脂质过氧化物LPO比色法测试盒.pdf

20 mL×1 瓶
20 mL×1 瓶
2-8℃避光保存 6 个月
试剂三 (Reagent 3)
试剂四 (Reagent 4)
酸溶液 (Acid Reagent)
100 μmol/L 标准品 (100 μmol/L Standard
Solution)
10 mL×1 瓶 6 mL×1 瓶
20 mL×1 瓶 2-8℃保存 6 个月 6 mL×1 瓶 2-8℃保存 6 个月
结果计算
标准品拟合曲线：y = a x + b 血清 ( 浆 ) 中 LPO 浓度计算公式： LPO（μmol/L）= (ΔA586 - b) ÷ a × f 组织中 LPO 浓度计算公式： LPO（μmol/gprot）= (ΔA586 - b) ÷ a × f ÷ Cpr
注： y：标准 OD 值 - 空白 OD 值 x：标准品的浓度 a：标曲的斜率 b：标曲的截距 ΔA586：测定 OD 值 - 空白 OD 值 f：样本加入检测体系前的稀释倍数 Cpr：样本的蛋白浓度（gprot/L）
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基本信息 用途
本试剂盒适用于检测血清（浆）、尿液、组织样本中脂质过氧化物的含量。 检测范围及灵敏度
检测范围：0.70-80 μmol/L 灵敏度：0.70 μmol/L
2. Hraper H H, Hadley M. Malondialdehyde Determination as Index of Lipid Peroxidation[J]. Methods in Enzymology, 1990: 421-431.
3. Reed T T. Lipid peroxidation and neurodegenerative disease[J]. Free Radical Biology & Medicine, 2011, 51(7): 1302-1319.
20
700
30
600
40
500
50
200
80
标准品浓度（μmol/L）：加入到反应体系之前的标准品浓度。
操作步骤
① 标准管：取 200 μL 8 个不同浓度的标准品，加入到 1.5 mL EP 管中； 测定管：取 200 μL 待测样本，加入到 1.5 mL EP 管中。
② 向步骤①中各管加入 650 μL 显色剂工作液，盖上盖，充分混匀。 ③ 向步骤②中各管加入 150 μL 试剂三。 ④ 盖上盖，充分混匀，45℃水浴 60 min 后流水冷却至室温。 ⑤ 将各管 1100×g，离心 10 min。 ⑥ 取上清 200 μL 于 96 孔板中，酶标仪 586 nm 处，测定各孔 OD 值。 注：试剂加入酶标孔时，应触酶标板底加入；加样要慢，避免产生气 泡。（气泡影响测定结果）
检测原理 在酸性且 45℃条件下，脂质过氧化物与显色剂结合，产生稳定的显色 基团，在 586 nm 处有最大吸收峰，在一定范围内吸光度值与浓度成正比。 本试剂盒检测组织和细胞样本时，需测定总蛋白浓度，推荐使用 BCA 法（货号：E-BC-K318-M）。
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提供试剂和物品
试剂： 双蒸水、生理盐水（0.9% NaCl）或 PBS（0.01 M，pH 7.4）。 安全提示 配制试剂之前，请穿戴好防护装备。试剂盒中部分试剂含有危险性物 质。禁止食入，吸入，直接接触眼睛、皮肤和衣物。使用完后的试剂 瓶经彻底清洗后再处理。
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实验准备
实验关键点 ① EP 管的密封性要好，避免泄露。 ② 加入到孔板中的上清液一定要澄清，否则再次离心。 ③ 在通风良好的地方操作。
ＬＰＯ 浓度（μｍｏｌ／Ｌ） <80
80-800
样本与双蒸水的体积比 不稀释 1:9
稀释倍数 1 10
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操作过程
检测环境室内温度 ２５－３０℃，最佳检测波长 ５８６ ｎｍ。 微量移液器的注意事项 ① 移液器取试剂前，请用该试剂平衡枪头（缓慢吸液，反复吹打三次）。 ② 不能将枪头外壁上的液体加入到反应体系。
背景介绍 脂质过氧化是指含有许多碳 - 碳双键的脂质被氧化的过程，是细胞和 组织氧化应激的一种指标 [1]。脂质过氧化是自由基与多不饱和脂肪酸 相互作用，产生脂质过氧化物。脂质过氧化物很不稳定，进一步分解 为丙二醛、4- 羟基 -2- 壬烯醛、丙烯醛、异前列腺素 [4,5]，其中丙二醛 和 4- 羟基 -2- 壬烯醛为主要脂质过氧化产物 [2,3]。
批内差
用一个试剂盒，检测在检测范围内的高浓度样本、中浓度样本和低浓 度样本，各个浓度的样本重复检测 6 次 (n=6)，计算出平均批内差 3.1%
CV=
s x
× 100%
s---Standard deviation
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Focus on your research Service for life science 灵敏度 在加样量为 200 μL 的条件下，按照试剂盒操作规程测定 20 个空白和标 曲的 OD 值。绘制标准曲线，算出空白 OD 值的标准差。根据 IUPAC 公 认的公式 3 倍的标准差除以标曲斜率计算出灵敏度 0.70 μmol/L 回收率 向样本中添加高、中、低三个浓度的标准品，每个浓度样本重复检测 3 次（n=3），做回收率实验，得出平均回收率 99%
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操作表
标准管
不同浓度的标准品（μL）
200
待测样本（μL）
--
显色剂工作液（μL）
650
盖上盖，充分混匀
试剂三（μL）
150
测定管 -200 650
150
盖上盖，充分混匀，45℃水浴 60 min 后流水冷却至室温，1100×g， 离心 10 min。取上清 200 μL 于 96 孔板中，酶标仪 586 nm 处，测定 各孔 OD 值
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实例分析 例如检测人血清： 取 0.2 mL 人血清，按操作操作，结果如下： 标准曲线：y = 0.0162x -0.0065，空白管平均 OD 值为 0.073，测定管平均 OD 值为 0.219，计算结果为：
LPO（μmol/L）=（0.219 - 0.073 + 0.0065）÷ 0.0162×1 = 9.41（μmol/L）
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参考文献
1. Devasagayam T P, Boloor K K, Ramasarma T. Methods for estimating lipid peroxidation: an analysis of merits and demerits[J]. Indian J Biochem Biophys, 2003, 40(5): 300-308.
4. Wood L G, Gibson P G, Garg M L. Biomarkers of lipid peroxidation, airway inflammation and asthma[J]. European Respiratory Journal, 2003, 21(1): 177-186.
试剂准备 ① 检测前，试剂盒中的试剂平衡至室温。 ② 显色剂工作液：
将试剂一：试剂二按 3：1 的体积比混匀，现用现配。
样本准备
① 样本处理 具体操作请参见附录 2。
② 样本的稀释 在正式检测前，需选择 2-3 例预期差异大的样本稀释成不同浓度 进行预实验，根据预实验的结果，结合本试剂盒的线性范围（0.7080 μmol/L），请参考下表稀释：
标准曲线（数据仅供参考）
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附录 ２ 样本制备
样本要求 在测试之前选择 2-3 个预期差异大的样本进行预实验。以下样本处理 方法仅供参考
血清样本 取新鲜血液，在 25℃条件下静置 30 min 使血液凝结。4℃，2000×g 离 心 15 min，取上层淡黄色澄清液体即为血清。血清置于冰上待测，若 不能当天检测，于 -80℃保存，可储存一个月。
96 孔酶标板
1板
96 孔覆膜
2张
样本位置标记表
1张
注：试剂严格按上表中的保存条件保存，不同批次试剂盒中的试剂不能混用。
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ห้องสมุดไป่ตู้
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所需自备物品 仪器： 酶标仪（580-590 nm）、水浴锅、离心机、涡旋混匀仪、微量移液器（1000 μL，200 μL，100 μL）。 耗材： 枪头（1000 µL，200 µL，100 μL）、EP 管（1.5 mL）。
0.70-80 μmol/L 0.70 μmol/L 99%
平均批间差
3.5%
平均批内差
3.1%
批间差
用三个不同生产批号的试剂盒，检测在检测范围内的高浓度样本、中 浓度样本和低浓度样本，每个批号每个浓度的样本重复检测 3 次（n=3）， 分别计算每个批号各浓度样本的均值，并按公式计算出各浓度样本的 相对偏差，最后得出平均批间差 3.5%
编号
试剂一 (Reagent 1)
名称
储备液 (Substrate Stock
Solution)
规格 1
规格 2
(Size 1（) 48T） (Size 2)（96T）
保存方式 (Storage)
30 mL×1 瓶
60 mL×1 瓶
2-8℃避光保存 6 个月
试剂二 (Reagent 2)
稀释液 (Diluent)