白血病分子生物学课件
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白血病分子生物学朱勇梅-白血病分子生物学
•
AML1-ETO
t(8;21)(q22;q22) 6~8%原发性AML，在M2中的阳性率为
20~40%，在M2b中阳性率为90% 少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综
合症 AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能
力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性 粒细胞，且对化疗反应较敏感 AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果 好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后 较其他AML亚型（M3除外）好
的范围内（<2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。
RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的
区域的融合基因。
巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，
增加扩增效率。
RQ-PCR：可定量扩增产物。
•
白血病的分子检测
RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 荧光标记扩增产物 荧光标记引物 特异性荧光标记探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合扩增产物 SYBR Green I与DNA双链结合 动态监测荧光信号变化
•
•TaqMan探针法
•特异性高 •多重基因定量 •成本较高
•
•SYBR Green I 法
•成本低 •最适合初步筛查 •熔解曲线功能 •无法多重检测 •无模板特异性 •灵敏度低
•
白血病的分子检测
CT值：荧光信号有统计学意义显著增长 （穿过阈值线）时的循环次数
CT值与起始模板量成反比
•
白血病的分子检测
•
TEL-AML1
由于12p和21q末端在常规显带中很相似 ，因此常规细胞遗传学方法检出率仅 0.05%，需应用FISH或RT-PCR方法提 高检测阳性率
AML1-ETO
t(8;21)(q22;q22) 6~8%原发性AML，在M2中的阳性率为
20~40%，在M2b中阳性率为90% 少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综
合症 AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能
力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性 粒细胞，且对化疗反应较敏感 AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果 好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后 较其他AML亚型（M3除外）好
的范围内（<2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。
RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的
区域的融合基因。
巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，
增加扩增效率。
RQ-PCR：可定量扩增产物。
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白血病的分子检测
RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 荧光标记扩增产物 荧光标记引物 特异性荧光标记探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合扩增产物 SYBR Green I与DNA双链结合 动态监测荧光信号变化
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•TaqMan探针法
•特异性高 •多重基因定量 •成本较高
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•SYBR Green I 法
•成本低 •最适合初步筛查 •熔解曲线功能 •无法多重检测 •无模板特异性 •灵敏度低
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白血病的分子检测
CT值：荧光信号有统计学意义显著增长 （穿过阈值线）时的循环次数
CT值与起始模板量成反比
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白血病的分子检测
•
TEL-AML1
由于12p和21q末端在常规显带中很相似 ，因此常规细胞遗传学方法检出率仅 0.05%，需应用FISH或RT-PCR方法提 高检测阳性率
2019年白血病分子生物学.ppt
C-KIT突变可见于伴inv(16)的M4以及伴t(8;21) 的M2患者
26/54例(48.1%) M2b患者中检测到C-KIT基因 突变
57例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未 检测到C-KIT基因突变
以上结果提示C-KIT突变与M2b密切相关 (R=0.94, P<0.01)
TaqMan探针法
•特异性高 •多重基因定量 •成本较高
SYBR Green I 法
•成本低 •最适合初步筛查 •熔解曲线功能 •无法多重检测 •无模板特异性 •灵敏度低
白血病的分子检测
CT值：荧光信号有统计学意义显著增长 （穿过阈值线）时的循环次数
检测
白血病的分子检测
Southern blot Northern blot Western blot FISH PCR 测序 芯片
白血病的分子检测
PCR反应原理
白血病的分子检测
PCR理论方程
N = N0 x (1+E)n
N：扩增子数量 N0：起始模板数量
E：扩增效率 n：循环数
点突变 染色体重排 基因扩增
抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一类基因，
其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑 制细胞的恶变。
白血病的分子机制
白血病的分子机制
增殖过度 分化阻断 凋亡受抑
“二次打击”学说
D.Gary Gilliland Best Practice & Research Clinical Haematology.2003;16:409-417
AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果 好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后 较其他AML亚型（M3除外）好
26/54例(48.1%) M2b患者中检测到C-KIT基因 突变
57例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未 检测到C-KIT基因突变
以上结果提示C-KIT突变与M2b密切相关 (R=0.94, P<0.01)
TaqMan探针法
•特异性高 •多重基因定量 •成本较高
SYBR Green I 法
•成本低 •最适合初步筛查 •熔解曲线功能 •无法多重检测 •无模板特异性 •灵敏度低
白血病的分子检测
CT值：荧光信号有统计学意义显著增长 （穿过阈值线）时的循环次数
检测
白血病的分子检测
Southern blot Northern blot Western blot FISH PCR 测序 芯片
白血病的分子检测
PCR反应原理
白血病的分子检测
PCR理论方程
N = N0 x (1+E)n
N：扩增子数量 N0：起始模板数量
E：扩增效率 n：循环数
点突变 染色体重排 基因扩增
抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一类基因，
其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑 制细胞的恶变。
白血病的分子机制
白血病的分子机制
增殖过度 分化阻断 凋亡受抑
“二次打击”学说
D.Gary Gilliland Best Practice & Research Clinical Haematology.2003;16:409-417
AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果 好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后 较其他AML亚型（M3除外）好
白血病分子生物学知识 ppt课件
M3：M3a（粗颗粒型）和M3b（细颗粒型）
分类
Classification
二、我国修订FAB分类：1986年 ANLL（AML）： M4：
M4a：原始粒及早幼粒为主，原、幼、单≧ 20% （NEC） M4b：原单+幼单为主，原始、早幼粒>20% （NEC） M4c：原始细胞既有粒细胞特点又有单核细胞特 点，此类细胞>30% M4Eo：除有上述M4各型特点外嗜酸细胞>5%~30%
实验室检查
Lab. examination
四、免疫学检查
白血病免疫分型欧洲组（EGIL）将AL分为4型：
1 急性未分化型白血病（AUL） 2 急性混合细胞白血病
（双表型、双克隆、双系列）
积分均< 2 积分均> 2
3 伴有髓系抗原表达的ALL 淋系积分 >2
髓系积分< 2
4 单表型AML 表达淋系者 髓系积分 0
分类
Classification
三、MIC协作组MICM分类：1985年
细胞形态学 免疫学 细胞遗传学 分子生物学 Morphology Immunology Cytogenesis Molecular biology
四、 WHO髓系和淋系肿瘤分类法: 2001年 综合了FAB分类、欧美淋巴瘤分型修订案（和
儿童 成人 FAB
88 5 65 15 3 12 1 11 76 11 51 10 4 24 7 17 L1L2 L1L2 L1 L3 L1L2 L1L2
实验室检查 Lab. examination
五、染色体和基因改变
白血病常伴有特异的染色体和基因改变。 如90%AML-M3有t（15；17）（q22；q21）即15号 染色体的PML与17号染色体RARa形成PML/RARa融 合基因
白血病ppt课件全文
受累基因 AML1-ETO PML-RARα PLZF- RARα CBFβ-MYH11 CBFβ-MYH11
MLL MYC-IgH BCR-ABL
常见白血病类型
M2 M3 M3 M4Eo M4Eo M4/M5或其他型 L3 CML,ALL,AML
APL患者染色体异常t(15;17)(q22;q21)
（二）中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）
活性减低或阴性，治疗有效时活性恢复，复发时下降
（三）骨髓
增生明显至极度活跃，以粒系为主，粒/红比例明显增 高，中性中、晚幼及杆状粒细胞明显增多，原粒10％
嗜酸、嗜碱性粒细胞增多 红系相对减少 巨核细胞正常或增多，晚期减少
CML骨髓象
（四）细胞遗传学及分子生物学检查
需要特殊注意的几个问题： ①原始细胞/全部骨髓有核细胞（ANC）≥30％为 AL的诊断标准 ②“裂孔”现象 ③低增生性白血病 ④Auer小体仅见于ANLL，有独立诊断意义
Auer小体
细胞化学
急淋白血病
急粒白血病
急性单核细胞白血病
过氧化物酶（POX） 糖原染色（PAS）
（－）
（＋） 成块或颗粒状
血象
WBC：多数↑，也有正常或↓
WBC≥10×109/L——白细胞增多性白血病 WBC＜1.0×109/L——白细胞不增多性白血病
多数可见数量不等的原始和/或幼稚细胞
RBC：多数为正常细胞性贫血，少数可找到 幼红细胞
PLT：↓，约50％≤60×109/L，晚期极度减少 （＜2×109/L）
骨髓象 诊断AL的主要依据和必做检查 参见FAB分类法
3、骨髓象：骨髓增生明显或极度活跃，原始 细胞≥30%；具体参考FAB分类法
4、免疫学、细胞遗传学、分子生物学检查
白血病分子生物学84页PPT
白血病分子生物学
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩
白血病的分型PPT课件
哪些白血病需要பைடு நூலகம்行骨髓移植
目前治疗白血病的方法主要有化疗、骨髓移植、中医药，三种方法 各有特点，化疗见效快，副作用较大；骨髓移植花费高昂，风险较 大；中医药见效相对缓慢，但是可以全面调理而且副作用小，痛苦 少，花费少。通过医学界大量实践观察，认为中西医结合的方法较 为理想，具有疗效好、副作用少的优势。
• 一般来说只有标为高危的“急淋〞患儿和大约七成左右的成年患者建 议首要考虑骨髓移植，是因为这些患者，白血病细胞难以被去除，需 要加大化疗强度，以克服耐药的癌细胞，但过高强度的化疗会同时破 坏骨髓的正常造血细胞，摧毁造血功能，这就需要将造血干细胞〔或 骨髓〕移植给患者，使患者的造血功能得以重建，同时免疫功能亦得 到重建，进一步去除体内的白血病细胞
WHO分型 2001〔MICM〕
表1 急性白血病分型的三个开展阶段
FAB分型法依据白血病 细胞的形态学将急性白血病分 为急性淋巴细胞白血病〔ALL 〕和急性髓细胞白血病〔AML 〕两大类型。ALL根据细胞大 小及形态又分为L1～L3三种亚 型、AML按细胞类型不同又分 为M1～M7七型
(二) 白血病MIC分型
• 1986年FAB协作组提出了MIC分型法：
形态学 (morphology， M )
免疫学
(immunology， I )
细胞遗传学 ( cytogenetics，C )
该分型法以形态学为根底、免疫学和细 胞遗传学作补充，相互结合，使分型更趋精 确。
2001年WHO提出来WHO分型
形态学 (morphology， M ) 表观/大小
M4EO
M5（M5a、M5b）
M6 M7
WHO 分型
急性前体淋巴母细胞白血病/淋巴瘤 Precursor B and T lymphoblastic leukemia/lymphoma （ALL） Burkitt 白血病/淋巴瘤 （Burkitt leukemia /lymphoma） 极微分化 AML （AML，minimally differentiated） 未成熟 AML （AML without maturation） 成熟 AML （AML with maturation） AML with t（8；21）（q22；q22），（AML1/ETO） APL［AML with t（15；17）（q22；q12），（PML/RARα） and variants］ 急性粒-单核细胞白血病 （Acute myelomonocytic leukemia）
白血病发生的分子机理和分子诊断ppt课件
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
正常核型 AML 基因突变的分子机理异质性
Blood 2010;115:453
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
白血病细胞的内在改变(分子事件)
◆ 遗传学改变:
由白血病细胞染色体非随机改变所显示的遗传物质(基因)的结构, 位置异常, 导致基因产物(蛋白质) 的功能异常 (基因融合, 基因重排, 基因倒位等).
肿瘤/白血病基因组
●肿瘤/白血病细胞内的诸 多体细胞突变代表着患者 生命中积累突变的历史记 录。
●肿瘤/白血病细胞基因组 内突变的“驱动突变” (Driver mutation) 赋予细 胞生长优势，其余突变为 “过客突变”(passenger mutation). 基因工程分析 正常细胞至少获得5-6个 驱动突变才能转变成肿瘤 细胞。
◆白血病干细胞的免疫表型识别
CD34+ CD38- CD71- HLA-DR- CD90- CD117- CD123+其中CD90- CD117CD123+是 LSC的特异性免疫表型。 最近新增 CD47+ CD96+. LSCs 处在细胞周期的静止期, 对化疗药物阻抗, 具有独特的基因表达谱.
白血病分子生物学知识小结课件
• The most common variant is t(8;14)(q24;q32), which accounts for about 85%[9] of cases. This involves c-myc and IGH@. A variant of this, a three-way translocation, t(8;14;18), has also been identified.[10]
套細胞淋巴瘤
• 套細胞淋巴瘤占全部非霍奇金淋巴瘤(NHL)的6%。 • 這類淋巴瘤以前歸在其他亞型中，只有最近十餘年才被認識到是
一類獨立疾病。 • 認識到這些淋巴瘤有特徵性染色體移位t（11；14）即第14號染色
體上免疫球蛋白重鏈基因和第11號染色體上Bcl-1基因之間移位， 有規律地過度表達Bcl-1蛋白，最具特點的是過度表達Cyclin D1， 故肯定了該類淋巴瘤的存在。
白血病分子生物學知識小結
• 零微一未兩部分 • 三四五，粒和單 • 六紅七巨是為髓 • 一小二大三原淋
費城染色體比正常染色體小，與CML有關
Burkitt lymphoma
• All types of Burkitt lymphoma are characterized by disregulation of the c-myc gene by one of three chromosomal translocations. This gene is found at 8q24.
Leukemia. 2002 Feb;16(2):268-75. Point mutations of the BCL-6 gene: clinical and prognostic correlation in B-diffuse large cell lymphoma. Vitolo U1, Botto B, Capello D, Vivenza D, Zagonel V, Gloghini A, Novero D, Parvis G, Calvi R, Ariatti C, Milan I, Bertini M, Boccomini C, Freilone R, Pregno P, Orsucci L, Palestro G, Saglio G, Carbone A, Gallo E, Gaidano G. Author information •1UOA Ematologia, Dipartimento di Oncologia, Azienda Ospedaliera S Giovanni Battista, Torino, Italy. uvitolo@molinette.piemonte.it Abstract Although point mutations of the 5' noncoding regions of the BCL-6 proto-oncogene are frequently detected in B-diffuse large cell lymphoma (B-DLCL), a thorough analysis of the clinical correlation of these mutations has not been performed to date. In this study, BCL-6 mutations were examined by DNA direct sequencing in 103 patients with B-DLCL. BCL-6 mutations were found in 53/103 patients, including 38/76 treated with standard chemotherapy and 15/27 treated with autologous stem cell transplantation (ASCT) up front. The presence of BCL-6 mutations was correlated with clinical features at diagnosis and outcome. Mutated patients had a significantly higher LDH level (66% vs 38%, P < 0.05), and bulky disease (51% vs 32%, P = 0.05). In the whole series of patients BCL-6 mutations did not affect CR and OS. Patients with BCL-6 mutations tended to have a prolonged 5-years DFS and FFS compared to those without mutations (DFS 82% vs 63%, FFS 63% vs 49%). Among BDLCL treated with standard chemotherapy, mutated patients showed a significantly improved 5-year DFS (85% vs 61%, P < 0.05) and, notably, the only four relapses observed among mutated patients occurred in less than 8 months. The multivariate regression analysis (P < 0.01) with DFS as endpoint confirmed the independent prognostic value of BCL-6 mutations. There was a trend for 5-year failure-free survival to be better for patients with BCL-6 mutations (63% vs 43%, P = 0.09). In the 27 patients treated with ASCT, BCL-6 mutations did not correlate with outcome. These results suggest that BCL-6 mutations may predict a higher chance of being free of disease in B-DLCL treated with standard chemotherapy. Larger series of patients need to be analyzed to evaluate the clinical relevance of BCL-6 mutations properly.
套細胞淋巴瘤
• 套細胞淋巴瘤占全部非霍奇金淋巴瘤(NHL)的6%。 • 這類淋巴瘤以前歸在其他亞型中，只有最近十餘年才被認識到是
一類獨立疾病。 • 認識到這些淋巴瘤有特徵性染色體移位t（11；14）即第14號染色
體上免疫球蛋白重鏈基因和第11號染色體上Bcl-1基因之間移位， 有規律地過度表達Bcl-1蛋白，最具特點的是過度表達Cyclin D1， 故肯定了該類淋巴瘤的存在。
白血病分子生物學知識小結
• 零微一未兩部分 • 三四五，粒和單 • 六紅七巨是為髓 • 一小二大三原淋
費城染色體比正常染色體小，與CML有關
Burkitt lymphoma
• All types of Burkitt lymphoma are characterized by disregulation of the c-myc gene by one of three chromosomal translocations. This gene is found at 8q24.
Leukemia. 2002 Feb;16(2):268-75. Point mutations of the BCL-6 gene: clinical and prognostic correlation in B-diffuse large cell lymphoma. Vitolo U1, Botto B, Capello D, Vivenza D, Zagonel V, Gloghini A, Novero D, Parvis G, Calvi R, Ariatti C, Milan I, Bertini M, Boccomini C, Freilone R, Pregno P, Orsucci L, Palestro G, Saglio G, Carbone A, Gallo E, Gaidano G. Author information •1UOA Ematologia, Dipartimento di Oncologia, Azienda Ospedaliera S Giovanni Battista, Torino, Italy. uvitolo@molinette.piemonte.it Abstract Although point mutations of the 5' noncoding regions of the BCL-6 proto-oncogene are frequently detected in B-diffuse large cell lymphoma (B-DLCL), a thorough analysis of the clinical correlation of these mutations has not been performed to date. In this study, BCL-6 mutations were examined by DNA direct sequencing in 103 patients with B-DLCL. BCL-6 mutations were found in 53/103 patients, including 38/76 treated with standard chemotherapy and 15/27 treated with autologous stem cell transplantation (ASCT) up front. The presence of BCL-6 mutations was correlated with clinical features at diagnosis and outcome. Mutated patients had a significantly higher LDH level (66% vs 38%, P < 0.05), and bulky disease (51% vs 32%, P = 0.05). In the whole series of patients BCL-6 mutations did not affect CR and OS. Patients with BCL-6 mutations tended to have a prolonged 5-years DFS and FFS compared to those without mutations (DFS 82% vs 63%, FFS 63% vs 49%). Among BDLCL treated with standard chemotherapy, mutated patients showed a significantly improved 5-year DFS (85% vs 61%, P < 0.05) and, notably, the only four relapses observed among mutated patients occurred in less than 8 months. The multivariate regression analysis (P < 0.01) with DFS as endpoint confirmed the independent prognostic value of BCL-6 mutations. There was a trend for 5-year failure-free survival to be better for patients with BCL-6 mutations (63% vs 43%, P = 0.09). In the 27 patients treated with ASCT, BCL-6 mutations did not correlate with outcome. These results suggest that BCL-6 mutations may predict a higher chance of being free of disease in B-DLCL treated with standard chemotherapy. Larger series of patients need to be analyzed to evaluate the clinical relevance of BCL-6 mutations properly.
白血病分子生物学分型PPT课件
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18
RQ-PCR的操作流程
从细胞或组织中抽提DNA或RNA 用PCR或RT-PCR扩增特异片段 将PCR产物克隆到合适的载体上
体外转录成RNA片段（仅用于RNA样品）
纯化，定量和系列稀释质粒DNA或RNA 构建标准曲线（CT υ lgcopy） 样品的定量检测
校正样品基因拷贝数
-
19
白血病分子检测的临床应用
脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无 病生存期（DFS）仅6个月，3年DFS为20%， 需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后 核型和E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治 疗方案的选择至关重要 E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实
-
38
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39
TEL-AML1
t(12;21)(p13;q22) 25%儿童ALL，是儿童ALL中最常见的分子异
临床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融 合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染 色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解
-
25
PML-RARα
APL累及的RARα基因及其伙伴基因结构示意图
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26
PML-RARα
由于PML基因断裂点不同产生3种不同的 PML-RARα异构体
-
9
白血病的分子检测
PCR方法优点 快速 灵敏 特异
PCR方法缺点 假阳性 假阴性
-
10
白血病的分子检测
PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小
的范围内（<2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。
RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的
区域的融合基因。
巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，
白血病分子生物学知识小结-精品医学课件
• 真性红细胞增多症PV – JAK2基因突变V617F与PV相关性很强。 • 骨髓增生异常综合症的11q缺失突变预后极好。
CHOP方案治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL
• CHOP方案（环磷酰胺＋多柔比星＋长春新碱＋泼尼松）一直是治 疗NHL的标准方案，近年来，虽然有人先后报道了一些新的联合 方案，但其疗效均未超过CHOP方案。
• The most common variant is t(8;14)(q24;q32), which accounts for about 85%[9] of cases. This involves c-myc and IGH@. A variant of this, a three-way translocation, t(8;14;18), has also been identified.[10]
白血病分子生物学知识小结
• 零微一未两部分 • 三四五，粒和单 • 六红七巨是为髓 • 一小二大三原淋
费城染色体比正常染色体小，与CML有关
Burkitt lymphoma
• All types of Burkitt lymphoma are characterized by disregulation of the c-myc gene by one of three chromosomal translocations. This gene is found at 8q24.
套细胞淋巴瘤
• 套细胞淋巴瘤占全部非霍奇金淋巴瘤(NHL)的6%。 • 这类淋巴瘤以前归在其他亚型中，只有最近十余年才被认识到是
一类独立疾病。 • 认识到这些淋巴瘤有特征性染色体移位t（11；14）即第14号染色
体上免疫球蛋白重链基因和第11号染色体上Bcl-1基因之间移位， 有规律地过度表达Bcl-1蛋白，最具特点的是过度表达Cyclin D1， 故肯定了该类淋巴瘤的存在。
相关主题
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PCR方法优点 快速 灵敏 特异
PCR方法缺点 假阳性 假阴性
白血病的分子检测
PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小
的范围内（<2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。
RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的
区域的融合基因。
巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，
增加扩增效率。
RQ-PCR：可定量扩增产物。
想的MRD检测指标 伴此基因高表达者预后差，且表达程度
与预后相关
BCR-ABL
t(9;22)(q34;q11) 15~30%成人ALL及3~5%儿童ALL 9号染色体的断裂点与CML相同，但22号染色
体断裂点具有异质性 此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比p210要
强。在转基因试验中观察到p190诱发的白血病 具有起病早、发展快和恶性程度高的特点 BCR-ABL+ALL患者预后差，5年存活率<20%， 因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗
TEL-AML1
t(12;21)(p13;q22) 25%儿童ALL，是儿童ALL中最常见的分子异
常 目前为止尚未在T-ALL，AML或NHL中发现
t(12;21)，在婴儿白血病中极少报道，在成人 白血病患者中频率很低（<2%） 此类患者发病年龄小（2岁~10岁），WBC计 数低（<50 000/L），免疫表型为前B-ALL 此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预 后好
AML1- 阴性 ETO+
C-KIT基因突变
C-KIT为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括cFMS，PDGFRβ和c-KIT）成员之一
AML1-ETO可诱导性表达的转基因小鼠，并不 导致白血病发生
C-KIT突变可见于伴inv(16)的M4以及伴t(8;21) 的M2患者
26/54例(48.1%) M2b患者中检测到C-KIT基因 突变
形态学上S型白血病细胞常为低分化的并 且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V 型APL患者的白血病细胞体外对ATRA的 敏感度低
PML-RARα
RT-PCR检测PML-RARα是敏感且特异的 APL诊断方法，还能用于治疗后MRD监 测。PML-RARα阳性提示的分子复发常 早于临床复发3-6个月，为临床采取进一 步治疗措施提供了保障
AML1-ETO
对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融 合基因的检测对其预后判断及治疗方案 的制定相当重要
AML1-ETO定性结果不能用于评价患者 MRD情况
RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水 平。连续定量AML1-ETO转录本水平可 判定有高复发风险的患者，以便及早治 疗干预以防血液学复发
白血病的分子检测
RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 荧光标记扩增产物 荧光标记引物 特异性荧光标记探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合扩增产物 SYBR Green I与DNA双链结合 动态监测荧光信号变化
TaqMan探针法
•特异性高 •多重基因定量 •成本较高
t(8;21)(q22;q22) 6~8%原发性AML，在M2中的阳性率为
20~40%，在M2b中阳性率为90% 少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综
合症
AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能 力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性 粒细胞，且对化疗反应较敏感
AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果 好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后 较其他AML亚型（M3除外）好
综合国外各研究报道， FLT3-ITD和D835突变 在AML中阳性率分别为24%(385/1585)和 7%(30/429)，总阳性率超过30%，使其成为 AML中最普遍发生突变的靶基因
许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后 密切相关，尤对60岁以下的AML患者，FLT3 突变患者预后较差，且可独立于核型之外
均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧 光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实 时检测的目的。
系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系 统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度， 并最终得到CT值。
该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘 制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷 贝数。
NPM基因突变
Nucleophosmin，为核-浆穿梭蛋白，调控p53ARF通路
见于~50%核型正常的AML患者，而在伴低危/ 高危核型患者中极少见
主要见于M4/M5中 第12号外显子的插入/缺失 伴此突变患者WBC计数高 目前，此突变的预后点突变 染色体重排 基因扩增
抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一类基因，
其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑 制细胞的恶变。
白血病的分子机制
白血病的分子机制
增殖过度 分化阻断 凋亡受抑
“二次打击”学说
D.Gary Gilliland Best Practice & Research Clinical Haematology.2003;16:409-417
白血病的分子检测
RQ-PCR方法优点： 灵敏而特异 起点定量 闭管化学（污染的风险低） 没有PCR后处理（无需走胶，拍照等） 高度自动化 定性：单数据点测定 定量：多数据点测定 能做基因分型及SNP鉴定
RQ-PCR的操作流程
从细胞或组织中抽提DNA或RNA 用PCR或RT-PCR扩增特异片段 将PCR产物克隆到合适的载体上 体外转录成RNA片段（仅用于RNA样品） 纯化，定量和系列稀释质粒DNA或RNA 构建标准曲线（CT υ lgcopy）
临床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融 合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染 色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解
PML-RARα
APL累及的RARα基因及其伙伴基因结构示意图
PML-RARα
由于PML基因断裂点不同产生3种不同的 PML-RARα异构体
约55%的M3患者为L型，40%为S型， 5%为V型，且每位患者只表达一种PMLRARα融合蛋白
FLT3基因突变
FLT3基因突变
FLT3基因主要突变类型
FLT3基因突变
mut-FLT3信号通路
APL患者初发时外周血WBC计数 (x109)
FLT3基因突变
外周血白细胞计数
160 140 120 100
80 60 40 20
0 FLT3-ITD-
FLT3-ITD+
CBFβ-MYH11
CBFβ-MYH11
CBFβ-MYH11具有多种变异型，其中最 常见的为A型，占80%
RT-PCR检测CBFβ-MYH11进行MRD监 测显示，大部分患者在完全缓解时PCR 转阴，但仍有小部分长期存活者PCR仍 为阳性
最新研究采用RQ-PCR检测CBFβMYH11转录本水平来评价M4Eo患者 MRD情况，预示复发
MLL相关融合基因
累及MLL基因的分子异常见于5.2%AML， 22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可 见于治疗相关白血病，尤接受topoisomerase II 抑制剂治疗的患者
RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、 缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷， 在MRD监测中比RT-PCR具有更高价值
L+ 阴性 S+
FLT3基因突变
Fms-related tyrosine kinase 3
FLT3为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括cFMS，PDGFRβ和c-KIT）成员之一，该类受 体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发 挥重要调控作用
98%M3患者 继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及
RARα的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)， t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及 dup(17)(q21.3;q23)，分别产生PLZF-RARα， NPM-RARα，NuMA-RARα和STAT5b-RARα融 合基因
此基因突变存在于11-30%AML 突变热点位于codon12,13和61 在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突变率较高，
而在t(15;17)中低 伴此突变患者外周血WBC计数低 该突变预后意义尚不明
WT-1基因高表达
Wilms tumor 1 是无特异分子异常的急性白血病患者理
t(6;9)(p23;q34) 主要见于M2或M4，也见于M1，MDS-RAEB 伴DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较
差 此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，
调整治疗方案
N-RAS基因突变
为RAS基因家族成员之一，染色体定位于 1p32.2。具有GTP/GDP结合和GTPase活性， 调控正常细胞的生长
57例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未 检测到C-KIT基因突变
以上结果提示C-KIT突变与M2b密切相关 (R=0.94, P<0.01)
C-KIT基因突变
C-KIT基因结构
JM
C-KIT基因突变
外周血白细胞计数
C-KIT基因突变
生存曲线
PML-RARα
t(15;17)(q22;q21)
BCR-ABL
对于自体或异体移植ALL患者，移植前 后BCR-ABL的有无以及BCR-ABL的转录 本类型与预后有关
e1a2+ 阴性
E2A-PBX1
t(1;19)(q23;p13) 5~6%儿童ALL和3%成人ALL 此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸
脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无 病生存期（DFS）仅6个月，3年DFS为20%， 需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后 核型和E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治 疗方案的选择至关重要 E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实
PCR方法缺点 假阳性 假阴性
白血病的分子检测
PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小
的范围内（<2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。
RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的
区域的融合基因。
巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，
增加扩增效率。
RQ-PCR：可定量扩增产物。
想的MRD检测指标 伴此基因高表达者预后差，且表达程度
与预后相关
BCR-ABL
t(9;22)(q34;q11) 15~30%成人ALL及3~5%儿童ALL 9号染色体的断裂点与CML相同，但22号染色
体断裂点具有异质性 此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比p210要
强。在转基因试验中观察到p190诱发的白血病 具有起病早、发展快和恶性程度高的特点 BCR-ABL+ALL患者预后差，5年存活率<20%， 因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗
TEL-AML1
t(12;21)(p13;q22) 25%儿童ALL，是儿童ALL中最常见的分子异
常 目前为止尚未在T-ALL，AML或NHL中发现
t(12;21)，在婴儿白血病中极少报道，在成人 白血病患者中频率很低（<2%） 此类患者发病年龄小（2岁~10岁），WBC计 数低（<50 000/L），免疫表型为前B-ALL 此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预 后好
AML1- 阴性 ETO+
C-KIT基因突变
C-KIT为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括cFMS，PDGFRβ和c-KIT）成员之一
AML1-ETO可诱导性表达的转基因小鼠，并不 导致白血病发生
C-KIT突变可见于伴inv(16)的M4以及伴t(8;21) 的M2患者
26/54例(48.1%) M2b患者中检测到C-KIT基因 突变
形态学上S型白血病细胞常为低分化的并 且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V 型APL患者的白血病细胞体外对ATRA的 敏感度低
PML-RARα
RT-PCR检测PML-RARα是敏感且特异的 APL诊断方法，还能用于治疗后MRD监 测。PML-RARα阳性提示的分子复发常 早于临床复发3-6个月，为临床采取进一 步治疗措施提供了保障
AML1-ETO
对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融 合基因的检测对其预后判断及治疗方案 的制定相当重要
AML1-ETO定性结果不能用于评价患者 MRD情况
RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水 平。连续定量AML1-ETO转录本水平可 判定有高复发风险的患者，以便及早治 疗干预以防血液学复发
白血病的分子检测
RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 荧光标记扩增产物 荧光标记引物 特异性荧光标记探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合扩增产物 SYBR Green I与DNA双链结合 动态监测荧光信号变化
TaqMan探针法
•特异性高 •多重基因定量 •成本较高
t(8;21)(q22;q22) 6~8%原发性AML，在M2中的阳性率为
20~40%，在M2b中阳性率为90% 少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综
合症
AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能 力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性 粒细胞，且对化疗反应较敏感
AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果 好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后 较其他AML亚型（M3除外）好
综合国外各研究报道， FLT3-ITD和D835突变 在AML中阳性率分别为24%(385/1585)和 7%(30/429)，总阳性率超过30%，使其成为 AML中最普遍发生突变的靶基因
许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后 密切相关，尤对60岁以下的AML患者，FLT3 突变患者预后较差，且可独立于核型之外
均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧 光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实 时检测的目的。
系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系 统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度， 并最终得到CT值。
该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘 制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷 贝数。
NPM基因突变
Nucleophosmin，为核-浆穿梭蛋白，调控p53ARF通路
见于~50%核型正常的AML患者，而在伴低危/ 高危核型患者中极少见
主要见于M4/M5中 第12号外显子的插入/缺失 伴此突变患者WBC计数高 目前，此突变的预后点突变 染色体重排 基因扩增
抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一类基因，
其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑 制细胞的恶变。
白血病的分子机制
白血病的分子机制
增殖过度 分化阻断 凋亡受抑
“二次打击”学说
D.Gary Gilliland Best Practice & Research Clinical Haematology.2003;16:409-417
白血病的分子检测
RQ-PCR方法优点： 灵敏而特异 起点定量 闭管化学（污染的风险低） 没有PCR后处理（无需走胶，拍照等） 高度自动化 定性：单数据点测定 定量：多数据点测定 能做基因分型及SNP鉴定
RQ-PCR的操作流程
从细胞或组织中抽提DNA或RNA 用PCR或RT-PCR扩增特异片段 将PCR产物克隆到合适的载体上 体外转录成RNA片段（仅用于RNA样品） 纯化，定量和系列稀释质粒DNA或RNA 构建标准曲线（CT υ lgcopy）
临床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融 合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染 色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解
PML-RARα
APL累及的RARα基因及其伙伴基因结构示意图
PML-RARα
由于PML基因断裂点不同产生3种不同的 PML-RARα异构体
约55%的M3患者为L型，40%为S型， 5%为V型，且每位患者只表达一种PMLRARα融合蛋白
FLT3基因突变
FLT3基因突变
FLT3基因主要突变类型
FLT3基因突变
mut-FLT3信号通路
APL患者初发时外周血WBC计数 (x109)
FLT3基因突变
外周血白细胞计数
160 140 120 100
80 60 40 20
0 FLT3-ITD-
FLT3-ITD+
CBFβ-MYH11
CBFβ-MYH11
CBFβ-MYH11具有多种变异型，其中最 常见的为A型，占80%
RT-PCR检测CBFβ-MYH11进行MRD监 测显示，大部分患者在完全缓解时PCR 转阴，但仍有小部分长期存活者PCR仍 为阳性
最新研究采用RQ-PCR检测CBFβMYH11转录本水平来评价M4Eo患者 MRD情况，预示复发
MLL相关融合基因
累及MLL基因的分子异常见于5.2%AML， 22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可 见于治疗相关白血病，尤接受topoisomerase II 抑制剂治疗的患者
RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、 缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷， 在MRD监测中比RT-PCR具有更高价值
L+ 阴性 S+
FLT3基因突变
Fms-related tyrosine kinase 3
FLT3为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括cFMS，PDGFRβ和c-KIT）成员之一，该类受 体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发 挥重要调控作用
98%M3患者 继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及
RARα的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)， t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及 dup(17)(q21.3;q23)，分别产生PLZF-RARα， NPM-RARα，NuMA-RARα和STAT5b-RARα融 合基因
此基因突变存在于11-30%AML 突变热点位于codon12,13和61 在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突变率较高，
而在t(15;17)中低 伴此突变患者外周血WBC计数低 该突变预后意义尚不明
WT-1基因高表达
Wilms tumor 1 是无特异分子异常的急性白血病患者理
t(6;9)(p23;q34) 主要见于M2或M4，也见于M1，MDS-RAEB 伴DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较
差 此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，
调整治疗方案
N-RAS基因突变
为RAS基因家族成员之一，染色体定位于 1p32.2。具有GTP/GDP结合和GTPase活性， 调控正常细胞的生长
57例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未 检测到C-KIT基因突变
以上结果提示C-KIT突变与M2b密切相关 (R=0.94, P<0.01)
C-KIT基因突变
C-KIT基因结构
JM
C-KIT基因突变
外周血白细胞计数
C-KIT基因突变
生存曲线
PML-RARα
t(15;17)(q22;q21)
BCR-ABL
对于自体或异体移植ALL患者，移植前 后BCR-ABL的有无以及BCR-ABL的转录 本类型与预后有关
e1a2+ 阴性
E2A-PBX1
t(1;19)(q23;p13) 5~6%儿童ALL和3%成人ALL 此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸
脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无 病生存期（DFS）仅6个月，3年DFS为20%， 需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后 核型和E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治 疗方案的选择至关重要 E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实