2016-2017学年高中生物第6章蛋白质和DNA技术第2节DNA片段的扩增——PCR技术教案中图版选修1资料

第二节 DNA片段的扩增——PCR技术
一、DNA在细胞内的复制
1．所需的酶：解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。

2．引物：一段RNA。

3．原料：四种脱氧核苷酸。

4．原则：碱基互补配对原则。

二、PCR技术的过程
1．把PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2＋等成分加入到微量离心管中。

2．把离心管置于95℃的高温中，使DNA碱基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成为两条单链。

3．将离心管置于55℃的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。

4．再将离心管转置于72℃的环境中，在DNA聚合酶的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端进行顺次连接，从而形成两条新的子链。

这样高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤便构成了PCR过程的一个循环。

三、实验操作
1．准备
(1)为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

(2)如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为95℃、55℃和72℃，然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。

2．扩增
3．检测
利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。

即：DNA的浓度(μg/mL)
＝A260nm
0.02
×稀释倍数。

预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中
一、DNA复制(体内)与PCR技术(体外)
①解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。

②DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

二、PCR技术的实验操作程序
1．PCR 扩增前的准备
移液⎩⎪⎨
⎪⎧
高压灭菌每次更换吸头
准备三个水浴锅 ↓
2．PCR 扩增循环 预变性时间延长 最后一次延伸时间延长 ↓
3．检测PCR 扩增效果 (1)稀释 2 测量光吸收值
3 计算DNA 含量
↓
4．绘图(DNA 的紫外线吸收曲线图)
(1)PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环可分为________、________、________三个步骤。

(2)PCR 技术与细胞内DNA 复制在解旋时原理不同：细胞内复制利用________使双链间氢键断裂，而PCR 技术利用________原理，使双链氢键断裂。

以引物为标识，可判断出此产物最早为第________次循环的产物。

(3)PCR 反应中，如果以引物为标识，共有几种DNA 分子产生？你能把它们画出来吗？ 【审题导析】
【精讲精析】(1)PCR的每一轮循环包括高温变性、低温复性和中温延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应。

(2)DNA分子在细胞内复制时。

在解旋酶的作用下使氢键断裂，而在体外，DNA在95 ℃的高温中变性。

即双螺旋解开，成为单链；当温度慢慢降低后，两条彼此分离的单链又会重新结合形成双链。

在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会出现DNA分子两端均含引物的情况，如图所示：
因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。

(3)产生的DNA分子有3种：只含引物Ⅰ的，只含引物Ⅱ的和既含引物Ⅰ也含引物Ⅱ的。

【答案】(1)高温变性低温复性中温延伸
(2)解旋酶热变性一
(3)共有3种，分别为：
当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到50 ℃左右时，引物与模板结合，一般不考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因：a.模板DNA比引物长得多而且复杂的多，不易重新结合；b.引物与模板间的碰撞机会远远多于模板互补链间的碰撞；c.加入的引物量足够大而模板链数量少。

PCR技术是把DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段，它的基本过程如图所示：
注：图中短线表示每次扩增过程中需要的引物。

每个引物约含20～30个脱氧核苷酸，并分别与两条单链DNA结合，其作用是引导合成DNA子链。

(1)PCR技术的原理是模拟生物体内________的过程。

(2)PCR扩增过程中需要对DNA片段进行高温处理，其目的是________，此过程在生物体内称为______，需________酶的参与。

(3)假如引物都用3H标记，从理论上计算，所得DNA分子中含有3H标记的占________。

(4)假定DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，从理论上计算需要____________个游离脱氧核苷酸。

【解析】(1)(2)由图可知高温变性的过程就是DNA在高温条件下解旋的过程，在生物体内则需要酶的催化才能进行。

低温复性时两条DNA分子都需要引物；(3)每次低温复性时，引物都与两条单链DNA结合，进而形成双链DNA，所以所得DNA中均含3H。

扩增3次一共形成了8个子代DNA片段，需游离的脱氧核苷酸数为(8－1)×400＝2 800个。

【答案】(1)DNA复制
(2)使DNA两条链彼此分开解旋解旋
(3)100% (4)2 800
1．PCR技术最突出的优点是( )
A．原理简单
B．原料易找
C．所用DNA聚合酶具有耐热性
D．快速、高效、灵活、易于操作
【解析】PCR技术实际上是在体外模拟细胞内的DNA复制过程，形成大量特异性的DNA 片段。

原理复杂、原料多样，但操作却十分简单。

快速、高效、灵活和易于操作正是PCR 技术的突出优点。

【答案】 D
2．下列哪种温度下DNA会发生复性( )
A．95 ℃B．55 ℃
C．37.5 ℃ D．72 ℃
【解析】DNA解旋在95 ℃环境下，复性温度为55 ℃，在72 ℃时，DNA链得以延伸。

【答案】 B
3．Taq DNA聚合酶由水栖高温菌分离而得。

其生长适宜温度为70 ℃～75 ℃。

回答下列问题：
(1)用Taq DNA聚合酶代替一般的DNA聚合酶是使PCR普及应用的关键。

因为普通的酶不能耐受94 ℃时使双链DNA变性的温度。

因此，每次循环都要______，Taq DNA聚合酶的发现和应用解决了上述问题，提高了PCR的效率，使PCR技术趋向________。

(2)PCR反应扩增DNA片段时，________决定了扩增片段的长短。

(3)若加入的模板是两个相同的DNA分子，如果只想要“拷贝”这两个长长的DNA分子中“特定区间”，在其他条件均理想时，经过三十次循环，理论上能获得______个“特定区间”片段。

【解析】普通DNA聚合酶在DNA变性温度条件下失活，因此，必须循环一次更换一次新酶才能保证DNA复制顺利进行，而Taq DNA聚合酶在94 ℃的DNA变性条件下不会失活，故可以反复利用，解决了PCR聚合酶只能从两引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，是DNA片段延伸的起始位点，两引物的5′端决定了扩增产物DNA片段终点。

每个DNA分子中“特定区间”经过30次PCR反应后理论上可获得230个“特定区间”，其中两个位于DNA分子的两条链上，不是“特定区间”片段。

故两个DNA经30次PCR循环后获得的“特定区间”片段理论上有230×2－4。

【答案】(1)加入新酶自动化(2)两个引物(3)230×2－4
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一、选择题
1．RNA引物的合成所需的酶是( )
A．DNA解旋酶B．DNA聚合酶
C．RNA聚合酶D．RNA解旋酶
【解析】细胞内DNA复制时的RNA引物是由RNA聚合酶催化形成的。

【答案】 C
2．PCR过程与细胞内的DNA复制相比，主要有两点不同，它们是( )
①PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．①② B．①③
C．③④ D．②③
【解析】PCR过程与细胞内的DNA复制相比主要有两点不同：①是引物不同，PCR过
程以DNA为引物，细胞内DNA复制时以RNA为引物。

②是解旋的方法不同，PCR过程通过热变性解旋，DNA复制依靠解旋酶解旋。

【答案】 B
3．PCR技术利用了DNA的________原理，来控制DNA的解聚与结合( )
A．特异性B．稳定性
C．热变性D．多样性
【解析】在PCR中，DNA的解聚与结合是通过热变性来完成的。

【答案】 C
4．PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，下列关于它调控不同温度的目的叙述错误的是( )
A．95 ℃，使DNA分子变性，解开螺旋
B．55 ℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性
C．72 ℃，使DNA分子开始复制，延伸
D．72 ℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性
【解析】72 ℃时，DNA分子在DNA聚合酶的作用下开始复制、延伸。

【答案】 D
5．DNA在________nm的紫外线波段存在一强烈的吸收峰，其峰值的大小与DNA含量有关( )
A．220 B．240
C．260 D．280
【解析】DNA对紫外线的吸收峰值在260 nm处。

【答案】 C
6．下图中PCR第二轮产物a、b、c、d分别是以PCR第一轮产物的哪一条单链DNA为模板复制产生的( )
A．②①③④ B．①③④②
C．①②④③ D．①②③④
【解析】以①链为模板复制而来的DNA应只含有引物Ⅰ(a)；以④链为模板复制而来的只有引物Ⅱ(d)；b、c是以②、③为模板复制而来的。

【答案】 D
7．在PCR 扩增DNA 的实验中，根据设计，一分子DNA 经30次循环后，应得到约230
个DNA 分子，但结果只有约210
个DNA 分子。

出现该现象的原因可能是( )
①循环次数不够 ②TaqDNA 聚合酶活力不够或其活性受到抑制 ③引物不能与亲链结合 ④系统设计欠妥
A ．①②③
B ．②③④
C ．①③④
D ．①②③④
【解析】 该现象属于在PCR 扩增中假阴性现象。

其原因有：(1)TaqDNA 聚合酶活力不够或其活性受到抑制导致催化效率降低，得到的产物比预期的少；(2)引物设计不合理，可能不能与模板DNA 结合，导致无法进行扩增；(3)提取的模板数量或质量不过关，可能不能起模板作用，也无法进行扩增；(4)PCR 系统设置不妥，达不到预期的效果；(5)循环次数过少，产物的量比预期的少。

【答案】 D 二、非选择题
8．PCR 技术是把某一DNA 片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA 分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。

请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：
(1)PCR 技术能把某一DNA 片段进行扩增，依据的原理是____________。

(2)在实验条件下，DNA 分子进行扩增，除了所要扩增的DNA 片段外，还需要________、________和________等条件。

(3)某DNA 片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA 分子扩增三次(即复制三次)至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是________和________个。

【解析】(1)DNA 分子具有双螺旋结构，扩增时DNA 分子双链之间的氢键断裂，两条链彼此分开，各自吸收细胞内的脱氧核苷酸，按照碱基互补配对原则合成一条新链，然后新旧链联系起来，各自形成一个完整的DNA 分子。

(2)PCR 反应的条件：①稳定的缓冲液环境，②DNA 模板，③分别与模板DNA 两条模板链相结合的两种引物，④A、T 、G 、C 四种脱氧核苷酸。

⑤耐热的DNA 聚合酶，一般用TaqDNA 聚合酶。

⑥能严格控制温度变化的温控设备。

(3)在DNA 片段中，有腺嘌呤35个，可求出鸟嘌呤为160－35×2
2＝45个，DNA 分子扩增
三次需要腺嘌呤脱氧核苷酸35×(23
－1)＝245个，鸟嘌呤脱氧核苷酸45×(23
－1)＝315个。

【答案】 (1)DNA 分子具有双螺旋结构和DNA 分子中碱基的互补配对 (2)四种脱氧核苷酸 引物 DNA 聚合酶
(3)245 315。