HCMV-pp65

七、细胞非特异性着色的鉴别
在标本观察中往往出现一些细胞的非 特异性着色但无法判定其为典型阳性细胞 时，应仔细鉴别防止误诊。现将可能出现 的细胞非特异性着色情况及鉴别方法介绍 如下：
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标本周围靠近画圈边缘的细胞着色，但标本中央部分的 细胞阴性时，周边细胞多为非特异性着色，可能与免疫 组化染色边缘效应道理一致。 细胞过厚或细胞成片时部分细胞非特异性着色。可能由 于细胞过厚荧光标记素洗脱不净造成。细胞着色可表现 为核周着色，全细胞着色或细胞部分着色，有时细胞中 央可出现点状不着色区，此时不易于其内是否掺杂特异 性着色细胞区分，应注意观察周围散在分布细胞的着色 情况。 在较大杂质周围的细胞非特异性着色。应注意观察周围 散在分布细胞的着色情况。 部分细胞集落性分布呈非特异性着色，由于操作方法为 细胞悬液滴片，故阳性细胞应散在分布而不应呈集落性 分布，此时细胞着色不应视为典型阳性细胞。应注意观 察周围散在分布细胞的着色情况。
优势:
1. HCMVPP65抗原血症检测试剂采用快速、定量、简单、 2. 3. 4. 5.
敏感和易于读取结果的方法检测活性CMV感染。 比病毒分离快速培养和血清学方法敏感，对已经出现 临床症状的患者检测敏感度是100％。 疾病发作的几天到1周时间内抗原血症能够被检测出， 比快速培养法早2－25天。 当实验室不能进行细胞培养时可应用抗原血症检测。 采用的PP65单克隆混合抗体能够增加阳性样本细胞的 着色数量并且显示一个更加明亮的荧光场景
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（二）阴性结果及细胞判定标准
• 阴性细胞判定标准：良好的细胞形态，细
胞核为圆形、肾形、（分叶状、杆状较少 见）细胞核无着色。 • 荧光显微镜下标本背景为暗红色或无明显 着色。
（三）阳性结果及细胞判定标准
阳性细胞判定标准： • 良好的细胞形态，细胞核为圆形、肾形、 （分叶状、杆状较少见）荧光照射呈暗绿 色或苹果绿色，细胞核周围呈暗红色或无 着色。 • 不典型阳性细胞判断标准 细胞形态欠佳，细胞核形态欠佳着色不清晰。
试验步骤
一.外周血中白细胞的分离.提取
1. 取10ML试管，加入静脉抗凝血3－4ML，加入 1.5MLPBS 2. 加入5％Dextran0.5ML,轻轻翻转试管混匀 3. 37℃恒温箱，倾斜45°放置18－20分钟 4. 吸取RBS上方的白细胞富集层，置于10ML试管中 5. 离心10分钟，1500转/分 6. 弃上清，加入1×RBS裂解液 7. 室温（15－30 ℃ ）放置10分钟，裂解RBC 8. 继续加入5mlPBS，离心同步骤5 9. 如白细胞沉淀中还有RBC，重复7－9步骤 10. 弃上清，5mlPBS洗涤WBC一次，同步骤5 11. 弃上清，0.5mlPBS悬浮WBC
四.结果的判定
（一）分级 结果报告分为阴性、弱阳性、阳性、强阳性四个等级。 判定结果的前提是实验操作严格，阴阳性对照片染色良 好，未出现假阳性或假阴性着色。一个高倍视野下 （400×）检见白细胞数应大于20个。 阴性：2个染色标本中未检见明确的阳性细胞，或不典 型性阳性细胞少于5个，患者无临床症状，其他相关实 验室检查无阳性表现 弱阳性：2个染色标本中检见散在分布的不典型阳性细 胞少于10个，患者无明显临床症状，其他相关实验室检 查部分阳性表现。 阳性：2个染色标本中检见散在分布典型阳性细胞大于3 个，或散在分布不典型阳性细胞大于10个，患者存在临 床症状，其他相关实验室检查部分阳性表现。 强阳性：2个染色标本中检见散在分布多量典型阳性细 胞，患者存在明显临床症状，其他相关实验室检查阳性 表现。
• 以上各种现象可在同一标本中同时出现。
假阳性着色有时极难与典型阳性细胞区分， 诊断时应结合病人的病史、临床症状、既 往检测结果及其它相关化验检查综合分析， 不要轻易诊断为阳性，给病人造成不必要 的经济负担，及应用各种抗病毒药物后产 生的不良反应。必要时可通知临床再次送 检。
七、抗病毒药物对细胞着色的影响
检测人群：
• 用于诊断和跟踪心脏、肺脏、肝脏、肾脏
和骨髓移植接受者体内的HCMV感染 。
• 艾滋病患者体内的HCMV感染。
检验原理
• 采用混合单克隆抗体（IA6+4A8）标记不同
的抗原决定族结合位点表达在外周血白细 胞和单核细胞内的65－68kd磷酸蛋白（蛋 白激酶PP65） • 当病毒在血液散布期间混合单克隆抗体可 以识别存在于外周血受感染的分叶核白细 胞和单核白细胞的HCMV核蛋白内的2个抗 原决定族。
五、标本读片时视野较暗无法分辨细胞形态 时应注意以下问题：
• 制片过程最后蒸馏水冲洗不彻底；载玻片、盖玻
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片不洁净；封片剂用量过多。 应选择在暗室内读片，室内光线越暗越好。 荧光发生器功率应选择100W为宜，功率为50W的 荧光发生器不宜观察 调整荧光显微镜使其荧光位于视野中央易于观察 读片时应使用40倍物镜观察 调准细胞层面
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六、标本中杂质的区分
标本制片过程中难以避免的掺入一 些杂质，这些物质在荧光显微镜下 会发出绿色荧光，少部分发出红色 荧光，区分这些杂质对诊断尤为关 键。
• 观察杂质形态多数杂质为不规则或呈椭圆行与 • • •
正常细胞较易区分 杂质在荧光照射下发出明亮的绿色荧光 难以明确其是否为杂质时可打开显微镜光源并 上下调整微调，杂质有明显的折光性，细胞折 光性较弱。 个别标本中含有微小的液滴，其形态、大小与 细胞较一致也发出暗绿色荧光不易与阳性细胞 区分时，注意观察其形态为正圆形，着色均匀， 且无法看清细胞核内物质，核周围无暗红色区 域，在标本区域外也可看见相同物质。
• 大多数经抗病毒治疗后的病人标本中阳性
细胞的数量不会较治疗前明显减少，而细 胞着色亮度会随治疗显效逐渐变暗变浅直 至消失，反之，如果病人未经抗病毒治疗 时，仍需报告为弱阳性至阳性，可提示临 床病人处于CMV感染早期，应给予抗病毒 治疗。
• 综上所述，人巨细胞病毒（HCMV）的低基
质磷酸化蛋白（pp65）抗原血症检测对巨 细胞病毒感染有较好的诊断价值。但做出 正确诊断时应首先保证操作规范，其次认 真阅读每一标本，密切结合临床。当不能 明确诊断时，应结合患者临床症状及相关 实验室检查，认真分析后判定结果。
Hale Waihona Puke Baidu
二.白细胞滴片的制备 • 细胞计数板计数并调整白细胞浓度至 4×106/ml • 取出经多聚赖氨酸处理的载玻片.编号.滴片. 干燥 • 固定液固定WBC，室温10分钟 • PBS洗涤玻片3分钟/次，3次 • 立即染色
三.染色 • 每个WBC滴片滴上一滴1抗，阴阳性对照片同时滴 加。 • 玻片放入湿盒，并将湿盒放入37℃恒温箱30分钟 • 取出玻片在PBS中浸泡洗涤3分钟3次 • 于WBC滴片上滴加一滴荧光素标记的2抗，放入湿 盒，37℃恒温箱，3分钟。 • 取出玻片轻轻洗涤玻片3分钟，3次。 • 蒸馏水洗涤玻片3次；吸干； • 甘油封片； • 在40倍荧光显微镜下观察实验结果。
应用免疫荧光技术检测外周血 白细胞内HCMVpp65抗原
临床意义 :
• 人巨细胞病毒感染在人群中极为常见，发达
国家HCMV抗体阳性率40％－80％，而在发 展中国家的HCMV抗体阳性率高达90％－100 ％。 • 应用免疫荧光技术检测外周血白细胞内存在 的低基质65kd磷酸蛋白（PP65），此蛋白是 一种蛋白激酶。 • 检测外周血白细胞内HCMVpp65含量用于检 测HCMV急性期或恢复期感染。