的产生与鉴定
达
获得重组杆状病毒
系
统
蛋白表达&病毒扩大
Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具
杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具刘拂晓1,2 柳增善2 王志亮1【摘要】杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。
相对于其他表达系统，杆状病毒表达系统具有特殊的优势：杆状病毒基因组作为表达载体可以容纳更多外源基因；杆状病毒极晚期启动子能有效调控外源蛋白的表达；昆虫细胞作为受体能够对外源蛋白进行加工修饰；杆状病毒通常只感染节肢动物，不会对人畜构成危害。
因此，该系统越来越受到人们的重视，并已应用于亚单位疫苗的研发与生产，特别其对于构建病毒样颗粒，即由一种或多种病毒结构蛋白自行装配而成且不含病毒基因组的蛋白颗粒，具有不可比拟的优势。
对此做详细评述并展望病毒样颗粒疫苗的发展趋势。
【期刊名称】生物技术通报【年(卷),期】2012(000)006【总页数】7【关键词】杆状病毒昆虫细胞病毒样颗粒杆状病毒表达系统疫苗1983年，Smith等［2］成功实践了美国学者Miller的提出的杆状病毒作为载体在昆虫细胞中表达外源基因的可行性理论：他们将干扰素基因插入至苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californi-ca nuclear polyhedrosis virus，AcNPV）表达载体，然后将其转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，Sf）细胞，成功表达了具有生物活性的人β干扰素。
此后，杆状病毒蛋白表达技术逐步建立并完善起来。
相对于传统大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞蛋白表达技术，杆状病毒技术在病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）的构建及应用方面具有不可比拟的优势。
VLP是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，高度模仿真实病毒的衣壳空间构象而不含其基因组。
大多数VLP 是良好的免疫原，既可诱导体液免疫又可诱导细胞免疫［3-5］。
随着杆状病毒蛋白表达技术的成熟，利用其构建VLP的报道也屡见不鲜。
1 杆状病毒分子生物学根据国际病毒分类委员会最新病毒分类报告，杆状病毒科（Baculoviridae）分为4个属，即α杆状病毒属（Alphabaculovirus）、β杆状病毒属（Betabaculovirus）、δ杆状病毒属（Deltabaculovirus）、γ杆状病毒属（Gammabaculovirus）。
利用细菌杆状病毒系统在昆虫细胞中表达人类UGT1A6
于Ｇ 公司； 尿苷二磷酸 ｉ ｂ ｃ ｏ Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｄ Ｈ５ α本室保存； ， 葡萄糖醛酸 （ ｕ ｒ ｉ ｄ ｉ ｎ ｅ５ ′ ｄ ｉ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ｏ ｇ ｌ ｕ ｃ ｕ ｒ ｏ ｎ ｉ ｃａ ｃ ｉ ｄ ） 购于 公司； 细胞由养生堂有限公 Ｕ Ｄ Ｐ Ｇ Ａ Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ Ｓ ｆ ９ 司友情赠送； 硝基酚、 非那西丁（ ） 购于华 ４ ｐ ｈ ｅ ｎ ａ ｃ ｅ ｔ ｉ ｎ 东医药有限公司。 １ ． ２ ｐ Ｆ ａ ｓ ｔ Ｂ ａ ｃ １ Ａ ６重组质粒的构建 将本 实 验 室 已 构 建 好 的 重 组 质 粒 ｐ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ３ ． １ （ ） 和 用 及 ＋ Ｕ Ｇ Ｔ １ Ａ ６ ｐ Ｆ ａ ｓ ｔ Ｂ ａ ｃ Ｕ Ｇ Ｔ １ Ａ ４ Ｂ Ｓ Ｐ Ｔ Ｉ Ｘ ｈ ｏ Ⅰ 双酶切， 凝胶电泳分离后， 用凝胶回收试剂盒得到纯 化 Ｕ Ｇ Ｔ １ Ａ ６片段和 ｐ Ｆ ａ ｓ ｔ Ｂ ａ ｃ片段。该两片 段 用 Ｔ ４ 转化 Ｅ ２ ℃过夜连接后， ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｄ Ｈ５ Ｄ Ｎ Ａ连接酶 ２ α感 受态细胞， 挑取阳 性 菌 落 提 取 ｐ Ｆ ａ ｓ ｔ Ｂ ａ ｃ Ｕ Ｇ Ｔ １ Ａ ６重 组质粒。酶切、 连接、 转化、 重组质粒筛选及提取等 ］ 进行。 方法按文献［ ５ １ ． ３ Ｂ ａ ｃ ｍ ｉ ｄ １ Ａ ６的制备 将ｐ Ｆ ａ ｓ ｔ Ｂ ａ ｃ Ｕ Ｇ Ｔ １ Ａ ６重 组 质 粒 转 化 Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ Ｄ Ｈ 感受态细胞， 空质粒平行操作。通过 １ ０ Ｂ ａ ｃ ｐ Ｆ ａ ｓ ｔ Ｂ ａ ｃ
年１ 月； １ （ ） ： ２ ０ ０ ４ ２ ８ ６ ４ ４ ４ － ４ ４ ８ ； １ （ ） ： ２ ０ ０ ４ Ｄ ｅ ｃ ８ ６ ４ ４ ４ － ４ ４ ８
一种测定杆状病毒滴度的方法[发明专利]
![一种测定杆状病毒滴度的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b3665a2da66e58fafab069dc5022aaea998f4180.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.10.23C N 103364560 A (21)申请号 201310309787.5(22)申请日 2013.07.23G01N 33/577(2006.01)G01N 33/569(2006.01)(71)申请人武汉中博生物股份有限公司地址430070 湖北省武汉市东湖开发区珞狮南路517号(72)发明人李晶梅 朱薇 温文生 漆世华谢红玲 靖志强 李建 秦红刚廖园园(74)专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222代理人张火春(54)发明名称一种测定杆状病毒滴度的方法(57)摘要本发明公开了一种测定杆状病毒滴度的方法，该方法包括如下步骤：将对数生长期的昆虫细胞以2×104～4×104/0.1mL/孔的细胞密度铺到细胞培养板中，置培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底；将被检的杆状病毒接种到昆虫细胞板中于培养箱中培养；弃去细胞板内培养基，固定，洗细胞板，加入gp64单抗孵育，洗细胞板，再加入羊抗鼠荧光抗体孵育，洗细胞板，荧光显微镜下观察；计算病毒的TCID 50。
本发明测定杆状病毒滴度的方法结合了间接免疫荧光，是一种直接判定各孔细胞是否感染的TCID 50测定方法，重复性好，得到的检测结果更为准确，不需要结合细胞病变来进行判断，没有主观和经验因素的影响。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书5页 附图2页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页 附图2页(10)申请公布号CN 103364560 A*CN103364560A*1/1页1.一种测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）昆虫细胞板的制备：将对数生长期的昆虫细胞以2×104～4×104/0.1mL/孔的细胞密度铺到细胞培养板中，置培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底；（2）接种杆状病毒：将被检的杆状病毒接种到昆虫细胞板中于培养箱中培养；（3）间接免疫荧光确定被感染的细胞孔数：弃去细胞板内培养基，固定，洗细胞板，加入gp64单抗孵育，洗细胞板，再加入羊抗鼠荧光抗体孵育，洗细胞板，荧光显微镜下观察，细胞膜显示亮绿色荧光判定该细胞所在孔为阳性孔；（4）病毒滴度计算：计算病毒的TCID50。
[医学]杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)
![[医学]杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)](https://img.taocdn.com/s3/m/39cdc444964bcf84b9d57bd9.png)
DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质 粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
用途
疾病诊断 病毒分离株的鉴定 不同病毒株的抗原关系研究 疫苗免疫原性的评 免疫血清的质量评价 测定实验动物血清中是否存在抗体
材料
1. 病毒
（1）冻存的病毒不能重复使用 （2）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定
进行病毒定量
2. 血清样品
（1）血清样品分装冻存于-20℃ ，一般不要反复冻融3次以上。 （2）血清样品不溶血，不长期冻存，以减少对细胞的毒性。 （3）需要有阳性和阴性对照血清，实验前需56℃灭活30分钟。
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较：
空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
将96孔细胞培养板放入37 ℃ 5% CO2培养箱中作用 45 min—60 min。
感作完成后每孔加入100 µl细胞悬液，继续置37℃ 5% CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要 观察4-5天。
结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进 行。
中和效价(PD50)的计算：
（2）置37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不
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✓疾病诊断 ✓病毒分离株的鉴定 ✓不同病毒株的抗原关系研究 ✓疫苗免疫原性的评 ✓免疫血清的质量评价 ✓测定实验动物血清中是否存在抗体
材料
1. 病毒
（1）冻存的病毒不能重复使用 （2）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定
进行病毒定量
2. 血清样品
（1）血清样品分装冻存于-20℃ ，一般不要反复冻融3次以上。 （2）血清样品不溶血，不长期冻存，以减少对细胞的毒性。 （3）需要有阳性和阴性对照血清，实验前需56℃灭活30分钟。
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
3. 细胞和细胞培养试剂（1） Nhomakorabea数生长期细胞 （2）DMEM/血清/胰酶/抗生素
固定病毒—稀释血清法
将不同稀释度的血清与固定量的病（200TCID50、 EID50或LD50）混合，适当的条件下感作一定时间以后， 再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物， 测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生 病毒感染的能力及其效价。以能保护50%组织培养细胞、 鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀 释倍数，作为该血清的50%中和效价(PD50)。
BacPAK™ Rapid Titer Kit
本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的 单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标 记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在光 学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数的换 算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。
注意事项：
1. 细胞铺板5 ×106 cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染 色，保证细胞活力≥ 95%。
杆状病毒表达系统
& 疫苗实验体液免疫与细胞免疫的检测
杆
昆虫细胞的培养
状
病 重组pFastBac质粒的构建
毒
表
重组Bacmid的产生与鉴定
达
获得重组杆状病毒
系
统
蛋白表达&病毒扩大
Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
重组pFastBac质粒的构建
选择合适的载体
重组Bacmid的产生
重组Bacmid的鉴定
Bacmid DNA ≥135kb
PCR法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insert
每次包被板子条件一致， 4 ℃ 16-18h。 方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。 2. 血清样品不溶血，防止干扰结果。
3. 设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的 OD值先减掉背景值，再计算比值和滴度。
中和抗体
微量中和实验技术
中和实验原理
分类
✓固定病毒—稀释血清法 ✓固定血清—稀释病毒法（用的很少）
Sf9 or Sf21 cells ——主要用于转染，空斑实验和滴度测定 High Five™ cells or Mimic™ Sf9 cells ——转染效率低，主要用于蛋白表达
Grace's Insect Medium with L-glutamine and supplemented with（pH 6.5）：
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较：
空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游
DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质 粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周
2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent
3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变慢 或不增殖
脱落 或
融合(VSV/G)
裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
3330 mg/L lactalbumin hydrolysate 3330 mg/L yeastolate 350 mg/L NaHCO3 10% heat-inactivated fetal bovine serum
昆虫细胞的培养
Atmosphere：air, 100% Temperature：27.0—28.0 ℃ Subculturing：
2. 病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释 度孔斑点成10倍关系的关键。
3. 整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。
4. 实验完毕3 h后数斑，效果更佳。 5. 结果判定：
疫
苗
免
ELISA抗体 体液免疫检测
疫
中和抗体
动
物
后
免
细胞因子mRNA水平检测—qPCR
疫 效
细胞免疫检测 细胞因子蛋白质水平检测—ELISA
病毒扩增&蛋白表达
✓ 扩增病毒：接毒量为 0.05—0.1 MOI
✓一般情况下，P1代毒滴度大概为1×106 — 1×107
PFU/ml， P2 代毒滴度1×107—1×108 PFU/ml
✓比如：P1代毒滴度为5×106 PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量
2×107cells，那么
✓蛋白表达：接毒量为 1—5 MOI
力
淋巴增殖实验—MTT法
评
价
ELISA抗体
1. 制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病毒
（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液 的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。
（2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，包被液PH大于蛋白 PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提 高包被效率。