生化检测实验剖析

生化检测实验讲义

实验一粮食、油料检验-脂肪酸值测定法

一、实验目的

粮食在储藏过程中受到温度、水分和酶的影响，其脂类物质易发生水解和氧化反应。水解造成粮食游离脂肪酸含量增加，对粮食的种用品质和食用品质产生不良影响。粮食游离脂肪酸含量以脂肪酸值表示,即中和100g粮食试样中的游离脂肪酸值所需氢氧化钾的毫克数。通过脂肪酸值的测定，可以判断粮食品质的变化情况，推测储藏方法是否适当。

通过本实验要求掌握测定脂肪酸值的技术。

二、原理

浸出法。脂肪酸能溶于有机溶剂，利用苯来浸出脂肪酸，然后在酒精溶液中用标准KOH溶液中和脂肪酸，根据滴定时所消耗的碱液数量，就可求出脂肪酸值。

三、材料、仪器和试剂

1、材料

大米

2、仪器

带塞锥形瓶，量筒，移液管，微量滴定管，表面皿，天平，振荡器，漏斗

3、试剂

（1）、0.01N KOH（或NaOH）乙醇(95%)溶液

先配制约0.5N的KOH水溶液，再取20 ml,用95%乙醇稀释至500mL

（2）、苯，95%乙醇

（3）、0.04%酚酞乙醇溶液

0.2g酚酞溶于500ml 95%乙醇溶液中。

四、操作方法

1、浸出

称取事先磨细的大米粉20±O.Olg于200ml或250ml锥形瓶中，加入50ml苯，加塞摇动几秒钟后，打开塞子放气，再盖紧瓶塞置振荡器振荡30min(或用手振荡45min)，取出，将瓶倾斜静置数分钟，使滤液澄清。

注：粉碎后样品如在20℃以上室温放置，脂肪酸值会很快增加，因此，必须及时进行测定。

2、过滤

用快速滤纸过滤，弃去最初几滴滤液后用量筒收集滤液25ml。

3、滴定

将25ml滤液移入锥形瓶中，再用原量筒取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液加入锥形瓶中，立即用氢氧化钾乙醇溶液滴定至呈现微红色半分钟内不消失为止。记下所耗用氢氧化钾乙醇溶液毫升数V1。

4、空白试验

取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液，用氢氧化钾乙醇溶液滴定，记下耗用氢氧化钾乙醇溶液毫升数V2。

五、结果计算

脂肪酸值以中和100g大米样品中游离脂肪酸所需氢氧化钾毫克数表示。

脂肪酸值=（V1-V2）×N×56.1×50/25×100/W（1-M）

V1：滴定样品所用的氢氧化钾乙醇溶液体积，ml，

V2：滴定25ml酚酞乙醇溶液所用氢氧化钾乙醇溶液的体积，ml,

50：浸泡样品用苯的体积，ml，

25：用于滴定的滤液体积，ml,

N：氢氧化钾(或氢氧化钠)乙醇溶液的当量浓度，

56.1：氢氧化钾毫克当量，

W：样品重量，

M：样品水分百分率，%

100：换算为100g试样重量。

注:浸出液颜色过深，滴定终点不好观察时，改用四折滤纸，在滤纸锥头内放入约0.5g粉末活性碳，慢慢注入浸出液，边脱色边过滤。

六、思考题

1、粮食脂肪酸值测定的意义？

实验二邻甲苯胺法测定血糖浓度

一、实验目的

1、掌握邻甲苯胺血糖测定法的基本原理及操作方法。

2、了解邻甲苯胺血糖测定法的临床意义及应用。

二、原理

血浆样品中的葡萄糖在酸性环境中与邻甲苯胺共热时，葡萄糖脱水转化为5-羟甲基α-呋喃甲醛，后者与邻甲苯胺结合为蓝绿色的醛亚胺（Schiff硷）。血清中的蛋白质则溶解在冰醋酸和硼酸中不发生混浊。将标准葡萄糖溶液与样品按相同方法处理，在680nm波长处比色，即可测得样品中葡萄糖含量。

三、材料、仪器和试剂

1、实验材料：新鲜血浆

2、仪器

722型分光光度计，水浴锅，试管

3、试剂

⑴、邻甲苯胺试剂

称取硫脲2.5g，溶于冰醋酸750ml中。将此溶液转入1L容量瓶内，加邻甲苯胺150ml，2.4％硼酸溶液100ml,再加冰醋酸至1L刻度，置棕色瓶中，至少可应用2个月。

⑵、葡萄糖贮存标准液（100mg/ml）

将少量无水葡萄糖置于硫酸干燥器内一夜。精确称取此葡萄糖1.000g，以饱和苯甲酸溶液溶解并转移入100ml容量瓶内，再以饱和苯甲酸溶液稀释至100ml刻度。置冰箱中可长期保存。

⑶、葡萄糖标准液（1.5mg/ml）

在100ml容量瓶内，加入葡萄糖贮存标准液15.0ml，用饱和苯甲酸溶液稀释至100ml刻度，混和。

⑷、12mmol/L苯甲酸溶液

称取苯甲酸1.4g，加入蒸馏水900ml,加热助溶，冷却后加蒸馏水至1000ml。

四、实验操作

1、采得待测血样（抗凝）后立即离心以分离血浆（3,000转离心15分钟）。

2、取干燥试管3支，分别标出号码，按下表添加试剂。

邻甲苯胺法测血糖操作表

管别

测定管标准管空白管试剂(ml)

血清（浆）0.20ml ────

葡萄糖标准液──0.20ml ──

蒸馏水────0.20ml

邻甲苯胺试剂 6.0ml 6.0ml 6.0ml

3、混匀各管内容物置沸水浴中加热15分钟后取出用流水冷却。

4、以空白管校正零点，读取各管680nm处吸光度值。

五、结果计算

六、思考题

1、如何获得血浆？血浆的主要成分是什么？

血液由细胞部分和非细胞部分组成。细胞部分（占45％）有红细胞、白细胞、血小板；非细胞部分（占55％）是血浆，血浆的主要成分是水、蛋白质、糖类、脂类、激素、无机盐等。离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，可获得不含细胞成分的液体，即血浆。

2、测定血糖时为什么要在空腹状态下取血？

3、试讨论血糖测定的临床意义及应用？

附：注意事项

1、本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与糖醛起反应，不与血中其他还原物质起反应。

2、显色反应与水的含量有关，故应使标准管和测定管的含水量一致。

3、温度对显色反应有明显影响，煮沸时间和温度应准确控制。

4、显色后颜色不稳定，室温每放置1分钟，颜色降低0.15％。

5、邻甲苯胺试剂中冰醋酸浓度很高，使用不当容易损坏比色仪器。

6、邻甲苯胺是致癌剂，测定过程中应小心使用。