氧化葡萄糖酸杆菌

合集下载

几种外源物质对氧化葡萄糖酸杆菌生长及产2_酮基_L_古龙酸的影响_吕淑霞

沈阳农业大学学报，2011－04，42(2)：184-189Journal of Shenyang Agricultural University，2011－04，42(2)：184-189几种外源物质对氧化葡萄糖酸杆菌生长及产2-酮基-L-古龙酸的影响吕淑霞1，赵朔1，马镝1，林英1，张良1，陈宏权2，张忠泽3（1.沈阳农业大学生物科学技术学院,沈阳110161;2.东北制药总厂Vc公司,沈阳110028;3.中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳110016）摘要：通过在发酵培养基中添加不同的外源营养物质及巨大芽孢杆菌的培养上清液，研究其对氧化葡萄糖酸杆菌生长及产2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)的影响。

结果表明，添加适量的谷氨酸单钠(MSG)、腺苷三磷酸(ATP)、含氮碱基、二氢叶酸和巨大芽孢杆菌的培养上清液都能够促进菌体增殖并提高2-KGA产量，而且2-KGA产量与生物量呈正相关。

巨大芽孢杆菌的培养上清液促进菌体生长和产2-KGA的作用远大于以上各种外源营养物质。

添加培养36h的巨大芽孢杆菌胞外液后，氧化葡萄糖酸杆菌的菌落数和2-KGA产量分别是对照的13.39倍和8.81倍，而添加外源营养物质中促进作用最大的二氢叶酸后仅为对照的4.12倍和2.97倍。

这表明，2-KGA产量的增加主要是通过促进氧化葡萄糖酸杆菌的菌体增殖实现，巨大芽孢杆菌的培养上清液促进氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸的机制不同于其他外源营养物质，可能是通过某种生物活性物质提高氧化葡萄糖酸杆菌菌群密度来实现。

关键词：氧化葡萄糖酸杆菌；巨大芽孢杆菌；2-酮基-L-古龙酸；外源物质中图分类号：Q936文献标识码：A文章编号：1000-1700（2011）02-0184-06Effect of Several Exogenous Substances on Growth and2-Keto-L-Gulonic Acid Accumulation of Gluconobacter oxydansL譈Shu-xia1,ZHAO Shuo1,MA Di1,LIN Ying1,ZHANG Liang1,CHEN Hong-quan2,ZHANG Zhong-ze3(1.College of Biological Science and Technology,Shenyang Agricultural University,Shenyang110161,China;2.Northeast Pharmaceutical GeneralFactory of Vitamin C Company,Shenyang110028,China;3.Institute of Applied Ecology,Academia Sinica,Shenyang110016,China)Abstract：The effect of several exogenous nutrient substances on the growth and2-keto-L-gulonic acid(2-KGA)production of Gluconobacter oxydans was studied.It was found that additions of appropriate amount of monosodium glutamate(MSG),adenosine 5′-triphosphate(ATP),nitrogenous bases,dihydrofolic acid and the supernatant of Bacillus megaterium could promote the cell proliferation and2-KGA production of G.oxydans,and its biomass was positively correlated with the production of2-KGA.The growth promoting effect on G.oxydans by the supernatant of B.megaterium was most significant among the exogenous nutrient substances mentioned above.After adding the supernatant of B.megaterium cultured for36h in the fermentation medium,the biomass concentration and2-KGA production of G.oxydans were13.39and8.81times higher than the control,respectively;while after adding dihydrofolic acid,which had the greatest promoting effect among the exogenous substances,the biomass concentration and2-KGA production of G.oxydans were only 4.12and 2.97times higher than the control,respectively.It suggests that the highly accumulation of2-KGA might be due to the vigorous growth of G.oxydans.The mechanism is different between the supernatant of B.megaterium and the exogenous substances to the growth and the2-KGA production of G.oxydans,and the supernatant of B.megaterium might contain some bioactive substances which increase the mass density of G.oxydans.Key words：Gluconobacter oxydans;Bacillus megaterium;2-keto-L-gulonic acid;exogenous substances2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KGA)是维生素C(vitamin C,Vc)合成的前体。

氧化葡萄糖酸杆菌-杨雪鹏_博士论文

摘要
本研究室筛选到一株氧化葡萄糖酸杆菌 M5（Gluconobacter oxydans M5），该菌株能高效氧化羟乙基胺 D-山梨醇生成羟乙基胺 L-山梨糖，产物是糖尿病手性药物米格列醇的前提化合物，该生物催化组合化学合成技术成功开发出米格列醇合成新工艺。其中氧化葡萄糖酸杆菌的生物转化是关键，然而迄今为止，该菌种相关酶的研究鲜有报道。本课题详细研究了相关酶在细胞中的定位、组成、催化性质、基因及其催化关系，并分析了该反应相关电子传递链的组成，从而揭示了氧化葡萄糖酸杆菌高效氧化多羟基醇及其衍生物的机理。下面从四个方面简要介绍研究的主要内容。第一，氧化葡萄糖酸杆菌 M5 羟乙基胺山梨醇脱氢酶在细胞中的定位、纯化、鉴定及其催化性质的研究
The membrane fraction was confirmed to be mainly responsible for the oxidative reaction. The responsible dehydrogenase was solubilized, isolated from the membrane fraction, and purified to homogeneity by two steps of ionic-exchange chromatography on CM-Cellulose column and molecular sieve chromatography on Sephacryl HR400 column chromatography. The purified dehydrogenase was single subunit protein with apparent molecular weight of about 80 kDa by SDS-PAGE. This enzyme was confirmed to be a PQQ-dependent membrane-bound D-sorbitol dehydrogenase (mSLDH) by MALDI–TOF MS. The optimum pH and temperature for the enzyme were pH 6.0 and 30 °C. It showed a good stability at pH 5.0 and temperatures below 30 °C. PQQ was proved to be its cofactor by restoration of apo-enzyme with PQQ and Ca2+. The activity of the 1NSL dehydrogenase was significantly stimulated by Ca2+ Co2+, Ni2+, Mn2+ and Mg2+, while Cu2+, Fe3+, Zn2+ and EDTA inhibited the activity to different degrees. The substrate specificity was highly versatile, covering many polyols, amino derivatives of carbohydrates, and simple secondary alcohols. Second: The membrane-bound PQQ-dependent D-sorbitol dehydrogenase in Gluconobacter oxydans M5 acting as the primary source enzyme responsible for 1NSL oxidation and its electron transfer pathway

《氧化葡萄糖酸杆菌》课件

氧化葡萄糖酸杆菌的生物学特性

菌群形态
氧化葡萄糖酸杆菌形成多样的菌落形态，如小球形、条形和分枝形等。
生长速度
这些细菌通常具有快速的生长速度，且对多种培养基适应性强。
新陈代谢
氧化葡萄糖酸杆菌通过氧化代谢将葡萄糖转化为能量，并产生有机酸作为副产物。
氧化葡萄糖酸杆菌的应用领域
1
食品工业
这些细菌在食品工业中被广泛应用，如酸奶和醋的发酵过程中，以及其他发酵食品的制备中。
2
环境工程
氧化葡萄糖酸杆菌在废水处理和污染物降解中发挥着重要作用，有助于提高环境质量。
3
药物研发
这些微生物的代谢产物对于药物研发具有潜在的应用价值，可用于合成抗生素和其他药物。
氧化葡萄糖酸杆菌的研究进展
最近的研究表明，氧化葡萄糖酸杆菌在抗氧化应激和免疫调节方面具有重要作用。科学家们正在进一步探索其机制和潜力。
《氧化葡萄糖酸杆菌》 PPT课件
探索《氧化葡萄糖酸杆菌》的精彩世界。在这个PPT课件中，我们将一起了解这种微生物的细节，以及其在生物学和应用领域的意义。
绪论
欢迎来到《氧化葡萄糖酸杆菌》的探索之旅！在这个PPT课件中，我们将深入了解这种微生物，以及它在生物学研究中的重要性。
氧化葡萄糖酸杆菌简介
展望与总结
通过深入了解氧化葡萄糖酸杆菌，我们能够更好地理解其在生物学和应用领域中的重要性，并为未来的研究和应用提供新的启示。
定义
氧化葡萄糖酸杆菌（Oxidative Glucose Acid Bacteria）是一类广泛存在于自然界中的细菌。它们以葡萄糖为能源，并进行氧化代谢。
分类
根据形态和生理特征，氧化葡萄糖酸杆菌可以分为多个亚属，如乳酸菌亚属和醋酸菌亚属。

混合培养中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌的作用

混合培养中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌的作用3冯　树33　张　舟　张成刚　张忠泽　(中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳110015)【摘要】　为查明维生素C 二步发酵混合培养中巨大芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌间的关系,通过生长曲线测定、静息细胞实验及摇瓶发酵实验研究了巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产生22酮基2L 2古龙酸作用的影响;采用超滤分离、凝胶层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对巨大芽孢杆菌胞外液中具有促进氧化葡萄糖酸杆菌产酸作用的活性物质进行了分离和纯化.结果表明,大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长,大菌胞外液中具有该作用的组分分子量在100K Da 以上;大菌胞外液具有促进小菌转化L 2山梨糖生成22酮基2L 2古龙酸的作用,其胞内液无该作用;大菌胞外液中具有该活性作用的组分为30～50K Da 和大于100K Da 两个部分.其中30～50K Da 范围的大菌胞外液中的活性组分为一种蛋白质,其表观分子量约为35K Da ,由一种亚基构成,且该蛋白含金属铁和锌元素.关键词　混菌培养　氧化葡萄糖酸杆菌　巨大芽孢杆菌　生长2-酮基-L -古龙酸E ffect of Bacillus megaterium on Gluconobacter oxydans in mixed culture.FEN G Shu ,ZHAN G Zhou ,ZHAN G Chenggang and ZHAN G Zhongze (Institute of A pplied Ecology ,Chinese Academy of Sciences ,S henyang 110015).2Chin.J.A ppl.Ecol.,2000,11(1):119～122.To reveal the relationship between B acillus megaterium and Gluconobacter oxydans in the mixed culture of vitamin C two 2step fermentation ,the effect of B.megaterium on the growth of G.oxydans and its synthesizing ability of 22keto 2L 2gulonic acid (2KG A )was studied.The bioactive metabolites which could enhance the synthesis of 2KG A were isolat 2ed and purified by ultrafiltration ,gel chromatography and SDS 2polyacrylamide gel electrophoresis.Both the culture su 2pernatant and the cytosol of B.megaterium could promote the proliferation of G.oxydans ,and the active component in the culture supernatant was above 100K Da.The culture suernatant could enhance the conversion of L 2sorbose to 2KG A ,while the cytosol could not.The active components in B.megaterium culture supernatant had molecular weight of 30～50K Da and above 100K Da ,and the former was a kind of protein with an apparent molecular weight of about 35K Da ,which consisted of one sort of subunit and contained Fe and Zn elements.K eyw ords Mixed culture ,Gluconobacter oxydans ,B acillus megaterium ,Proliferation ,22keto 2L 2gulonic acid. 3中国科学院“百人计划”资助项目. 33通讯联系人. 1999-04-26收稿,1999-06-22接受.1　引言微生物是一类重要的生物资源.人类对微生物资源的利用曾经历过天然混合培养至纯种培养两个阶段,微生物分离纯培养是微生物学发展的一个巨大进步,现代微生物发酵多为纯种发酵.随着纯种培养技术的深入发展和微生物间互生现象的研究,一种实用的混合培养或混合发酵渐被认识和利用,并被称之为“生态工程”.我国维生素C (Vitamin C ,Vc )二步发酵即为混合培养.其采用氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans ,G.o ,小菌)和巨大芽孢杆菌(B.megateri um ,B.m ,大菌)混合培养,使L 2山梨糖转化为维生素C 的前体———22酮基2L 2古龙酸(22keto 2L 2gulonic acid ,2KG A ).多年来该混合培养中大菌和小菌间的关系一直困扰着人们,影响了维生素C 二步发酵法理论和生产的进一步发展.本文研究了维生素C 二步发酵混合培养中大菌对小菌生长和产生2KG A 作用的影响,并采用超滤、层析及电泳技术等对大菌分泌的促进小菌产酸的活性物质进行了分离、纯化.2　材料与方法2.1　供试材料2.1.1菌种　氧化葡萄糖酸杆菌(小菌),巨大芽孢杆菌(大菌),菌种编号为833225,东北制药厂提供.2.1.2培养基　分离培养基和发酵培养基见文献[2].大菌培养基(%):葡萄糖0.2,玉米浆0.5,尿素0.1.2.1.3主要试剂　三羟甲基氨基甲基(Tris ):Merck 进口分装,Sephadex G 2100:Pharmacia (瑞典),标准分子量蛋白:中国科学院上海生物化学研究所,十二烷基硫酸钠(SDS )(电泳纯):日本进口分装.2.1.4主要仪器　HITACHI85P 272型高速冷冻离心机(日本),PharmaciaL K B 型紫外监测仪(瑞典),超滤器(日本),751紫外应用生态学报　2000年2月　第11卷　第1期 CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Feb.2000,11(1)∶119～122分光光度计(上海).PE 公司Optima3000型全谱电感耦合等离子光谱仪(美国).2.2　研究方法2.2.12KG A 浓度的测定　见文献[2].2.2.2大菌胞外液和胞内液的制备　取培养不同时间的大菌液,4000rpm 离心15min ,上清液以0.22μm 滤膜过滤,滤液即为大菌胞外液;沉淀的大菌以无菌水洗两次后,悬于0.1M tris 缓冲液(p H8.0)中冰浴下超声破碎,10000rpm 离心15min ,收集上清,经0.22μm 滤膜过滤,所得滤液即为大菌胞内液.2.2.3细胞酶活力的测定　参照文献[4]进行.在含2%山梨糖的NaH 2PO 4-NaOH 缓冲液(p H7.0)中加入一定量的游离小菌,制成小菌休止细胞反应液.分别取反应液8ml 于18mm ×20mm 的试管中,分别加入大菌胞外液和胞内液样品2ml ,对照组加大菌种液2ml.试管45°角倾斜,28℃、180rpm 振荡培养2h ,立即终止反应并测定2KG A 生成量,计算反应速率.细胞酶活力以单位重量(湿重)的细胞单位时间内转化L 2山梨糖生成2KG A 的量表示(2KG A ・mg -1cell ・h -1).2.2.4超滤分离大菌胞外液　用截留分子量分别为10、30、50、100K Da 的超滤膜,Ar 加压超滤大菌胞外液,收集滤出液和滤留液.2.2.5Sephadex G 2100凝胶过滤　取适量超滤分离并浓缩的大菌胞外液组分,经Sephadex G 2100柱层析分离[5].层析柱(2.0cm ×60cm )用0.025mol ・L -1Tris 2HCl (NaCl 0.1mol ・L -1p H7.2)缓冲液平衡,洗脱液与平衡液相同,流速为0.5ml ・min -1.层析时以pharmacia L K B 紫外监测仪监测,收集280nm 吸收峰.层析得到的蛋白样品加入透析袋中(截留分子量为8000Da )内,用PEG 20000浓缩.2.2.6蛋白含量测定　Follin 2酚法[3].2.2.7聚丙烯酰胺凝胶电泳　蛋白纯度鉴定参照文献[1]方法进行聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳(PA GE ).蛋白亚基鉴定参照文献[1]方法进行不连续SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PA GE ).2.2.8分子量测定　Sephadex G 2100凝胶过滤法.2.2.9金属元素测定　吸取样品5ml ,加入3ml 硝酸:高氯酸(3¬1)消煮后,用蒸馏水洗至5ml ,用全谱电感耦合等离子体光谱测定蛋白样品金属元素含量.3　结果与讨论3.1　大菌对小菌生长和产酸的影响3.1.1大菌胞外液和胞内液对小菌生长的影响　取新鲜小菌菌落制备菌悬液.分别取4ml 菌悬液置于内有20ml 种子培养基的250ml 摇瓶中,然后分别加入培养不同时间的大菌胞外液和培养22h 的大菌胞内液各5ml ,纯小菌对照组加5ml 大菌种子培养基.28℃、180rpm 振荡培养,每隔3h 取样,测波长650nm 下OD值,以OD 值代表菌浓度.以时间-OD 值作生长曲,结果见图1.可见培养9～40h 的大菌胞外液和培养22h的大菌胞内液均具促进小菌生长的作用,主要表现为缩短小菌生长的延迟期,加快小菌进入指数生长期的速度,总菌量亦增多.图1　大菌胞外液、胞内液对小菌生长的作用Fig.1Effect of B.megateri um culture supernatant and cytosal on the pro 2liferation of G.oxydans .Ⅰ.G.oxydans ,Ⅱ.+9h B.m cult ,Ⅲ.+18h B.m cult ,Ⅳ.+40h B.m cult ,Ⅴ.+B.m cytosol.3.1.2不同分子量范围大菌胞外液组分对小菌生长的影响　培养36h 的大菌胞外液经超滤分离为<10K Da 、10～30K Da 、30～50K Da 、50～100K Da 、>100K Da 5个部分,按2.1.2法测定5部分大菌胞外液对小菌生长曲线的影响(图2).可见,未经分离的培养36h 的巨大芽孢杆菌胞外液和膜分离的大于100K D的大菌胞外液组分均对小菌生长有显著的促进作用,表现为延迟期缩短,且细菌总量增加.100K Da 以下的大菌胞外液对小菌生长无显著促进作用.可以认为大于100K Da 的大菌胞外液组分为小菌生长的刺激因子.图2　不同分子量范围大菌胞外液成分对小菌生长的作用Fig.2Effect of B.megateri um culture supernatant with different molecularweight on G.oxydans proliferation.Ⅰ.G.o ,Ⅱ.+10KDa B.m cult ,Ⅲ.+10～30KDa B.m cult ,Ⅳ.+30～50KDa B.m cult ,Ⅴ.+50～100KDa B.m cult ,Ⅵ.+>100KDa B.m cult ,Ⅶ.G.o +B.m cult.3.2　大菌对小菌产酸能力的影响3.2.1大菌及其胞外液和胞内液对小菌产酸能力的影响　以休止细胞实验测定大菌胞外液和胞内液对小菌021应　用　生　态　学　报 11卷产酸细胞酶活力的影响(表1).休止细胞实验结果表明,小菌细胞单独存在时可以转化L2山梨糖为2KG A,表明小菌体内含有合成2KG A的全部酶系,但作用极弱;大菌胞内液无促进小菌产酸作用,其胞外液具该作用,且作用随大菌培养时间的延长而增强,表明大菌通过释放某些物质促进小菌产酸.表1　大菌组分对小菌产酸细胞酶活力的影响T able1E ffect of B.megaterium culture supernatant and cytosol on the enzymic activity of G.oxydans converting L2sorbose to2KG A组别Groups 例数n细胞酶活力Enzyme activity(x±s)1　小菌 G.o40.208±0.0212　小菌+18h大菌胞外液 G.o+18h B.m cult40.367±0.04333　小菌+24h大菌胞外液 G.o+24h B.m cult40.551±0.02534　小菌+40h大菌胞外液 G.o+40h B.m cult40.753±0.03035　小菌+60h大菌胞外液 G.o+60h B.m cult40.805±0.03736　小菌+18h大菌胞内液 G.o+18h B.m cytosol40.208±0.0213p<0.01,vs.G.oxydans.3.2.2不同分子量范围大菌胞外液对小菌产酸的影响　摇瓶发酵实验分7组,每组2只250ml摇瓶,每只摇瓶置18ml发酵液,5ml小菌悬液,1组加大菌培养基4ml,2组加培养40h的大菌胞外液,3、4、5、6、7组分别加入以超滤分离获得的<10K Da、10～30K Da、30～50K Da、50～100K Da及>100K Da的大菌胞外液, 28℃、180rpm培养68h,测定2KG A生成量(表2).由表2可见,分子量在30～50K Da和大于100K Da的大菌胞外液组分具有明显促进小菌产酸的作用.表2　不同分子量大菌胞外液对小菌产酸的影响T able2E ffect of B.megaterium culture supernatant with different molec2 ular w eight on the ability of G.oxydans converting L2sorbose to2KG A组别Groups 例数n22酮基L2古龙酸2KGA(mg・ml-1,x±s)1　小菌 G.o2 5.00±0.054 2　小菌+大菌胞外液 G.o+<B.m cult237.69±1.093 3　大菌+<10KDa大菌胞外液 G.o+<10KDa B.m cult28.46±1.08 4　小菌+10～30KDa大菌胞外液 G.o+10～30KDa B.m cult28.84±1.62 5　小菌+30～50KDa大菌胞外液 G.o+30～50KDa B.m cult230.7±5.543 6　小菌+50～100KDa大菌胞外液 G.o+50～100KDa B.m cult29.61±1.63 7　小菌+>100KDa大菌胞外液 G.o+>100KDa B.m cult231.53±2.1833p<0.05,vs.G.oxydans.3.3　促小菌产酸大菌胞外液活性物质的分离、纯化3.3.1分离、纯化　经超滤浓缩获得的分子量为30～50K Da的大菌胞外液经Sephadex G2100柱层析分离、纯化,测定各收集管在280nm的紫外吸收值,同时测定其蛋白质含量.洗脱曲线见图1.在280nm处只出现一个吸收峰.摇瓶发酵实验证实该峰组分促进小菌产酸,且其作用大小变化与洗脱曲线峰型重叠一致,说明该促进小菌产酸的物质为蛋白质.图3　大菌胞外蛋白在Sephadex G2100凝胶柱上的洗脱曲线Fig.3G el filtration of B.megaterium secreted protein on Sephadex G2100. 3.3.2纯度鉴定　将纯化的大菌胞外蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PA GE),结果见图4A.可见该蛋白经PA GE呈现一条电泳带,达到电泳纯.图4　大菌胞外蛋白的PA GE和SDS2PA GEFig.4PA GE(A)and SDS2PA GE(B)of purified B.megateri um secreted protein.a:巨大芽孢杆菌培养上清B.megateri um culture supernatant,b:纯化的大菌胞外蛋白Purified B.megateri um secreted protein.3.4　活性蛋白性质鉴定3.4.1分子量测定　用已知分子量蛋白作Sephadex G2100洗脱标准曲线.对应该标准曲线,查出所分离的大菌胞外活性蛋白表观分子量为35K Da(图5).3.4.2蛋白亚基鉴定　将纯化的大菌胞外蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PA GE),结果见图4B.可见该蛋白经SDS2PA GE呈现一条电泳带,且该带与PA GE电泳带的位置相对应,表明该蛋白由一种亚基构成.3.4.3金属元素测定　所分离的大菌胞外活性蛋白含铁和锌元素.1211期冯　树等:混合培养中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌的作用图5　Sephadex G2100凝胶过滤测定大菌胞外蛋白分子量Fig.5Determination of B.megateri um secreted protein molecular weight by Sephadex G2100gel filtration.柱体积Colume:1.2×78cm,缓冲液Buffer:0.025mol・L-1,Tris(0.1mol・L-1NaCL,p H7.2),洗脱速度Speed:0.5ml・ml-1.Ⅰ.细胞色素C Cytochrome C,Ⅱ.脱氧核糖核酸Deoxyribonucle ase2 lease,Ⅲ.大菌胞外蛋白Bm.secreted protein,Ⅳ.过氧化物酶Superoxi2 dase,Ⅴ.过氧化氢酶Hydrogen peroxidase,Ⅵ.牛血清白蛋白Bovine serum albumin.4　结论4.1　大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长,缩短小菌增殖的延迟期.大菌胞外液中具有该作用的组分分子量在100K Da以上.4.2　大菌胞外液促进小菌转化L2山梨糖生成22酮基2L2古龙酸,其胞内液无该作用;具有该活性作用的大菌胞外液组分为30～50K Da和大于100K Da两部分组分;其中30～50K Da范围的大菌胞外液活性组分为一种蛋白质,其表观分子量约为35K Da,由一种亚基构成,且该蛋白含金属铁和锌元素.致谢　杨俊森副研究员和曾青实验师在蛋白分离和纯化工作中给予帮助和指导,特此感谢!参考文献1　Hames BD and Rickwood D.1981.G el Electrophoresis of Proteins,A Practical Approach.IRL Press Limited.18～29,64～702　Jiang Y2Y(蒋宇扬),Guo Z2Y(郭振勇),Zhang C2G(张成刚).1997.Study on the purification of22keto2l2gulonate reduetase and its physi2 cal,chemical and enzymic properties.Chi n J Biotechnol(生物工程学报),13(4):400～405(in Chinese)3　Lowry DH,Rosebrough H J,Farr AL et al.1951.Protein measurement with Folin phenol reagent.J Biol Chem,193:262～2754　Wei D-Z(魏东芝),Yuan W-K(袁渭康),Y in G-L(尹光琳)et al.1992.Studies on kinetic model of Vitamin C two2step fermentation process.Chi n J Biotechnol(生物工程学报),8(3):277～282(in Chi2 nese)5　Zhang L-X(张龙翔),Zhang T-F(张庭芳),Li L-Y(李令媛).1981.Biochemical Experimental Methods and Techniques.Beijing: People Education Press.112～119(in Chinese)作者简介　冯　树,女,34岁,博士,研究员.1996年7月于中国医科大学获细胞生物学专业医学博士学位,1998年6月于中国科学院沈阳应用生态研究所微生物学博士后流动站完成一期博士后工作.现主持中国科学院”百人计划”研究项目,从事微生物资源研究.已发表学术论文30篇.E2mail:Fengs@iae, 221应　用　生　态　学　报 11卷。

葡萄糖氧化酶基础研究及其应用

葡萄糖氧化酶基础研究及其应用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，简称GOx）是一种常见的氧化酶，能够将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并同时产生一定的过氧化氢（hydrogen peroxide）。

GOx的发现和研究可以追溯到20世纪初，如今，在食品、医药、环保等领域都有广泛的应用。

一、GOx的基本结构和性质GOx是一种含有FAD（flavin adenine dinucleotide，黄素腺嘌呤二核苷酸）辅助因子的氧化酶。

它的基本结构包括两个多肽链，其中一个链为蛋白质主链，另一个链为FAD。

GOx的分子量约为160 kDa，其中主链的分子量约为80 kDa，FAD 的分子量约为40 kDa。

关于其催化反应，GOx能够将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并同时产生一定的过氧化氢。

这一反应可表示为：葡萄糖+ O2 → 葡萄糖酸 + H2O2GOx在催化反应中起到的作用为：通过与葡萄糖结合的部分（即活性位点）将葡萄糖转化为葡萄糖酸；同时，由于FAD结合了非常紧密，因此它能够催化生成的过氧化氢分解为氧和水。

这些特性使GOx不仅有优异的催化效果，而且能够在保持高效催化的同时，减少对环境的污染。

二、GOx的应用1.食品行业GOx在食品中的应用主要是作为食品添加剂，其主要作用是增加食物的口感和保存期限。

在某些饮品和蛋糕等食品中，与GOx混合的葡萄糖可以将食品中的氧气消耗掉，从而延长食品的保鲜期限。

此外，由于GOx催化生成的过氧化氢具有抑菌作用，因此它也广泛应用于食品保鲜剂中。

2.医药行业GOx在医药行业中的应用与其抗菌作用有关。

虽然过氧化氢的抗菌效果已经被证明，但是过氧化氢本身也具有毒性，并且在酸性和碱性环境中的稳定性比较差。

从这个角度出发，GOx的催化反应能够在更加温和的条件下生成过氧化氢，从而达到更好的抗菌效果。

3.环保行业GOx在环保行业中的应用主要涉及到污水处理和废弃物处理等领域。

由于GOx催化反应产生的过氧化氢具有氧化性，因此能够用于处理废水或者使其更容易被处理。

抗坏血酸制备工艺简述

抗坏血酸制备工艺简述学院：生命科学学院系别：化学工程系班级：应化082班学生姓名：焦玉娟学号： 2008034208抗坏血酸制备工艺简述摘要：介绍了抗坏血酸的性质、功能和用途。

综述了介绍了维生素C的合成工艺流程。

简述莱氏法、二步发酵法与葡萄糖直接发酵法各自的优缺点和研发现状，展望了我国维生素C生产技术的前景。

关键词：抗坏血酸, 维生素C，制备工艺抗坏血酸，即维生素C(Vc)，其化学名称为L (+)一苏阿糖型一2，3，4，5，6一五羟基一2一己烯酸一4一内酯，是具有六个碳原子的酸性多羟基化合物。

分子量1 7 6．1 3。

Vc是一种人体必需的水溶性维生素，也是一种抗氧化剂。

Vc广泛存在于生物组织中，在新鲜水果、蔬菜和动物肝脏等中的含量尤为丰富。

维生素C不仅与动物的生长密切相关，而且对其免疫力、抗病力以及抗应激反应都具有重要作用。

随着维生素C实验应用范围的增加,市场需求量日益增大。

人们对维生素C实验生产技术不断进行着研究改进。

在这里介绍几种的抗坏血酸的生产技术。

1.浓缩提取以前，维生素C实验是从柠檬、辣椒等天然植物中提取的。

价格昂贵且生产量低，远不能满足市场需求，现已退出工业生产。

2.莱氏法化学合成法主要是莱氏法，莱氏法是1 9 3 3年德国化学家R e i c h s t e i n 等发明的最早应用于工业生产VC的方法。

之后，在他的发明基础上，各国学者一直致力于莱氏法的改进，并取得了很多成果，有的已用于抗坏血酸的工业生产实践。

该法以葡萄糖为原料，经催化加氢制取D一山梨醇，然后用醋酸菌发酵生成L一山梨糖，再经酮化和化学氧化，水解后得到2一酮基一L一古洛糖酸( 2一K L G)，再经盐酸酸化得到VC。

莱氏法的主要工艺流程如图1（1）菌种的获得以D-葡萄糖为原料，加氢催化生成D-山梨醇，再加入醋酸菌等将山梨醇氧化成山梨糖，这是该工艺过程中关键的一步。

（2）第一步发酵a. 在进行发酵时采用的条件是温度为26～30℃，最适pH值为4.4～6.8。

葡萄糖氧化酶

葡萄糖氧化酶一、酶的简介葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD)能够在有氧气的条件下专一性催化β-D- 葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢,高纯度GOD的制剂为淡黄色粉末、易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、甘油和乙二醇[1]。

50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀。

它广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源，微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉。

葡萄糖氧化酶是用黑曲霉等发酵制得的一种需氧脱氢酶，对人体无毒、副作用，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功能，它广泛应用于食品、饲料、医药等行业中，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。

【2】二、菌种及培养基2.1 菌种：以黑曲霉H1-9b为菌种，在发酵罐中装入培养基2.2 发酵培养基(g/L)：蔗糖80、蛋白胨3、KH2PO4 2、MgSO4·7H2O 0.7、KCl 0.5、NaNO3 4，pH5.5；斜面培养基(g/L)：蔗糖30、NaNO32、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO4 0.5、FeSO40.01、琼脂20，pH5.5【3】。

发酵条件为：26～29摄氏度，pH值自然，通风量0．3m3／(m3·min)，搅拌速度400r／min。

发酵液离心分离得菌丝体，经研磨(因葡萄糖氧化酶是一种胞内酶，提取时首先必须先研磨破壁)后过滤，得到含葡萄糖氧化酶的滤液即酶液。

[4]三、工艺流程葡萄糖氧化酶制备流程图原料预处理培养基配制灭菌无菌空气制备发酵产品的分离纯化菌种的制备和种子培养葡萄糖氧化酶下游工艺流程图3.1葡萄糖氧化酶的发酵3.1.1种子液培养在斜面培养基上接种黑曲霉H1-9b 孢子，28℃培养4 ～5 d 。

3.1.2摇瓶发酵250mL 锥形瓶中分装50mL 发酵培养基，121℃灭菌20min，接种黑曲霉H1-9a 孢子浓度为104个/mL，28℃、200r/min 摇床培养80h 即达产酶高峰。

氧化葡萄糖酸杆菌的特性及应用

总之，有待于进一步用基因工程技术对其构建基因工程菌，进一步提高其生物量和酶活力，以提高经济效益。
细胞结构及酶系分布
1.氧化葡萄糖酸杆菌(G．oxydans)是一种专性好氧的革兰氏阴性菌，属于醋酸杆菌科。位于其细胞膜上与呼吸链相连的脱氢酶具有不完全氧化多种多羟基化合物为相应产物的能力。 2.细胞结构与大多数细菌相比，最大的特点是细胞膜上具有大量的脱氢酶。 3.在G．oxydans细胞质内分布着磷酸戊糖代谢途径所需要的酶系，底物必须进人细胞内才能被降解，生成的中间代谢产物都需要磷酸化后进一步通过戊糖磷酸途径进行代谢，合成细胞成分所需要的材料。
氧化葡萄糖酸杆菌的特性及应用
微生物
7-102
Hale Waihona Puke 氧化葡萄糖酸杆菌的特性1.细胞结构及酶系分布
2.生长特性
3.代谢途径
氧化葡萄糖酸杆菌的应用
1.制备L一脱氧野尻霉素衍生物 2.制醋 3.生产维生素C 4.生产葡萄糖酸与酮基葡萄糖酸 5.生产二羟基丙酮
展望
G.oxydans细胞膜上具有大量的与呼吸链相连的脱氢酶，其催化活性中心位于细胞膜的周质空间内，待氧化底物不需要运送到细胞内部，并且几乎有相当量的不完全氧化产物被释放到培养基中，氧化反应的速率和产率都非常高。 G.oxydans的全细胞(生长细胞或者静息细胞)作为生物催化剂，在食品、饲料和制药生产上已得到广泛的应用。但G.oxydans的生物量较小，即通过发酵生产的单位体积发酵液的酶量较小。通过传统的诱变育种对G.oxydans进行诱变处理，生物量和酶活力提高较小，在发酵生产细胞膜脱氢酶时，在培养基中梯度添加甘油，有利于提高细胞膜脱氢酶的活力和稳定性。
二羟基丙酮是由G．oxydans细胞膜甘油脱氢酶氧化甘油生产。在合成过程中需氧量较大，在发酵过程中须进行强通气，以保证供应足够的溶氧量；发酵液pH维持在6左右时，甘油的起始浓度可达到200 g／L，二羟基丙酮的得率达到90％。上述合成二羟基丙酮的方法中存在产物抑制，而且二羟基丙酮损害细胞，并且抑制磷酸戊糖途径的酶活力。

一种以甘油为碳源制备氧化葡萄糖酸杆菌全细胞的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810821509.0(22)申请日 2018.07.24(71)申请人山东大学地址 250100 山东省济南市历城区山大南路27号(72)发明人高超　严金鑫　徐静　马翠卿　许平　(74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司 37221代理人李健康(51)Int.Cl.C12N 1/21(2006.01)C12P 7/58(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(54)发明名称一种以甘油为碳源制备氧化葡萄糖酸杆菌全细胞的方法(57)摘要本发明公开了一种以甘油为碳源制备氧化葡萄糖酸杆菌全细胞的方法，是对野生型氧化葡萄糖酸杆菌进行基因工程改造，使其能以甘油为碳源生长，制得重组氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydansΔGOX1068ΔGOX0854，然后将制得重组氧化葡萄糖酸杆菌接种于甘油无机盐培养基中，于30±1℃摇床振荡培养后获得。

实验证实，本发明的方法中全细胞制备过程简便，制备的全细胞生物催化剂与以山梨醇复杂培养基中制备的氧化葡萄糖酸杆菌原始菌Gluconobacter oxydans 621H全细胞生物催化剂催化效率相当，且生物催化剂制备成本较低，具有良好的应用价值。

权利要求书2页说明书7页序列表3页附图1页CN 109097314 A 2018.12.28C N 109097314A1.一种以甘油为碳源制备氧化葡萄糖酸杆菌全细胞的方法，步骤是：(1)对野生型氧化葡萄糖酸杆菌进行基因工程改造，使其能以甘油为碳源生长，制得重组氧化葡萄糖酸杆菌；(2)将制得重组氧化葡萄糖酸杆菌划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂并含50μg/mL头孢西丁的山梨醇复杂培养基平板上，于30±1℃摇床振荡培养36±1小时；(3)在无菌的条件下，用无菌的牙签分别挑取步骤(2)平板上的单菌落，然后接种到5mL 的含50μg/mL头孢西丁的山梨醇复杂培养基中，于30±1℃摇床振荡培养36±1小时，获得重组氧化葡萄糖酸杆菌一级种子；(4)在无菌的条件下，取步骤(3)所得的一级种子菌液，以体积比为2～4％的接种量接种到50mL的山梨醇复杂培养基中，于30±1℃摇床振荡培养36±1小时，获得重组氧化葡萄糖酸杆菌二级种子菌液；(5)在无菌条件下，将步骤(4)得到的重组氧化葡萄糖酸杆菌二级种子菌液8,000±500转/分钟离心2～5分钟，用0.85％生理盐水洗涤菌体2～3遍，然后再将菌体悬起到生理盐水中得到重组氧化葡萄糖酸杆菌菌液，按菌液终浓度OD600nm为0.1的接种量将重组氧化葡萄糖酸杆菌接种到100mL甘油无机盐培养基中，于30±1℃摇床振荡培养36±1小时，获得氧化葡萄糖酸杆菌培养物；(6)将步骤(5)培养获得的氧化葡萄糖酸杆菌培养物6,000±500转/分钟离心10～15分钟；并用pH 7.4、1/15M的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬起到所述磷酸盐缓冲液中，使菌体细胞的终浓度OD600nm为30～50，即获得用于生物催化剂的氧化葡萄糖酸杆菌全细胞菌液；其中：上述步骤(2)～(3)中所述山梨醇复杂培养基的配方是：山梨醇73g/L，酵母粉18.4g/L，(NH4)2SO4 1.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.47g/L；121℃灭菌20分钟；上述步骤(5)中所述甘油无机盐培养基的配方是：(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2.2g/L，Na2HPO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，金属离子溶液(50×)20mL，121℃灭菌20分钟；甘油2g/L，121℃单独灭菌20分钟；维生素(100×)溶液10mL，过滤除菌；其中，金属离子溶液(50×)的配方为：硝基三乙酸0.25g/L，EDTA 1.5g/L，FeSO4·7H2O 0.55g/L，ZnSO4·7H2O 0.45g/L，CoCl2·6H2O 0.03g/L，MnCl2·4H2O 0.1g/L，CuSO4·5H2O 0.03g/L，CaCl2·2H2O 0.45g/L，NaMoO4·2H2O 0.004g/L，H3BO3 0.05g/L，KI 0.01g/L；维生素(100×)溶液的配方为：泛酸钙0.05g/L，烟酸0.04g/L，对氨基苯甲酸0.04g/L，谷氨酰胺20g/L。

氧化葡萄糖杆菌（Gluconob...

２．２．４敲除用载体ｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢ．ＡｇａｄＨ的构建……………………………………．１７２．２．５菌株ＤＨＡ３．９与含质粒ｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢ．ＡｇａｄＨ的ＷＭ３０６４进行接…………１８２．２．６突变体ＤＨＡ．ＡｇａｄＨ的筛选……………………………………………………１９２．２．７菌株ＤＨＡ３—９与ＤＨＡ—ＡｇａｄＨ２ＫＧＡ与５ＫＧＡ积累量的比较………………１９２－３结果与分析…………………………………………………………………………２０２．３．１菌株ＤＨＡ３．９的ｇａｄＨ基因扩增及测序………………………………………．２０２．３．２菌株ＤＨＡ３—９的ｇａｄＨ基因的敲除……………………………………………．２０２．３．３菌株ＤＨＡ３－９与ＤＨＡ－ＡｇａｄＨ２ＫＧＡ积累量的比较…………………………．２３２．４结论…………………………………………………………………………………２４第三章菌株ＤＨＡ．ＡｇａｄＨ的生长和催化性能研究……………………………………．２５３．１实验材料……………………………………………………………………………２５３．１．１菌种……………………………………………………………………………２５３．１．２主要试剂………………………………………………………………………２５３．１．３培养基与培养条件……………………………………………………………２５３．１．４实验仪器……………………………．………………………………………．．２６３．２实验方法……………………………………………………………………………２６３．２．１生长的测定……………………………………………………………………．２６３．２．２葡萄糖代谢产物测定…………………………………………………………．２６３．２．３高浓度葡萄糖酸转化反应……………………………………………………．３０３．３结果与分析…………………………………………………………………………３０３．３．１菌株ＤＨＡ３．９和ＤＨＡ．ＺｘｇａｄＨ在葡萄糖培养基中的生长………………一３０３．３．２葡萄糖代谢产物测定…………………………………………………………．．３ｌ３．３．３高浓度葡萄糖酸转化反应……………………………………………………．．３２３．４结论………………………………………………………………………．…………３３第四章氧化葡萄糖杆菌膜结合葡萄糖脱氢酶的敲除…………………………………．３５４．１实验材料……………………………………………………………………………．３５４．１．１菌种与质粒……………………………………………………………………．．３５４．１．２主要试剂………………………………………………………………………．．３５４．１．３培养基与缓冲液………………………………………………………………．．３６塑燮堂堡主堂位论文第二章氧化葡萄糖杆菌膜结合葡萄糖酸脱氢酶的敲除《０譬Ｉｎ心《ｏ譬Ｎ０．３０菌株Ｓｔｌ？ａｉｎｓＡｇａｄＨ口２ＫＧＡ口５ＫＧＡ图２．５菌株ＤＨＡ３—９与ＤＨＡ．ＡｇａｄＨ２ＫＧＡ、５ＫＧＡ积累Ｆｉｇ２．５Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆ２ＫＧＡａｎｄ５ＫＧＡｉｎｍｅｄｉｕｍｂｙｗｉｌｄａｎｄｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓ．图３．５显示，敲除Ｄ－葡萄糖酸脱氢酶后，５ＫＧＡ转化量无明显变化，２ＫＧＡ不再产生，从表型上证实敲除成功。

大肠杆菌利用葡萄糖的酶

大肠杆菌利用葡萄糖的酶一、介绍大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的革兰氏阴性杆菌，存在于人和动物的肠道中。

它是一种嗜好性厌氧菌，具有广泛的代谢途径。

大肠杆菌可以利用各种碳源，其中葡萄糖是一种最为常见的碳源之一。

大肠杆菌需要通过酶的作用将葡萄糖分解为能量和生物物质，这些酶相互协同工作来完成代谢过程。

二、葡萄糖的进入葡萄糖进入细菌细胞主要有两种途径：经过外膜孔道从外部进入以及经过葡萄糖转运蛋白(PTS)系统进入。

通过外膜孔道的进入路径主要依赖于通道蛋白(如LamB蛋白)，负责将葡萄糖从细胞外部转运到细胞内。

而PTS系统依赖于多个酶的作用，将葡萄糖转运入细胞，并同时发生磷酸化反应。

三、大肠杆菌中的酶大肠杆菌中参与葡萄糖代谢的酶主要包括葡萄糖激酶、磷酸转化酶、还原型磷酸糖浦醛酸脱氢酶、异戊糖激酶和甲磺酰乙酰胺酶等。

这些酶在葡萄糖代谢途径中发挥着关键的作用。

1. 葡萄糖激酶葡萄糖激酶主要负责将葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸，这是葡萄糖在代谢途径中的第一步反应。

葡萄糖激酶是一个带有底物特异性的蛋白质，它通过与葡萄糖结合并在底物结合沟槽中发生构象变化，将磷酸基团转移给葡萄糖，形成葡萄糖-6-磷酸。

2. 磷酸转化酶磷酸转化酶主要负责将葡萄糖-6-磷酸转化为磷酸酮酸糖和磷酸葡糖胺。

这个过程涉及到多个酶的作用，其中包括磷酸转化酶A、磷酸转化酶B、磷酸化底物转移酶和磷酸葡糖胺-6-磷酸胺基转移酶。

这些酶的协同作用将葡萄糖-6-磷酸分解成多个中间产物，为进一步的代谢提供了底物。

3. 还原型磷酸糖浦醛酸脱氢酶还原型磷酸糖浦醛酸脱氢酶是一个关键酶，能将磷酸酮酸糖转化为还原型磷酸糖浦醛酸。

这个过程中，还原型磷酸糖浦醛酸脱氢酶将底物氧化并去除一分子水，产生还原型磷酸糖浦醛酸和二氧化碳。

4. 异戊糖激酶异戊糖激酶是大肠杆菌葡萄糖代谢途径中另一个重要的酶，负责异戊糖的代谢。

异戊糖是由葡萄糖-6-磷酸通过异戊糖激酶催化反应转化而来。

氧化葡萄糖酸杆菌

膜结合乙醇脱氢酶的应用和性质
应用：乙醇脱氢酶可参与全细胞催化1,2- 丙二醇生成D乳酸性质：此酶由两个亚基组成，其表观相对分子质量分别为 80000 和50000。其催化条件及特性：最适反应温度是 30℃，最适pH 值在5.5～6.0 之间，该酶能催化短碳链的一元、二元醇，随着碳链长度的增加，催化活性减小。大多数金属离子及抑制剂(Cu2+、Fe3+、Ca2+、EDTA 等) 对此酶都有抑制作用。
针对目标产物的不同，我们可以对菌株进行改造，以达到我们想要的结果。如：获得高产量的二羟丙酮，就可以设计乙醇脱氢酶缺陷突变株，使得甘油脱氢酶超表达。重建载体的主要过程:（1）设计寡核苷酸引物（2）获得GDH基因（3） PCR GDH基因（4）酶切PCR合成片段（5）由T4DNA连接酶连接酶切片段到pBBR1 MCS-5载体上获得重组载体（6）重组载体转化到E.coli DH5α中（7）转化子在含有 10μg/mL的庆大霉素LB琼脂平板培养基上筛选。
微生物中的甘油脱氢酶 (Glycerol dehydrogenase，GDH) 按照其依赖辅酶的情况可划分为3 种类型：（1）依赖NAD+的GDH (EC1.1.1.6)，主要存在于细胞质中，它将甘油转化为DHA 后，DHA 进一步磷酸化，进入糖酵解和三羧酸循环途径，为微生物生长提供能量；（2）GDH (EC1.1.1.72 、EC1.1.1.156) 需要以NADP+作为辅酶因子，这类GDH 大多存在于霉菌和动物组织中，可将甘油氧化为DHA 或甘油醛；（3）GDH(EC1.1.99.22) 既不依赖NAD+、也不依赖NADP+，主要存在于葡萄糖酸杆菌属 (氧化葡萄糖酸杆菌、弱氧化葡萄糖酸杆菌等) 的细胞膜上。