抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

抗氧化酶

S O D P O D C A T活性测

定方法

集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法

酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液

（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na

2HPO

4

·12H

2

O（分子量

358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH

2PO

4

·2H

2

O（分子量

156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na

2HPO

4

)

228.75ml，B母液(NaH

2PO

4

) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

（3）100μM EDTA-Na

2溶液：取0.03721gEDTA-Na

2

用磷酸缓冲液定

容至1000ml。

（4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。

（5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

2、酶活性测定

（1）取10ml试管（要求透明度好）

测试管：分别依次加入3.5ml 缓冲液+0.5ml 甲硫氨酸（Met ）溶液+0.5ml 氮蓝四唑（NBT ）溶液+0.5ml EDTA-Na 2溶液+0.4ml 蒸馏水(混合后摇匀)+0.1ml 酶液+0.5ml 核黄素溶液；

对照管（2个）：分别依次加入3.5ml 缓冲液+0.5ml 甲硫氨酸（Met ）溶液+0.5ml 氮蓝四唑（NBT ）溶液+0.5ml EDTA-Na 2溶液+0.5ml 蒸馏水(混合后摇匀) +0.5ml 核黄素溶液；其中1支试管照光后测定作为最大光还原管，另1支置于暗中测定时用于调零。

（2）将一支对照管置于暗处，其余试管置于光照培养箱中在4000 lux 光照下反应20min ；

（4）以不照光的对照管调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u ）。

SOD 总活性＝ [( A ck -A E )×V]/（1/2A ck ×W×Vt） SOD 比活力＝SOD 总活性/蛋白质含量

SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW ）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A ck 为照光对照管的吸光度；A E 为样品管的吸光度；V 为样品液总体积（ml,1.6ml ，加入PBS 的体积)；Vt 为测定时的酶液用量（ml ，30ul ）；W 为样品鲜重（g ，测定时应换算为叶绿体的质量mg ）；蛋白质含量单位为mg/g 。 二、POD 、CAT 酶活性的测定

粗酶液制备同SOD 。

1、

过氧化物酶（POD ）活性测定（愈创木酚法） （1）试剂配制：

100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A 母液(Na 2HPO 4 ) 6.15ml 和

B 母液(NaH 2PO 4 ) 43.85ml 混匀即为100ml PBS ；

（2）反应混合液配制（以24个样为准）：

取75ml PBS(100mM ，pH6.0)，加入42ul 液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入28.5ul 30％的H 2O 2，混匀后保存于冰箱中备用。

（3）样品测定：

空白对照：3ml 反应混合液+1ml 蒸馏水，作为对照调零； 测试管：3ml 反应混合液+1ml 酶液，立即开启秒表；

测定OD470值（测定40秒），每隔30s 读一次数。读四分钟,共8次。

（4）酶活性计算：以每min OD 值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u ）。

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)

ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提取酶液总体积（ml ，(1.6ml ）；Vs 为测定时取用酶液体积（ml ，30ul ）。

2、

过氧化氢酶（CAT ）活性测定 （1）试剂配制：

0.15mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）：取A 母液(Na 2HPO 4) 457.5 ml 和

B 母液(NaH 2PO 4) 292.5 ml 混合后用蒸馏水定容至1000ml 。

（2）反应液配制：取200ml PBS （0.15M ，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H 2O 2（原液）摇匀即可。

（3）样品测定：取3ml 反应液加入0.1ml （可视情况调整）酶液，以PBS 为对照调零，测定OD240（紫外）（每隔5s 读一次数，测定1min ）。

（4）酶活性计算：以每min OD 值减少0.01为1个酶活性单位（u ）。

CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)

ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提取酶液总体积（ml ， 1.6ml ）；Vs 为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml ）。