牛奶中的抗生素残留检测方法研究进展

牛奶中的抗生素残留检测方法研究进展

3.1微生物检测法

微生物检测法是应用较广泛的方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用,来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留，如纸片法（PD）、TTC法、拭子法（STOP）等。采用传统的微生物检测方法，缺点是：(1)时间长；(2)显色状态判断通过肉眼辨别，易产生误差，对微红色者无法做出准确判断；(3)操作复杂。优点是费用低，一般实验室都能操作。其中，纸片法和TTC法是牛奶中药物残留检测的两种常用的微生物检测法。

3.1.1纸片法

纸片法，即PD法(Paper Disc)。常用的纸片法有枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片检测法。这两种方法主要用来检测牛奶中的β－内酰胺类抗生素，其操作过程基本相同，而选用的菌种不同。枯草杆菌纸片法检测的结果易出现假阳性，为了确定阳性物质是否为青霉素（或β－内酰胺类），对加热后的乳样用青霉素酶处理，以灭活乳样中的青霉素。然后再行检测，检测限可达0.01 IU/mL。而嗜热脂肪杆菌纸片检测法不仅用于检测奶样中β－内酰胺类抗生素，并能暗示是否还存在其它抑菌物质，检测限可达0.008 IU/mL以下。一般在4h 内即可获得结果。因此，在实践中嗜热脂肪杆菌纸片法比枯草杆菌纸片法应用更为广泛。此外，神保胜彦(1991)对纸片法作了进一步研究和改进。改进后的纸片法不仅能够确定抗生素的种类，而且提高了检出率和准确性，氯霉素最低检出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，链霉素1mg/kg，红霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。

3.1.2 TTC法

TTC法，即氯化三苯基四氮唑法( tripheye tetrazolium chloride)，是目前我国食品卫生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法(GB5409—85)。该法简便、快速，无需特殊设备，3～4h可见报告，很适合牧场、乳品厂及食品卫生检测部门采用。检测各种抗生素所用的TTC法试验的灵敏度（最低检出量）分别为：青霉素0.004 U/mL，链霉素0.5 U/mL，庆大霉素0.4 U/mL，卡那霉素5 U/mL。

目前趋向研究更为灵敏、准确、简便、快速的微生物检测方法。如美国和加拿大，使用拭子法和牛的抗生素和磺胺实验法（CAST）。此外，美国近年来补充的一个新的实验方法－快速抗生素筛选法（FAST）。尽管这些快速微生物检测法有时会产生一些假阳性，但在某种程度上是允许的；如产生这类情况，可进一步做确证实验。

3.2理化检测法

理化检测方法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、联用技术等等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高，但有的检测程序较复杂，有的检测费用较高。在牛奶中抗生素残留检测方面，最常用的理化检测方法是高效液相色谱和联用技术。

3.2.1高效液相色谱

高效液相色谱(HPLC)是目前广泛应用的一种理化检测方法，它引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效率高和操作自动化。几乎所有的化合物包括高极性／离子型待测物和大分子物质，均可用HPLC进行测定。HPLC的分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细(ф 5～10μm)，需高压泵推动，柱效高(105塔板／m)，速度快，灵敏度与GC相近。与GC相比，HPLC流动相参与分离机制，其组成、比例和pH值等可灵活调节，如离子对色谱、胶束色谱、手性分离色谱等，使许多极难分离的待测物得以分析。反相HPLC发展最快，目前已成为大多数抗生素残留的常规分析方法。主要原因是：(1)化学键合固定相(C18或C8)性质稳定，不淋失；(2)使用水、甲醇或乙腈等水溶性有机溶剂作流动相，不干扰紫外检测，成本低；(3)样品中极性杂质先

流出，只需待测物出峰后即可重复进样，分析速度快。

最常用的检测方式为浓度型的紫外检测器和荧光检测器。紫外检测器(UVD)最普及，其次是荧光检测器和电化学检测器(EChD)。由于奶样中药物残留量少，背景干扰往往很严重，因此一般都通过柱前衍生反应来提高紫外检测器检测残留的灵敏度。彭莉等报道了用高效液相色谱法（HPLC）检测牛奶中氯霉素的残留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中残留的氯霉素，用紫外检测器在278nm检测样品。平均加收率94.8％，变异系数< 12.0％。此方法样品前处理简单、回收率高、实用性强、检验灵敏度高、重现性好、检测数据准确可靠，可作为牛奶中氯霉素残留检测的确证方法。由于大部分抗生素在高于230nm的光谱区无吸收，而在低于230nm的紫外区许多样本基质和流动相产生干扰，需衍生化后测定，限制了紫外检测器的应用。但是，大部分抗生素是手性分子，因此旋光检测器有很大发展潜力。旋光检测有以下特点：(1)选择性高，样本仅需简单提取即可；(2)灵敏度高，利用He－He激光作光源，灵敏度可达5～10uα水平；(3)可同时得到流出组分的比旋度[α]，用以定性。目前，该方法已用于红霉素、庆大霉素、羧苄青霉素和吩羧青霉素残留的测定。

此外，光二极管阵列检测器(DAD)是近10年来HPLC最重要的突破。DAD可同时接收整个光谱区的信息，在色谱峰流出同时能进行每个瞬间的动态光谱扫描并快速采集信号，经计算机处理后得到色谱—光谱的三维图谱，信息量大大增加。一次进样可得到每个组分峰的定量、定性和纯度信息，灵敏度亦明显提高。

3.2.2联用技术

各种分析技术联用是现代兽药残留分析乃至整个分析化学方法上的发展特点。计算机的应用加速了这一趋势。联用技术可扬长避短，一般集分离、定量和定性(分子结构信息)于一体，因而特别适用于确证性分析。常见的联用技术，有TLC－MS、GC－MS、LC－MS、CZE－MS、LC－NMR、SFC－MS等。TLC－MS是最简单的离线联用技术。GC－MS已相当成熟，应用相对较多。但这些联用仪价格昂贵，远不如HPLC或GC那样普及。

MS无疑可作为HPLC的通用型检测器。使用微型柱(15×0.3cm id)和适宜的接口技术，如热喷雾(TSP)、微粒束(PB)等解决了LC与MS的连接问题；使用软电离技术，如快原子轰击(FAB)、场解吸(FD)等解决了难气化物质的离子化问题。LC－MS现在已进入实用阶段，其灵敏度较荧光检测器高1个数量级，能方便地对ng级的兽药残留组分进行检测与结构确证。LC－NMR还可提供待测物立体化学方面的信息。

LC/MS是除GC/MS之外的一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统。LC/MS 对高沸点、不挥发和热不稳定的化合物分离和鉴定具有独特的优势。色/质联用法由于实现了高效层析分离和检测联机，可用微电脑控制层析条件、程序和数据处理，其特异性、灵敏度和重复性均好，并可一次同时完成同一样本中多种药物及其代谢物检测。其分析方式有直接探头分析法、直接液体导入法、GC/MS、LC/MS联用法等。使用电子轰击离子化、化学电离、快速原子轰击、热喷雾电离、等离子体喷雾、粒子束电离、大气压化学电离（APCI）和电喷雾电离（ESI）技术对不同MS离子源条件下青霉素类药物分子碎片类型的特征已经作了大量的工作。另外离子阱质谱技术（MS/MS）也已用于鉴别青霉素类药物。如Straub 等使用LC/ES/MS测定了牛奶中的几种青霉素残留。青霉素，邻氯青霉素与苄青霉素的最低测定限为3～5μg/kg。Kihak 等以NCI方式的LC/PB/MS技术成功地对牛奶中OTC、TC与CTC残留进行确证，方法检测限为0.02～0.05μg/mL。

3.2.3其它理化检测方法

牛奶中抗生素残留检测方法还有气相色谱法（GC）、高效薄层色谱（HPTLC）、超临界流体色谱(SFC)和毛细管区域电泳法(CZE)等。这些方法尽管在残留检测中不常用，但因其各自特有的性能，能弥补常用方法中不足之处。如GC有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用，如氢焰离子化检测器(FID)、氯磷检测器(NPD)等，检测限可达μg/kg级；HPTLC