抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

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SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定方法

棉花叶片和根系中SOD、POD、CAT、MDA的测定研究表明逆境胁迫可使植物体内活性氧的产生和消除平衡失调，造成植物体内大量的自由基累计，进而膜脂结构的损伤和加速植物的衰老进程。

测定植物体内膜脂过氧化产物MDA的含量及植物体内抗氧化酶SOD、POD的活性高低，可在一定程度上反映逆境对植物的损害程度合作植物的衰老进程。

关于干旱、渍水、盐害和高温等逆境胁迫对作物候期衰老的影响的研究已有不少报道，但是在不同根土空间对作物衰老方面的研究尚不多见。

张永清等研究表明高粱在不同根土空间下，根土空间缩写降低了SOD、POD的含量，而对于不同配置及水分条件下棉花根系及地上部生理活性的研究较少因此探讨不同根系空间条件下对棉花根系生理特性、棉花后期衰老的影响。

测定部位：地上部：倒四叶地下部：上层（0-20cm）中层（20-40cm）下层（40-80 cm）根样一磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的KH2PO4溶液称取分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。

B液：0.2M的K2HPO4溶液称取分析纯K2HPO4•3H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。

或（A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O 31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。

B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。

）二、酶液的制备：称取0.5g放入研钵中，加5毫升PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。

SOD（超氧化物歧化酶）的测定：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存；(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）L磷酸缓冲液(PBS，：A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g；B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

sod,pod,cat的测定

SOD，POD,CAT测定方法抗氧化酶活性的测定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285gNaH2PO4·2H2O, 定容到4L。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。

取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。

1超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。

（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。

2过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975gNaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。

0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)+ 0.02ml？？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

抗氧化酶活性测定方法

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。

其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。

测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。

本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。

1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。

常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。

-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。

-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。

2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。

常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。

-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。

-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。

3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。

常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。

-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。

4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。

常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。

抗氧化酶活性测定方法

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。

其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。

测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。

以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。

1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。

（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。

（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。

（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。

（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。

1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。

（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。

（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。

（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。

其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。

测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。

本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。

1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。

常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。

羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。

2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。

酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。

常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。

离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。

上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。

蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。

SOD、POD、CAT、MDA的测定

植物组织中SOD、POD、CAT、MDA的测定一、磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O 31.21g，用蒸馏水定容至1000ml。

B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64g，用蒸馏水定容至1000ml。

）二、酶液的制备：称取0.5g放入研钵中，加5ml PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。

三、S OD的测定（NBT法)：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（pH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存；(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。

用前配，避光！！！SOD反应液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：核黄素（FD）：H2O的比例为15：3：3：3：3：2.5，按母液顺序配制。

2.SOD的测定：取5ml离心管，吸取20μl的酶液，加入3ml反应液，4000Lux照光30分钟，同时取四支试管，三支做对照，一支做空白（不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，遮光保存，以空白调零，560nm 比色。

3.结果计算SOD总活性（吸光度/g·FW）=（A CK—A E）×V／（W×0.5×A CK）单位：NBT光还原50%为单位SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度四、POD的测定：1.0.1M pH6.0磷酸缓冲液的配制：0.2 M Na2HPO4 (B液)6.15mL与0.2 M NaH2PO4(A液)43.85mL充分混匀定容至100ml2.POD反应液的配制：0.1M pH 6.0的磷酸缓冲液50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O2 19μl混合，保存于冰箱中。

SOD、POD、CAT、MDA联合测定方法

酶液提取:称取鲜叶样品。

0.5g于预冷的研钵中，加lml0.05mol/1 pH7.0磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

将提取液于10000转/分冷冻离心20分钟，上清液用于测定SOD, POD, CAT活力测定及丙二醛含量测定。

SOD：测定SOD活性的试剂配制及用量:①磷酸缓冲液(PH7.8) 0.05moI/L 3.1m1，空白为3.2m1;②EDTA-Na21mg/m1 0.2mL;③L一甲硫氨酸20mg/mL 0.2m1;④核黄素0.1 mg/ml，吸取上清液0.2m1;⑤NBT lmg/ml 0.2m1;⑥提取酶液0.1ml，空白不加酶液。

反应总体积为4m1,第1组、4000Lx光照30min，遮黑布终止反应。

第2组、黑暗处理30 min。

置560nm处测定光密度。

SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%作为一个酶活性单位(u)，按以下公式计算SOD活性:式中，Ack为照光管的吸光度值;AE为遮光管的吸光度值:V为样品液总体积((ml);Vt为测定时样品用量(ml); W为样品鲜重。

POD：在试管中依次加入4m1 0.3%愈创木酚(0.02mo1/1 pH6磷酸缓冲液配置)、50ul酶液、50 ul0.3%H202，摇匀，立即计时，1分钟后在470nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。

以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，按下式计算过氧化物酶活性:式中:d A470为反应时间内吸光度的变化:Vt为提取液总体积(ml); W为样品鲜重(g); Vs为测定时取用酶液体积(ml); t为反应时间(min) 。

CAT取酶提取液50 u 1，加入3m1 0.05 mol/1 pH7.0磷酸缓冲液，再加入0.3%H2O2200 u1，迅速摇匀，立即计时，1分钟后在UV-754分光光度计的240nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。

测酶pod sod cat

过氧化物酶（POD ）活性测定反应液：取100mM pH7.0 磷酸缓冲液 50ml ，边加热边加入愈创木酚28μl ，搅拌溶解，待溶液冷却后加入30%的H 2O 219μl ，混合均匀保存于冰箱中备用。

操作步骤1. 酶液制备取0.5g 植物叶片剪碎，置入研钵中，加入预冷的100mM pH7.0 磷酸缓冲液5ml 进行冰浴研磨提取，匀浆液转入离心管，分别用两次2ml 磷酸缓冲液冲洗研钵，低温离心4000rpm 10min ，上清液转入50ml 容量瓶；离心管中残渣用100mM pH7.0 磷酸缓冲液5ml 冲洗，再次离心，合并上清液至容量瓶，定容到50ml ，即为供测定的酶粗提液。

2. 酶活性测定取光程为1cm 的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3ml ，100mM 磷酸缓冲液 1ml 作为调零管。

另一只加入反应液3ml ，于分光光度计上用移液枪加入提取的酶液1ml ，搅匀，立即开始计时，在470nm 波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟（10S ）记录一次吸光度值，共测5min 。

3.计算以每分钟A470的变化值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小（单位：U/g 鲜重）。

mVA g U POD ⨯⨯∆=01.0470)/(活性V ——提取液定容体积 m ——材料鲜重邻苯三酚自氧化法测定SOD活性[试剂和器材]1、试剂（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。

（2）10mmol/L HCl（3）50 mmol/L邻苯三酚称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。

（4）SOD样液2、器材（1）恒温水浴槽（2）紫外分光光度计（3）试管、刻度吸管、微量注射器[方法和步骤]1、邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。

SOD_CAT及POD活性的测定

测定方法一．SOD，CAT及POD活性的测定分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。

上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。

SOD活性测定1.显色反应取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。

混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。

当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。

3.SOD活性测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。

以遮光的对照管作为空白，分别在560nm 下测定各管的OD值，计算SOD活性。

3.<结果计算>已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性[u/g(FW)]=式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。

比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

VT ——样品液总体积，mL。

V1 ——测定时样品用量，mL。

W——样品鲜重，g。

蛋白质含量单位为mg/g。

愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性1.取两支试管，洗涤后甩干水分。

试剂管号（对照）测定管0.05mol/L PH 5.5的磷酸缓冲液 2.9ml 2.9 ml2%双氧水溶液0 ml 1.0 ml0.05mol/L愈创木酚溶液 1.0 ml 1.0 ml蒸馏水 3.0 ml 2.0 ml总体积7.0 ml 7.0 ml将上述各管立即放入预先调好37 ℃的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 ml酶液，混匀，在λ470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 ml酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3分钟时立即读取吸光度。

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）是植物体内重要的抗氧化酶，在植物的抗逆境应对中起着重要的作用。

因此，对这些抗氧化酶的活性进行测定和分析是研究植物生理生化过程的重要方面之一测定抗氧化酶活性的方法一般分为两类：直接法和间接法。

直接法是通过测定一些特定底物的降解速率来反映酶的活性；间接法是通过测定酶催化底物形成的产物的生成速率来间接反映酶的活性。

下面将分别介绍抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的测定方法。

1.SOD活性测定方法：SOD活性测定方法主要分为NBT法和EPX法两种。

（1）NBT法：这是一种直接法，其基本原理是SOD将还原型的NBT 还原成穆尔蓝染色形成具有最大吸收峰值的NBT离子。

实验步骤如下：a.首先准备SOD底物溶液，其组成为：50mM磷酸缓冲液（pH7.8）+13mML-甲硫氨酸+75μM硝基蓝硝酸盐（NBT）。

b.将样品加入上述的SOD底物溶液中，混匀。

c.加入适量的酶抑制剂，使停止酶的活性，并将其放在冰上。

d.使上述反应在37℃下进行10分钟。

e.加入已经冷却的硝酸亚铁和磷酸以停止反应，并将其放在冰上10分钟。

f. 测定变色液的吸收光谱在560 nm波长处的吸光度。

（2）EPX法：这也是一种直接法，其基本原理是SOD将乙酸型形成的4-无水乙烯甲基-3-硝基噻吩染色。

实验步骤如下：a. 首先在试管中加入1 ml乙酸型测定液。

b.分别加入适量的SOD样品。

c.在30分钟内使试管中乙酸型完全消除。

d. 测定出试管中产生的4-乙烯基-3-硝基-5-硝基噻吩的吸收光谱在260 nm波长处的吸光度。

2.POD活性测定方法：POD活性测定方法可分为直接法和间接法。

（1）直接法：这种方法基于过氧化反应的特点，利用dianisidine 与过氧化氢在催化剂POD作用下形成有色产物的现象来测定POD的活性。

实验步骤如下：a.在试管中加入0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）。

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

抗氧化酶SOD、POD、CAT活性测定方法酶液制备：取0.2g可视情况调整样品新鲜叶片或根系洗净后置于预冷的研钵中;加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液pH7.8在冰浴上研磨成匀浆;转入离心管中在4℃、12000g下离心20min;上清液即为酶液..一、超氧化物歧化酶SOD活性测定氮蓝四唑光化还原法1、试剂的配制10.05mol/L磷酸缓冲液PBS;pH7.8：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O分子量358.1471.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O分子量156.0131.2g..分别用蒸馏水定容到1000ml..0.05mol/L PBSpH7.8的配制：分别取A母液Na2HPO4228.75ml;B母液NaH2PO421.25ml;用蒸馏水定容至1000ml..参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社;2000：267～268..2130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液pH7.8定容至100ml..3100μM EDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml..420μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml;避光保存..5750uM 氮蓝四唑NBT溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml;避光保存..2、酶活性测定1取10ml试管要求透明度好测试管：分别依次加入3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸Met溶液+0.5ml 氮蓝四唑NBT溶液+0.5ml EDTA-Na2溶液+0.4ml蒸馏水混合后摇匀+0.1ml酶液+0.5ml 核黄素溶液；对照管2个：分别依次加入3.5ml 缓冲液+0.5ml 甲硫氨酸Met 溶液+0.5ml 氮蓝四唑NBT 溶液+0.5ml EDTA-Na 2溶液+0.5ml 蒸馏水混合后摇匀+0.5ml 核黄素溶液；其中1支试管照光后测定作为最大光还原管;另1支置于暗中测定时用于调零..2将一支对照管置于暗处;其余试管置于光照培养箱中在4000 lux 光照下反应20min ；4以不照光的对照管调零后;避光测OD560出现颜色即可测定..5酶活性计算：SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原50％所需酶量测的样品值要在最大管的一半左右才合适;否则要调整酶量为1个酶活单位u..SOD 总活性＝ A ck -A E ×V/1/2A ck ×W×VtSOD 比活力＝SOD 总活性/蛋白质含量SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示u/g FW ；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；A ck 为照光对照管的吸光度；A E 为样品管的吸光度；V 为样品液总体积ml;1.6ml;加入PBS 的体积；Vt 为测定时的酶液用量ml;30ul ；W 为样品鲜重g;测定时应换算为叶绿体的质量mg ；蛋白质含量单位为mg/g..二、POD 、CAT 酶活性的测定粗酶液制备同SOD..1、过氧化物酶POD 活性测定愈创木酚法1试剂配制：100mmol/L 磷酸缓冲液pH6.0：分别取A 母液Na 2HPO 4 6.15ml 和B 母液NaH 2PO 4 43.85ml 混匀即为100ml PBS ；2反应混合液配制以24个样为准：取75ml PBS100mM;pH6.0;加入42ul 液体原液愈创木酚2-甲氧基酚加热搅拌溶解;冷却后加入28.5ul 30％的H 2O 2;混匀后保存于冰箱中备用..3样品测定：空白对照：3ml 反应混合液+1ml 蒸馏水;作为对照调零；测试管：3ml 反应混合液+1ml 酶液;立即开启秒表；测定OD470值测定40秒;每隔30s读一次数..读四分钟;共8次..4酶活性计算：以每min OD值变化升高0.01为1个酶活性单位u..POD=ΔA470×Vt/W×Vs×0.01×t u/g minΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重g；t为反应时间min；Vt为提取酶液总体积ml;1.6ml；Vs为测定时取用酶液体积ml;30ul..2、过氧化氢酶CAT活性测定1试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液pH7.0：取A母液Na2HPO4457.5 ml 和B母液NaH2PO4292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml..2反应液配制：取200ml PBS0.15M;pH7.0;加入0.3092ml 30%的H2O2原液摇匀即可..3样品测定：取3ml反应液加入0.1ml可视情况调整酶液;以PBS为对照调零;测定OD240紫外每隔5s读一次数;测定1min..4酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位u..CAT=ΔA240×Vt /W×Vs×0.01×t u/g minΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重g；t为反应时间min；Vt为提取酶液总体积ml; 1.6ml；Vs为测定时取用酶液体积ml;0.1ml..五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%TCA：100g 三氯乙酸→ 1L0.67%TBA：3.35g硫代巴比妥酸→ 500ml 10%TCA 避光2、测定步骤:0.2 样品+1.6ml 10%TCA 研磨→12000g 离心 10min →上清 1.5ml +1.50.67% TBA →沸水煮30min →冷却;离心→上清OD450;OD532;OD6003、计算组织中MDA含量：MDA浓度C umol/L=6.45OD532-OD600-0.56OD450 MDA含量umol/g FW=C×V/W式中V为提取液体积1.6ml;W为样品鲜重0.2g..六、植物细胞质膜透性的测定电导仪法1取新鲜叶片或根系不能萎蔫0.3g;用自来水冲洗表面污渍;再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；2样品剪碎也可打孔取样放入试管或15ml大离心管中;加10ml去离子水;在室温下放置3h使叶片充分吸水后测定溶液电导率R1；3再放入恒温水浴锅中在100℃沸水浴中煮20min以杀死叶片组织;用冷水冷却到室温后测定溶液电导率R2；4用公式计算质膜相对透性用相对电导率表示：相对电导率%=R1/R2×100%还可以计算植株伤害程度：伤害率=处理电导率—对照电导率/煮沸电导率—对照电导率×100%。

抗氧化酶活性等测定方法

抗氧化酶活性等测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，能够将超氧自由基（O2.-）转化为过氧化氢（H2O2），进而被谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）或过氧化物酶（CAT）降解。

测定SOD活性的方法有多种，其中最常用的方法包括：1.基于阻断亚硝酸胆红素还原的方法：该方法通过加氨基钠阻断细胞色素c还原作用，使亚硝酸胆红素还原成胆红素，从而测定SOD活性。

2.基于X射线辐照条件下还原亚硝酸胆红素的方法：这种方法利用X射线辐照生成O2.-，进而被SOD转化为H2O2、H2O2与亚硝酸胆红素反应生成亚硝酸盐，其紫红色可被光度计测定。

3.基于化学发光的方法：这种方法通过硝酸亚铁与亚硝酸盐反应生成亚铁络合物，发出化学发光信号。

该方法简单、灵敏度高，并可以自动化操作。

二、过氧化物酶（CAT）活性测定方法过氧化物酶是参与H2O2代谢的重要抗氧化酶。

常用的测定CAT活性的方法有：1.重铬酸钾（K2Cr2O7）比色法：该方法利用过氧化氢氧化重铬酸钾，从橙色转变为无色，通过比色计测定过量K2Cr2O7的消耗量计算CAT活性。

2.亚甲蓝法：这种方法利用过氧化氢氧化亚甲蓝生成显色产物，通过光度计测定产物的吸光度来评估CAT活性。

3.氨蓝法：这种方法是通过氨蓝还原过氧化氢产生的游离基离子，再与其他物质（如溴酚蓝）反应生成显色产物，通过比色计测定产物的吸光度来测定CAT活性。

三、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定方法谷胱甘肽过氧化物酶是参与氧化还原反应的重要酶。

目前常用的测定GSH-Px活性的方法有几种，包括：1.基于还原硒酸铁的方法：该方法利用GSH-Px催化还原硒酸铁成为亚硒酸铁，反应产物与硫代巴比妥酸钠反应生成巴比特酸，通过光度计测定巴比特酸的吸光度来评估GSH-Px活性。

2.比色法：这种方法通过巴比妥酸与反应产物反应生成巴比妥酸-丙二醛复合物，通过光度计测定复合物的吸光度来评估GSH-Px活性。

抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

SOD,POD,CAT的测定精

SOD,POD,CAT测定方法抗氧化酶活性的测定：（2.5g样0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（PBS（pH=7.8溶液的配制：65.5506g Na2HPO412H2O + 2.65285g NaH2PO42H2O,定容到4L。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活，研磨（用磨碎机磨,8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液。

1超氧化物歧化酶（SOD的测定：NBT（400ml混合反应液：392mlPBS（Ph=7.8,+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml 核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na 溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素。

（另配100ml PBS溶液力卩EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时:取3ml反应液+0.05ml（根或0.02 ml（叶粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度。

2过氧化物酶（POD的测定：0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（PBS（pH=7.0溶液的配制:10.9251g Na2HPO412H2O + 3.042975g NaH2PO42H2O,定容至U 1000ml。

0.3%H2O2溶液的配制:吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液（PBS 定容到250ml。

0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液（PBS定容到250ml。

2ml 0.3%H2O2 溶液+ 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液（PBS + 0.02ml??原来为0.01酶液（根加0.05ml酶液（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液（做三个重复，记录470nm处OD降低速度。