实验一-DNA提取

实验一-DNA提取

实验一DNA的小量制备

小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）

1 实验目的：

随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。

2 实验原理

细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。

关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：

1．CTAB 法：

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。

2．SDS 法：

利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。

几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA 处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管。提取的DNA 是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB 法提取DNA 并通过紫外吸收法鉴定。

3材料和试剂：

3.1长春花叶片

3.2 试剂

（1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。

表1 CTAB提取缓冲液配制

用HCl 调pH 值。

（2）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（pH8.0）。

（3）氯仿/异戊醇：将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。

4 仪器设备

离心机、3离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。

5 方法与步骤：

5.1 在提取过程中用到的吸头，提取缓冲液等先高压灭菌（121℃，20min），取出后待用；

5.2 取大约指甲盖大小的植物叶片，放入1.5ml的EP管中, 加入液氮，用钢珠研磨成粉末状，再加入600μL的CTAB提取缓冲液，；

5.3 65℃水浴锅中水浴40min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀，颠倒几次，乳化1min。4℃，11,000rpm离心10min；

5.4 吸上清到新离心管中（约400μl），加入等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃放置20min沉淀DNA；

5.5 5000 rpm常温离心15min，倒掉上清液；

5.6 用75%乙醇（900μl）洗沉淀，11,000rpm离心2min，倒掉乙醇，再用乙醇同样处理一次；

5.7 置于干燥仪干燥10min，将水分蒸干；

5.8 加入50μL去离子水，融解DNA，同时加入RNA酶(按每50μL DNA加入1μL RNase)，37℃30min；

5.9 利用分光光度计检测OD260,同时进行1％凝胶电泳检测；

5.10 琼脂糖电泳检测DNA：制作1%的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液5μL 电泳检测；

5.11 -20℃保存DNA备用；

5.12 提取的DNA的浓度检测：取少量待测DNA样品，用蒸馏水稀释1,000倍；用蒸馏水做空白，分别在260nm、280nm测DNA样品的吸光值。

【注意事项】

1. 叶片磨得越细越好。

2. 注意移液器的正确使用。

3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

6. 思考题

1．制备的DNA 在什么溶液中较稳定?

2．为了保证植物DNA 的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？

7 实验结果：

结果计算

式中OD260nm 为260nm 处的光密度；L 为比色杯光径（cm）；0.020 为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。

DNA 的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述DNA 溶液适当稀释后，在751 分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm 和OD280nm。如OD260nm/ OD230nm≥2OD260nm/ OD280nm≥1.8，表示RNA 已经除净，蛋白含量不超过0.3％。