人细胞因子 7 项定量联检试剂盒

人细胞因子7项定量联检试剂盒
（EZ- Plex Human Cytokine 7-plex）
Cat. No. :PC-R004-CL-20U1（20次）
检测对象：IL-2、IL-4、IL-6、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MCP-1
一、提示：
1、请在实验开始前仔细阅读使用说明书；
2、本试剂盒仅适用于科研用途；
3、不要在有效期外使用本试剂盒；
4、请勿跟其他批次或其他来源的试剂盒材料混用；
5、本试剂盒经验证适用于血浆、血清、细胞培养液上清等样品类型；
6、本试剂盒采用夹心法ELISA，各孵育步骤单个测试所需反应液体积为200μ L；
7、本试剂盒可使用单面反应器或双面反应器，双面反应器可节约1半的检测抗体及HRP
标记亲和素用量，可使用偲捷MXM-X4-12双面旋转孵育仪进行孵育；
二、简介：
EZ- Plex 是苏州偲聚生物材料有限公司专门针对细胞因子、趋化因子、生长因子水平检测而开发的多指标联检试剂盒，采用偲聚独一无二的SJ改性硅胶膜作为基材，实现全新的检测效果。

EZ-Plex-Human Cytokine 7-Plex可同时定量检测7种人源细胞因子水平，检测灵敏度为pg/mL。

利用卓越的检测平台，本公司还全新推出了fg/mL级的检测芯片F-Plex系列，详情可与我们咨询。

三、材料：
1、试剂盒组分及其配制保存：
四、检测原理：
本试剂盒采用夹心法ELISA 的变体（比传统方法减少了封闭步骤）。

预先将7种不同细胞因子的特异性捕获抗体（C 抗）定位于芯片上的不同位置。

样品与芯片上的特异性抗体结合后，加上生物素标记的检测抗体（D 抗）形成C 抗-细胞因子-D 抗三明治结构，随后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（SA-HRP ），与检测抗体上的生物素特异性结合。

最后，加入化学发光底物进行成像，采用化学发光成像仪捕获图像，采用定量分析软件采集信号，通过标准曲线对样品实现定量检测。

图1、检测原理示意图：
五、实验准备：
1、芯片平衡：将芯片从芯片盒中取出，于室温下静置平衡20分钟；
2、洗液配制：取100mL 10×浓缩洗液，加900mL 蒸馏水，配制成1L 1×洗液，装入洗瓶中，室温保存；
3、标准品配制：使用样品稀释液进行稀释，注意不能震荡（可轻微颠倒离心管），稀释过程
如下图所示；
3、适用成像仪：
• 偲捷 CLINX 4000化学发光成像仪； • Anuova 化学发光成像仪 • GE LAS 4000以上规格成像仪； • Fujifilm LAS 3000以上规格成像仪； • Alpha Innotech HD2及FC2成像仪； • Bio -Rad VERSADOC 4000成像仪； • Bio -Rad CHEMIDOC XRS 成像仪 2、实验需配备的其他物资：
• 蒸馏水或去离子水 • 量筒、玻璃瓶或离心管等溶液配制容器 • 记号笔 • 定时器 • 1.5 mL EP 管 • 乳胶手套 • 口罩 • 移液枪、枪头及其他实验耗材 • 脱色摇床/偲捷MXM-X4-12双面旋转孵育仪（推荐） • 化学发光成像仪（配发光架） • 微型台式真空泵（推荐）
图2、标准品稀释
4、样品准备：使用样品稀释液将样品至少1：2稀释（请勿震荡，推荐初始稀释倍数为1:10）；
5、D抗工作液配制：计算所需D抗总体积V1（如10个样品，加上制作标准曲线所需的6个标准品，则需16×200μ L=3200 μ L的D抗，最好留有富余体积，以避免分液过程误差导致溶液不足），每种D抗各加入1/10 V1充分混合（请勿震荡），4℃保存；
6、发光液配制：按每个反应器需30 μL发光液，计算所需发光液总体积V2，各取1/2 V2的发光底物液A及B，混匀，置于室温备用（这步也可于化学发光反应步骤前进行）；
7、将平衡好的芯片按顺序排列于棉条上（每条棉条最多可排列10个反应器），做好标记。

六、检测流程：
步骤1、浸润：从加样孔往每个反应器内加入1×洗液200μL，轻微晃动使液面覆盖均匀，静置3 min；
步骤2、样品结合：使用微型台式真空泵（推荐）或移液枪将洗液吸尽（将吸头从加样孔内轻轻插入并置于某个膜外围边角，注意不要触及点有蛋白的中间区域），而后加入200μ L配置好的样品液或标准品；室温、150 rpm孵育2 hr;
步骤3、D抗结合：将洗液吸尽，拆除反应鞘，用洗液冲洗反应器膜表面3次（每次间隔静置浸泡30秒以获得更好的清洗效果）；而后，①换装新的单面反应鞘，或②反应器两两配对，换装双面反应鞘（可以节省1半的D抗溶液）；装好反应鞘后，各加入D抗混合液200 μ L （双面反应鞘此时装入另外一个配对反应器）；室温、150 rpm孵育1 hr;
步骤4、HRP标记链霉亲和素结合：将洗液吸尽，拆除反应鞘，用洗液冲洗反应器膜表面3次（每次间隔静置浸泡30秒以获得更好的清洗效果）；而后，①换装新的单面反应鞘，或②反应器两两配对，换装双面反应鞘（可以节省1半的亲和素溶液）；装好反应鞘后，各加入1×HRP标记链霉亲和素溶液200 μ L；室温、150 rpm孵育0.5 hr；
步骤5、化学发光反应：将洗液吸尽，拆除反应鞘，用洗液冲洗反应器膜表面3次（每次间隔静置浸泡30秒以获得更好的清洗效果）；而后，①用微型台式真空泵将洗液吸尽（推荐）而后静置片刻使残余洗液挥发干，或②使用洗耳球将洗液吹干，或③使用气枪将洗液吹干；洗液干后，将反应器按顺序摆放至发光架上（1个发光架最多可以摆放8个反应器），往反应器膜表面滴上等比混好的发光底物液30 μL；将发光架移入化学发光成像仪中，进入成像步骤；
步骤6、成像：请根据所用的化学发光成像设备说明进行成像和图像存储，此处以GE LAS 4000为例进行说明：
6.1、打开成像仪，在连接成像仪的电脑中打开成像软件，进入操作界面
6.2、确认Method/Tray Position设置为：①Method: Chemiluminescence;②Digitization: Epi-illuminence; ③Tray Position: 1;
6.3、确认仪器进入“Ready”状态；
6.4、“Exposure Type”选择“Precision”;
6.5、“Sensitivity/Resolution”选择“High Resolution”;
6.6、“Exposure Time”选择“Manual”“Sec”
6.7、调焦：把发光架放至底座上扣好，关上舱门，点击“Focusing”;根据显示图像，观察芯片上的编码是否清晰，点击上下调节箭头调至图像清洗状态，点击“Return”;
6.8、成像：在“Sec”左边空白框输入发光时间数字如“120”，点击“Start”进入成像状态；
6.9、图像存储：点击“Save”,进入存储文件夹，生成图像名；点击“Complete”，即完成单次成像流程
七、图像分析及结果计算：
1、使用相关分析软件，采集标准品信号值，绘制标准曲线；
2、采集测试样品信号值，根据对应细胞因子标准曲线，推算细胞因子浓度，乘以稀释倍数，即获得原始样品中细胞因子浓度；
八、附：
1、EZ-Plex Cytokine 7-Plex点样图（仅供参考，以试剂盒中说明书为准）：
2、成像图示例：
图3、成像图示例
说明：角上4个响应点均为阳性质控点，阴性质控点不亮，说明芯片和检测体系正常；
点有细胞因子捕获抗体的位点产生明显可见信号，即表明样品中含有该细胞因子，采集信号值，根据标准曲线即可对其定量。

3、标准曲线示例：
*说明：120S 曝光时间量程为0.5-1000 pg/mL,30S 曝光时间量程为15-5000 pg/mL;
在低浓度区（<500 pg/mL ），使用120S 曝光条件即可保证准确性，又能高分辨地识别细小浓度差异;
高浓度区（500-5000pg/mL ）使用30S 曝光条件可以实现很宽的有效定量量程，减免不必要的的稀释次数和实验次数。

4、各指标检测性能参考
：
细胞因子 GE LAS 4000 成像时间(S)
定量下限
（pg/mL ）
定量范围 (pg/mL) IL-2 120 2.5 2.5-1000 IL-4 120 0.5 0.5-1000 IL-6 30/120 2.5 2.5-1000 IFN-α 30/120 2.5 2.5-3000 IFN-γ 30/120 2.5 2.5-5000 GM-CSF 120 2.5 2.5-1000 MCP-1
120
0.5
0.5-1000
*检测抗体浓度：1×；成像模式：High Resolution
5、检测条件调整策略
5.1、浓度过高导致信号值过高：
A、增大稀释倍数至1:20-1:50，稀释倍数加大1倍，大致降低信号值至50-70%;
B、降低D抗浓度，下调D抗浓度1半，大致降低信号值至50-80%；
C、缩短成像时间：信号值与成像时间基本上为正比关系，但不建议少于30S;
5.2、浓度过低导致信号值过低：
A、减少稀释倍数至1:2-1:5；
B、提高D抗浓度，不建议使用超过0.5μg/mL的D抗浓度；
C、延长成像时间,不建议超过4min;
D、使用更高灵敏度成像模式，比如GE LAS4000可使用high模式，信号值约为high resolution 3倍以上
注意：改变条件后，标准曲线也必须在新条件下重新制作；。