蛋白酶产生菌的筛选及发酵条件的优化
一株产角蛋白酶菌株诱变筛选及发酵条件优化
一株产角蛋白酶菌株诱变筛选及发酵条件优化刘文龙∗㊀王兴吉㊀张志来㊀王克芬(山东隆科特酶制剂有限公司ꎬ山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室ꎬ山东临沂㊀２７６４００)㊀㊀摘㊀要:对实验室保藏产角蛋白酶菌Ａ２进行ＮＴＧ(亚硝基胍)诱变ꎬ从中筛选出一株酶活提高１４４％的突变菌株Ａ２－４５３ꎬ对该突变株的发酵条件进行优化ꎮ从产酶时间㊁添加外源碳㊁氮源来研究其酶活变化ꎬ经优化后得到最佳的发酵条件是:发酵６０ｈ时酶活单位最高ꎻ最佳外源碳源是葡萄糖ꎬ最佳外源氮源是豆饼粉ꎮ经最优条件进行发酵ꎬ酶活单位提高４２％ꎮ关键词:角蛋白酶ꎻ亚硝基胍ꎻ诱变ꎻ酶活ꎻ碳源ꎻ氮源ＭｕｔａｔｉｏｎＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＣｏｎｄｉｔｉｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆａＫｅｒａｔｉｎａｓｅ－ＰｒｏｄｕｃｉｎｇＳｔｒａｉｎＬｉｕＷｅｎｌｏｎｇ∗㊀ＷａｎｇＸｉｎｇｊｉ㊀ＺｈａｎｇＺｈｉｌａｉ㊀ＷａｎｇＫｅｆｅｎ(ＳｈａｎｄｏｎｇＬｏｎｇＫｅｔｅＥｎｚｙｍｅＣｏ.ＬｔｄꎬＬｉｎｙｉꎬ２７６４００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＡｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎＡ２－４５３ｗｉｔｈ１４４％ｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔｂｙＮＴＧｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆＡ２ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｉｎｏｕｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ.ＴｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｆｒｏｍｅｎｚｙｍｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅꎬｅｘｏｇｅｎｏｕｓｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒＡ２－４５３ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎ￣ｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｆｏｕｎｄａｔ６０ｈꎬｔｈｅｂｅｓｔｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉ￣ｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｉｎｏｕｒｓｔｕｄｙｗｅｒｅｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｓｏｙｂｅａｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｕｎｉｔｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ４２％ｂｙｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ.ＫｅｙＷｏｒｄｓ:ＫｅｒａｔｉｎａｓｅꎻＮＴＧꎬＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓꎻＥｎｚｙｍｅＡｃｔｉｖｉｔｙꎻＣａｒｂｏｎＳｏｕｒｃｅꎻＮｉｔｒｏｇｅｎＳｏｕｒｃｅ基金项目:国家重点研发计划(２０１７ＹＦＢ０３０８４００－０１－０５)作者简介:刘文龙(１９８２－㊀)ꎬ男ꎬ工程师ꎬ硕士ꎬ研究方向为酶制剂生产与开发ꎮ㊀㊀羽毛废弃物是养殖业中一种重要副产物ꎬ其富含高浓度的蛋白质ꎮ近年来ꎬ我国养殖业和屠宰业蓬勃发展ꎬ期间产生了大量的副产物ꎬ而这些废弃物不仅造成资源的巨大浪费ꎬ而且污染环境ꎮ羽毛废弃物中各类氨基酸齐全ꎬ含必需氨基酸ꎬ特别是含硫氨基酸含量特别高ꎬ因此对这类资源加以充分利用将是蛋白饲料非常重要的补充[１]ꎮ角蛋白被定义为是纤维蛋白ꎬ又被称作硬皮蛋白ꎬ是脊椎动物表皮或表皮附属物的主要成分ꎬ如表皮残留物㊁鬃毛㊁羽毛㊁毛发㊁指甲㊁喙㊁角㊁蹄㊁羊毛等ꎮ这种蛋白对于一些常见的蛋白酶如木瓜蛋白酶㊁胰蛋白酶和胃蛋白酶等㊁以及化学试剂㊁机械压力等都具有较高的抗性[２－４]ꎮ蛋白质中的二硫键是决定角蛋白抗性和稳定性的关键因素[５]ꎮ角蛋白酶是唯一可以降解这些复杂结构蛋白的蛋白酶ꎬ因此角蛋白酶以环保友好方式进行生物转化的优势ꎬ在家禽㊁皮革工业㊁氨基酸㊁多肽以及可溶性蛋白等含角蛋白废物利用中具有重要的应用价值ꎮ角蛋白的降解已经广泛的应用于食品㊁饲料㊁化肥㊁化妆品㊁纺织和制药工业中[６]ꎮ目前已经商业化生产的角蛋白酶有Ｖｅｒ￣ｓａｚｙｍｅ㊁Ｖａｌｋｅｒａｓｅ㊁Ｐｒｉｏｎｚｙｍｅ和ＰＵＲＥ１００ꎬ这４种商品酶都是基于ＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＰＷＤ－１(ＫｅｒＡ)菌种来源蛋白基础上发展而来的[７]ꎮ另外ꎬ在其他菌种ꎬ如假单胞菌属㊁金黄杆菌㊁溶杆菌㊁涅斯捷连科氏菌㊁考克氏菌㊁微杆菌㊁寡养单胞菌㊁沙雷氏菌㊁热菌中也有发现产角蛋白酶[４ꎬ８]ꎮ也有报道称在嗜热菌和极端菌种如ꎬ闪烁杆菌属[９]㊁梭菌属[１０]㊁嗜热菌属[１１]ꎬ也有角蛋白酶产生ꎮ一些较有潜力的产角蛋白酶菌种有来源于链霉菌的放线菌和嗜热链球菌也已经被发现并报道[１２－１６]ꎮ尽管角蛋白酶具有巨大的生物技术应用潜力ꎬ但是产量低一直是限制角蛋白酶商业化的一大障碍ꎮ提高角蛋白酶的催化效率㊁表达量以及热稳定性对于其应用于工业化生产具有相当重要的影响[１７]ꎮ本文以一株实验室保存的高产角蛋白酶菌种为出发菌株进行ＮＴＧ诱变ꎬ然后从中筛选出酶活单位提高的菌株突变体ꎬ并对其进行发酵条件优化以最大程度的激发其产角蛋白酶的能力ꎬ从而为其应用于工业化大规模生产提供基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料１.１.１㊀菌㊀种Ａ２菌是作者所在实验室从沂水某养殖场处采取土样获得的一株产角蛋白酶地衣芽孢杆菌菌种ꎮ１.１.２㊀试㊀剂自制羽毛粉:新鲜的鸡羽毛充分洗干净ꎬ然后沸水煮２－３ｈꎬ然后用太阳晒干ꎮ晒干的羽毛粉碎得到的粉末用于做培养基成分ꎻ天蓝角蛋白㊁Ｔｒｉｓ㊁蛋白胨㊁酵母粉均购自上海生工生物工程有限公司ꎻ亚硝基胍(ＮＴＧ)ꎻ其他试剂均为分析纯ꎮ１.１.３㊀培养基种子培养基(ｇ/Ｌ):氯化钠１０ꎬ酵母粉５ꎬ蛋白胨１０ꎬｐＨ７.０ꎮ平板筛选培养基(ｇ/Ｌ):氯化钠１０ꎬ酵母粉５ꎬ蛋白胨１０ꎬ羽毛粉１０ꎬ琼脂粉２０ꎬｐＨ７.０ꎮ发酵基础培养基(ｇ/Ｌ):氯化钠０.５ꎬ六水氯化镁０.１ꎬ氯化钙０.０６ꎬ磷酸氢二钾１.４㊁磷酸二氢钾０.７㊁羽毛粉１０ꎬｐＨ７.０ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀菌种ＮＴＧ诱变将产角蛋白酶地衣芽孢杆菌菌株划线活化ꎬ３７ħ培养２４ｈꎬ挑取单克隆接种到种子培养基中ꎬ３７ħ培养至对数期ꎬ然后收集菌体ꎬ８０００ｒｐｍ离心３ｍｉｎꎬ用生理盐水洗涤菌体沉淀２次ꎬ最后用生理盐水重悬菌体至浓度为１０６－１０８ＣＦＵ/ｍＬꎬ并加入ＮＴＧ母液ꎬ使得最终浓度为２５０μｇ/ｍＬꎮ然后于３７ħ分别培养１０－６０ｍｉｎꎬ每隔１０ｍｉｎ取样一次ꎬ经适当稀释之后ꎬ取１００μＬ涂布于筛选平板上ꎬ计算致死率ꎮ致死率计算公式如下:致死率＝(Ａ－Ｂ)/Ｂˑ１００％式中Ａ代表经ＮＴＧ处理过平板上生长菌落数平均值ꎻＢ代表未经ＮＴＧ处理过菌涂布平板生长的菌落数平均值ꎮ１.２.２㊀诱变菌筛选初筛:对致死率在７０％－８０％的诱变菌种库进行筛选ꎮ采用平板筛选与９６孔板筛选结合的方式进行ꎮ将诱变好的菌种经特定稀释涂布在筛选平板上ꎬ３７ħ培养２４ｈꎮ根据透明圈大小及菌落形态变化挑取单克隆于装有ＬＢ液体培养基的９６孔板中进行活化培养ꎬ３７ħ培养２４ｈꎮ按照２％接种量将长好的种子液转接到含有发酵培养基的９６孔板中ꎬ３７ħ发酵培养７２ｈꎮ将发酵培养液进行离心处理ꎬ取上清ꎬ采用酶标仪进行酶活测定ꎬ９６孔板酶活测定方法参照文献[１８]ꎮ复筛:将９６孔板中筛选的酶活提高幅度比较明显的突变株ꎬ转接到摇瓶进行摇瓶扩大复筛验证ꎬ摇瓶发酵条件:装液量５０ｍＬ/５００ｍＬꎬ３７ħꎬ２４０ｒｐｍꎬ培养７２ｈ后进行酶活测定ꎮ将筛选出来的高产菌传代５次ꎬ并测定角蛋白酶活力ꎬ以验证该菌种的传代稳定性ꎮ１.２.３㊀酶活测定酶活测定方法及酶活单位计算参考文献[１９]１.２.４㊀发酵条件优化１.２.４.１㊀发酵时间对产酶影响发酵条件为初始发酵条件ꎬ培养基采用发酵基础培养基ꎬ３７ħ分别培养１２ｈ㊁２４ｈ㊁３６ｈ㊁４８ｈ㊁６０ｈ㊁７２ｈꎬ特定时间点取发酵液进行酶活检测ꎬ研究发酵时间对产酶的影响(实验组每组设置３个平行样)ꎮ１.２.４.２㊀外加碳源发酵条件采用１.２.４.１最佳条件ꎬ外源添加１％的葡萄糖㊁乳糖㊁蔗糖㊁淀粉㊁糊精ꎬ研究外源添加不同碳源对产酶的影响(实验组每组设置３个平行样)ꎮ１.２.４.３㊀外加氮源发酵条件采用１.２.４.２最优条件ꎬ外源添加１％的蛋白胨㊁酵母粉㊁豆饼粉㊁牛肉膏㊁硫酸铵ꎬ研究不同氮源对产酶的影响(实验组每组设置３个平行样)ꎮ２㊀结果与讨论２.１㊀Ａ２菌种ＮＴＧ诱变及筛选根据ＮＴＧ作用时间与致死率关系ꎬ选择致死率在７０％－８０％之间的诱变菌体库进行筛选ꎬ致死率满足７０％－８０％之间范围内其向正突变的几率较大[２０]ꎬ因此将诱变条件定为ＮＴＧ浓度为２５０μｇ/ｍＬꎬ诱变时间１０ｍｉｎꎮ将诱变后菌种经适当稀释后涂布在筛选平板上ꎬ３７ħ培养２４ｈꎬ根据透明圈的大小及菌落形态变化选择突变体进行筛选ꎮ通过９６孔板筛选ꎬ共筛选３５８７株突变体ꎬ酶活提高幅度大于５０％以上的突变株占３ɢꎬ其中酶活提高幅度最高的突变株为Ａ２－４５３酶活单位为３２４Ｕ/ｍＬꎬ比对照提高了１４４％ꎮ图１㊀ＮＴＧ处理时间与菌种致死率关系表１㊀Ａ２－４５３传代稳定性验证传代数角蛋白酶活力１(Ｕ/ｍＬ)角蛋白酶活力２(Ｕ/ｍＬ)角蛋白酶活力３(Ｕ/ｍＬ)平均值(Ｕ/ｍＬ)１３１７３２８３０９３１８２３１１３３８３０４３１８３３０１３３２３２７３２０４３２５３３７３１４３２５５３２８３０５３１３３１５从表中可以看出ꎬ高产菌Ａ２－４５３产角蛋白酶活力稳定ꎬ传代５次后ꎬ酶活与对照相比相差不大ꎮ２.２㊀发酵时间对Ａ２－４５３菌种产酶的影响图２㊀发酵周期对产酶的影响分别将Ａ２和Ａ２－４５３两个菌株活化后转接到发酵培养基中ꎬ每隔１２ｈ取样检测酶活单位数变化ꎮ摇瓶发酵液酶活检测发现ꎬＡ２－４５３菌种当发酵到６０ｈ时ꎬ酶活单位为３１６Ｕ/ｍＬꎬ发酵至７２ｈ时ꎬ酶活单位仅为３２０Ｕ/ｍＬꎬ与发酵６０ｈ相比酶活相差不大ꎮ怀疑是培养基中营养成分耗尽ꎬ代谢产物积累过多对细胞产酶造成负面影响ꎬ亦或是因为代谢产物对细胞产生反馈抑制对细胞产酶进行负调控ꎬ从而不再产酶ꎮ因此将最优发酵时间定为６０ｈꎮ２.３㊀外加不同碳源对Ａ２－４５３产酶的影响以发酵周期为６０ｈ作为发酵终点ꎬ研究外源添加不同碳源对Ａ２－４５３菌种产酶的影响ꎮ结果显示ꎬ外源添加１％的葡萄糖对Ａ２－４５３产酶具有促进作用ꎬ比基础培养基提高了３２％左右ꎮ而其他碳源对其效果影响不明显ꎬ甚至有降低产酶的现象ꎮ葡萄糖作为速效碳源ꎬ可以促进菌体细胞的大量繁殖ꎬ从而提高整体产酶水平ꎮ而其他碳源需要先进行分解才能再被利用ꎬ大大降低了产酶的速率ꎮ图３㊀不同外源添加碳源对突变体产酶影响２.４㊀外加不同氮源对Ａ２－４５３产酶的影响以２.３最优发酵条件为基础ꎬ研究外源添加１％的不同氮源对Ａ２－４５３产酶的影响ꎮ结果显示ꎬ豆饼粉对于产酶具有促进作用ꎬ比对照组酶活提高了７％左右ꎬ其他几种氮源效果不是很明显ꎬ而蛋白胨㊁酵母粉反而使得产酶降低ꎬ检测发酵液ｐＨꎬ发现比对照组高ꎬ因此怀疑可能是因为原料消耗之后ꎬ体系中ｐＨ升高导致不适宜产酶ꎮ图４㊀不同外源添加氮源对突变体产酶影响结合以上几种条件ꎬ以发酵培养基配方(ｇ/Ｌ):氯化钠０.５ꎬ六水氯化镁０.１ꎬ氯化钙０.０６ꎬ磷酸氢二钾１.４㊁磷酸二氢钾０.７㊁羽毛粉１０ꎬ葡萄糖１０ꎬ豆饼粉１０ꎬｐＨ７.０进行发酵验证ꎬ发酵周期为６０ｈꎬ最终酶活单位能够达到４４８Ｕ/ｍＬꎬ比未优化之前提高了４２％ꎮ３㊀结㊀语ＮＴＧ是目前最有效ꎬ也是应用最广泛的化学诱变剂之一[２１]ꎮ对本实验室筛选的一株产角蛋白酶菌株Ａ２作为出发菌进行ＮＴＧ诱变ꎬ从中筛选出一株酶活提高１４４％的突变株ꎮ诱变之后的菌株表现出生长较快的生理变化ꎬ产酶大幅提高ꎮ根据菌种的特性ꎬ针对性的对其产酶时间㊁碳㊁氮源利用情况进行了发酵优化ꎮ葡萄糖㊁豆饼粉对其产酶具有较大的促进作用ꎬ根据最优条件进行发酵验证ꎬ整个酶活单位提高了４２％ꎮ其他一些发酵因素的优化可能会进一步的提高该菌的产酶能力ꎮ角蛋白酶现已广泛的应用于食品㊁饲料㊁化肥㊁化妆品㊁纺织和制药工业中[６]ꎮ但是现存的商业化用酶产量低㊁催化效率低㊁稳定性差等是限制其广泛应用的主要因素ꎮ因此ꎬ对现有产酶菌种进行优化及选育㊁对蛋白进行改造以及寻找可替代的菌种来生产角蛋白酶是现在的研究热点ꎮ本文通过对Ａ２菌进行诱变ꎬ得到一株酶活单位提高１４４％的突变株ꎬ并在此基础上进行发酵优化ꎬ酶活单位又提高了４２％ꎬ为该酶进一步的工业化应用研究提供了基础ꎮ参考文献[１]于晓鹏ꎬ赵新强.角蛋白酶研究进展[Ｊ].中国果菜ꎬ２０１５ꎬ３５(２):７７－８１.[２]ＣＯＵＬＯＭＢＥＰＡꎬＯＭＡＲＹＭＢ. Ｈａｒｄ ａｎｄ ｓｏｆｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｄｅfiｎｉｎｇｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅfiｌａｍｅｎｔｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００２ꎬ１４:１１０－１２２.[３]ＫＯＭＩＬＬＯＷＩＣＺＫＴꎬＢＯＨＡＣＺＪ.Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎｗａｓｔｅ:ｔｈｅｏｒｙａｎｄｐｒａｃｔｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓ[Ｊ].ＷａｓｔｅＭａｎａｇｅｍｅｎｔꎬ２０１１ꎬ３１:１６８９－１７０１.[４]ＤＡＲＯＩＴＤＪꎬＮＤＥＬＬＩＡ.Ａｃｕｒｒｅｎｔａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓ[Ｊ].ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ.２０１４ꎬ３４ꎬ３７２－３８４.[５]ＴＡＫＡＨＡＳＨＩＫꎬＹＡＭＡＭＯＴＯＨꎬＹＯＫＯＴＥＹꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｒｍａｌｂｅｈａｖｉｏｒｏｆｆｏｗｌｆｅａｔｈｅｒｋｅｒａｔｉｎ[Ｊ].Ｂｉｏｓｃｉ￣ｅｎｃｅꎬＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００４ꎬ６８:１８７５－１７８１.[６]ＢＲＡＮＤＥＬＬＩＡꎬＤＡＲＯＩＴＤＪꎬＲＩＦＦＥＬＡ.Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ８５:１７３５－１７５０.[７]ＧＵＰＴＡＲꎬＳＡＲＭＡＲꎬＢＥＧＱＫ.Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓ:ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｔｅａｓｅｓｆｏｒｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ[Ｊ].ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１３ꎬ３３:２１６－２２８.[８]ＧＵＰＴＡＲꎬＲＡＭＮＡＮＩＰ.Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ:ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗ[Ｊ].ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００６ꎬ７０:２１－３３. [９]ＦＲＩＥＤＲＩＣＨＡＢꎬＡＮＴＲＡＮＩＫＩＡＮＧ.Ｋｅｒａｔｉｎｄｅｇｒａｄａ￣ｔｉｏｎｂｙＦｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓꎬａｎｏｖｅｌｔｈｅｒ￣ｍｏｐｈｉｌｉｃａｎａｅｒｏｂｉｃｓｐｅｃｉｅｓｏｆｔｈｅｏｒｄｅｒｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｌｅｓ[Ｊ].ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ６２:２８７５－２８８２.[１０]ＩＯＮＡＴＡＥꎬＣＡＮＧＡＮＥＬＬＡＦꎬＢＩＡＮＣＯＮＩＧꎬＢＥＮ￣ＮＯＹꎬＳＡＫＡＭＯＴＯＭꎬＣＡＰＡＳＳＯＡꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓｂｖ.ｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓｂｖ.ｎｏｖ.ａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔｏｒｇａｎｉｓｍｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｏｌｆａ￣ｔａｒｉｃｍｕｄｓ[Ｊ].ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００８ꎬ１６３:１０５－１１２.[１１]ＲＩＥＳＳＥＮＳꎬＡＮＴＲＡＮＩＫＩＡＮＧ.ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＴｈｅｒｍｏ￣ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓｓｐ.ｎｏｖꎬａｎｏｖｅｌｔｈｅｒｍｏｐｈｉ￣ｌｉｃꎬａｎａｅｒｏｂｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍｗｉｔｈｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ.２００１ꎬ５ꎬ３９９－４０８.[１２]ＮＯＶＡＬＪＪꎬＮＩＣＫＥＲＳＯＮＷＪ.ＤｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｎａｔｉｖｅｋｅｒａｔｉｎｂｙＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｒａｄｉａｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ１９５９ꎬ７７:２５１－２６３.[１３]ＳＺＡＢＯＩꎬＢＥＮＥＤＥＫＡꎬＳＺＡＢＯＩＭꎬｅｔａｌ.ＦｅａｔｈｅｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｗｉｔｈａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎ￣ｏｆａｃｉｅｎｓｓｔｒａｉｎ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０００ꎬ１６:２５３－２５５.[１４]ＳＹＥＤＤＧꎬＬＥＥＪＣꎬＬＩＷＪꎬｅｔａｌ.ＡｇａｓａｒＤ.Ｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｏｎꎬｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｕｌｂａｒｇｅｎｓｉｓ[Ｊ].ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ１００:１８６８－１８７１.[１５]ＩＧＮＴＯＶＡＺꎬＧＯＵＳＴＥＲＯＶＡＡꎬＳＰＡＳＳＯＶＧꎬｅｔａｌ.Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐａｒｔｉａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍａｗｏｏｌｄｅｇｒａｄｉｎｇｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃａｃｔｉｎｏｍｙ￣ｃｅｔｅｓｔｒａｉｎＴｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｃａｎｄｉｄｕｓ[Ｊ].ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ１９９９ꎬ４５:２１７－２２２.[１６]ＨＡＢＢＥＣＨＥＡꎬＳＡＯＵＤＩＢꎬＪＡＯＵＡＤＩＢꎬｅｔａｌ.Ｐｕｒｉfiｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｄｅｔｅｒ￣ｇｅｎｔ－ｓｔａｂｌｅｋｅｒａｔｉｎａｓｅｆｒｏｍａｎｅｗｌｙｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃａｃｔｉｎｏ￣ｍｙｃｅｔｅꎬＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａｋｅｒａｔｉｎｉｌｙｔｉｃａｓｔｒａｉｎＣｐｔ２９ｉｓｏｌａ￣ｔｅｄｆｒｏｍｐｏｕｌｔｒｙｃｏｍｐｏｓｔ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２０１４ꎬ１１７:４１３－４２１.[１７]ＦｅｎｇＺꎬＪｕａｎＺꎬＧｕｏｃｈｅｎｇＤꎬｅｔａｌ.Ｉｍｐｒｏｖｅｄｃａｔａｌｙｔ￣ｉｃｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙꎬｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙꎬａｎｔｉ－ｓａｌｔａｎｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｋｅｒａｔｉｎａｓｅＫｅｒＳＭＤｂｙｐａｒｔｉａｌｌｙｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｏｆＰＰＣｄｏｍａｉｎ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ６:２７９５３[１８]高静雷.定向进化技术提高枯草芽孢杆菌角蛋白酶活性研究[Ｄ].无锡:江南大学ꎬ２０１４.㊀[１９]ＣｈｅｎｇｇａｎｇＣꎬＢｉｎｇｇａｎＬꎬＸｉａｏｄｏｎｇＺ.ＫｅｒａｔｉｎａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｋｅｒａｔｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｂｙａｍｕｔａｎｔｓｔｒａｉｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ[Ｊ].ＪＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖＳｃｉꎬ２００８ꎬ９(１):６０－６７[２０]曲波.产酸性蛋白酶菌株的诱变育种研究[Ｊ].食品研究与开发ꎬ２０１５ꎬ３６(２０):１６９－１７３[２１]王付转ꎬ梁秋霞ꎬ李宗伟等.诱变和筛选方法在微生物育种中的应用[Ｊ].洛阳师范学院学报ꎬ２００２ꎬ２:９５－９９.。
蛋白酶产生菌的分离、鉴定及发酵条件研究
实验方案设计人：陈龙1．蛋白酶产生菌的分离1. 1 实验材料菌源：酱香型大曲1. 2 培养基的配制细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-25g、水1000ml；称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。
溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。
调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。
反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。
分装、包扎、灭菌。
霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1000ml；量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。
分装、包扎、灭菌。
产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g，酵母粉15g，K2HPO4 1.0g，Na2CO3 0.1g，自来水100ml PH 9.0（灭菌前）。
pH7．0。
配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。
选择培养基：豆粕粉10．0 g，琼脂15．0 g，蒸馏水1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌30 min。
固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。
筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。
1. 3 试剂和溶液1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃珠。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。
并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。
一株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化
作者简介： 崔洪霞 （ 】 ９ ７ ７ 一 ） ，女，黑龙江 尚志人，博： 士，副教授 ，主要研究方 向为微生物与生化药学，Ｅ ｍａ ｉ ｌ ：ｈ ｘ ｃ ｕ ｉ ＠ｙ ｓ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． Ｃ ／ Ｉ 。
一
株 高产碱性蛋 白酶海洋细菌 的筛选及 发酵条件 的优化
崔洪 霞 。 ’ ，李春 林 ，钱 龙 ，孙 滢 ，周艳艳 ，史云柯
（ １ ． 燕 山大学 环境 与化 学工程学 院，河北 秦 皇岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ；２ ． 河北省应用化 学重点 实验 室，河北 秦皇 岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ；３ ． 燕山大学 里仁学院 ，河北 秦皇 岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ）
酶 的 强 弱顺 序 为 ：ｐ Ｈ 值 、培 养 时 间 、接 种 量 、装 液 量 ，菌 株 Ｓ ＤＬ ９在 较 佳 发 酵 条 件 下 的发 酵 液 的 最 大 酶 活 力 达 １ ９ ７ ． ５ ８ Ｕ／ ｍＬ。本 研 究 表 明 从 秦 皇 岛海 域 可 以获 得碱 性 蛋 白酶 高产 菌株 ，丰 富 了菌 种 资源 。
关键词：碱 性蛋 白酶；筛选 ；海泥 ；菌株 Ｓ ＤＬ ９ 中图分类号：Ｑ９ ３ ９ 文献标识码 ：Ａ ＤＯＩ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ￣ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ７ — ７ ９ １ Ｘ ． ２ ０ １ ３ ． ０ １ ． ０ １ ５
０ 引言
近 年来 ， 碱 性蛋 白酶 由于与传 统 的化 学催化剂 相 比具有 催化 能力强 、底物专 一性 高等优 点，已被 广泛 应用于制 革 、银回收 、医药 、食 品、饲 料 、化 学工业 、废物 处理等生产 及行业 。其最 早发现 于 猪胰 脏 中， 而 １ ９ ４ ５年又 发现于地 衣芽孢 杆菌 中 ， 开辟 了微生 物碱性 蛋 白酶 的来源 。 在碱 性蛋 白酶的
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行：1.样品收集：从环境样品（如土壤、水样、发酵物等）中收集样品，注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。
2.分离菌株： a. 样品处理：将样品进行适当的稀释处理，以获得适量的单菌落。
b. 培养基选择：根据目标酶的特性，选择合适的培养基进行菌株分离。
常用的培养基有LB（大肠杆菌培养基）、TSA（琼脂糖营养平板培养基）等。
也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。
c. 接种和分离：将处理后的样品接种在选定的培养基上，并进行营养和环境条件的适当调整。
通过稀释分离法，将单菌落分离至不同的培养皿中，得到纯培养的菌株。
3.酶活性测定： a. 初步筛选：将分离的菌株进行初步筛选，通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。
b. 液体培养：将筛选出的菌株进行液体培养，收集培养物用于后续的酶活性测定。
c. 酶活性测定：通过适当的酶活性测定方法（如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等）来评估菌株的酶活性。
4.酶产量测定： a. 最优菌株筛选：根据酶活性测定结果，选择酶活性较高的菌株。
b. 酶产量测定：对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验，通过酶活性和菌体生长曲线的测定，估计菌株的酶产量。
5.菌株鉴定： a. 形态学特征：观察菌落的形态学特征，如形状、颜色、质地等。
b. 生理生化特性：进行生理生化测试，包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。
c. 分子生物学鉴定：通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因，进行菌株的分子鉴定，并与已知菌株进行比对。
这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。
根据筛选结果，选择高酶活性和高酶产量的菌株，可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。
在实践中，根据具体实验条件和要求，可能需要进行适当的优化和调整。
产中性蛋白酶工程菌的构建及其发酵条件的初步优化
Ｃｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｆ Ｆｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｃｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ Ｅｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ
Ｓｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｆ ｏ ｒ Ｐｒ ｏ ｄｕ ｃ ｉ ｎ ｇ Ｎｅ ｕｔ ｒ ａ ｌ Ｐｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ
１ ０ ０ ｍＬ ／ ５ ０ ０ ｍＬ、 摇床 转速 １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ 、 温度 ３ ４℃的 条 件 下发 酵 ４ ８ ｈ ， 发 酵液 的酶 活 力 可达 ２ ４ ８ ７ ． ５ Ｕ ／ ｍＬ ， 比优 化 前 提 高
了 ７ ８ ％．
关键词 ：中性蛋 白酶 ；枯草 芽孢 杆菌 ；工 程菌 ；发酵条件 中图分类 号 ：Ｑ７ ８ ６ 文献标 志码 ：Ａ 文章编号 ：１ ６ ７ ２ — ６ ５ １ ０ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ５ ０ ０ ０ ９ — ０ ５
摘
要 ：为构 建 １株产 中性蛋 白酶 的工程 菌株 并对其发酵条件进行优化 ， 以 中性 蛋 白酶工业生产菌株枯草 芽孢杆菌
ＡＳ １ ． ３ ９ ８的基 因组 为模 板 ， 采用 Ｐ Ｃ Ｒ 技 术 扩 增 获 得 中性 蛋 白酶 基 因 ｐ ｒ ， 与 高拷 贝 质粒 ｐ ＷＢ ９ ８ ０连 接 并转 入 蛋 白酶 缺
●
第 ２ ８ 卷
第 ５ 期
天 津科 技 大 学 学报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｔｉ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ＆Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｖｌ ０ １ ． ２ ８ ห้องสมุดไป่ตู้ Ｎ Ｏ． ５ Ｏｃ ｔ ． ２ ０１ ３
胃蛋白酶生产工艺
胃蛋白酶生产工艺胃蛋白酶是一种重要的消化酶，能够在胃部分解蛋白质，帮助人体消化吸收。
胃蛋白酶的生产工艺主要包括菌种培养、发酵、提取和纯化等步骤。
以下是一个简要的胃蛋白酶生产工艺的介绍。
首先，选择合适的菌种进行培养。
常用的菌种是产胃蛋白酶的细菌，如枯草杆菌属的嗜热枯草杆菌（Bacillus thermoproteolyticus），也可以使用其他蛋白酶产生菌株。
菌种的选取要考虑其产量、生长速度和酶活性等因素。
然后，进行菌种的发酵过程。
将菌种接种到培养基中，控制好发酵条件，使菌株充分生长和繁殖。
发酵过程中要注意控制温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进胃蛋白酶的产生。
接着，进行胃蛋白酶的提取。
发酵液经过离心分离，得到含有胃蛋白酶的上清液。
胃蛋白酶的提取过程中可能需要进行蛋白酶的激活或去除杂质等步骤，以提高酶的纯度和活性。
最后，进行胃蛋白酶的纯化和精制。
采用适当的分离技术，如层析、电泳等方法，将胃蛋白酶从提取液中分离出来，并去除其他成分和杂质。
纯化过程中要控制好条件，确保胃蛋白酶的纯度和活性。
在胃蛋白酶生产工艺中，需要重点考虑的因素有以下几点：1.菌种的选取和培养条件：选择产胃蛋白酶能力强、生长快速的菌株，并控制好培养基成分和发酵条件，以提高胃蛋白酶的产量和活性。
2.发酵条件的控制：控制好温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进菌株的生长和胃蛋白酶的产生。
3.提取和纯化工艺的选择：根据实际情况选择合适的提取和纯化方法，以最大限度地提高胃蛋白酶的纯度和活性。
4.产品的质量控制：对生产的胃蛋白酶进行质量检测和控制，确保产品的活性和纯度达到要求。
综上所述，胃蛋白酶的生产工艺包括菌种培养、发酵、提取和纯化等过程。
通过合理选择菌种和优化发酵条件，以及采用适当的分离和纯化技术，可以获得高纯度、高活性的胃蛋白酶产品。
2产蛋白酶菌株的筛选
1.牛奶平板培养基的配制及灭菌 牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨
固体培养基中添加终质量浓度为 1.5%的牛奶
2.倒平板
四、操作步骤
3.制备土壤悬液 4.涂布 5.培养 6.观察记录
五、注意事项
培养基灭菌条件的控制。
六、实验结果
将菌落计数结果记录于下表中。
七、思考题
1.在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小是否能作为 判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？为什么？ 2.简单设计一方案，从实验中初筛得到的产蛋白酶菌 落里获得某个碱性蛋白酶的高产菌株。
产蛋白酶菌株的筛选
一、实验目的
学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生 菌的方法。
二、实验原理
蛋白酶在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。 微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高， 适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业 性酶类。自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物 学的一项重要工作。 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其 菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的 比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
三、器材1.菌株 从自然界筛 Nhomakorabea获得的蛋白酶产生菌株 2.溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，
Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3.仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，培养摇
床，高压灭菌锅，直尺，玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤
蛋白酶产生菌细菌的分离与鉴定
蛋白酶产生菌细菌的分离与优化一、研究背景及进展蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。
皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。
蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。
临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。
加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。
二、实验方案1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株B1 分离自污水河的土壤；B9 为B1 物理诱变后所得的菌株。
1.1.2 药品弹性蛋白、刚果红弹性蛋白 Sigma 公司产品。
1.2 培养基1.2.1 细菌富集培养基(% W/V)蛋白胨1.0，酵母膏0.5，NaCl 1.0，pH7.0，121℃灭菌20min。
1.2.2 初筛培养基(% W/V)弹性蛋白0.80，葡萄糖0.10，酵母膏0.10，K2HPO4 0.10，KH2PO4 0.05，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，115℃灭菌30min。
1.2.3 发酵培养基(% W/V)干酪素3.00，葡萄糖4.00，玉米提取液0.1，K2HPO4，0.20，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，11℃灭菌30min。
1.3 胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法1.3.1 细菌富集培养称取土样1 g ，加入细菌富集培养基中，送摇床培养，150r/min，37℃培养48h。
同时做两个平行实验。
1.3.2 分离将富集土壤悬液按每级稀释10 倍的次序得到10－ 3、10 － 4、10 － 5 的系列稀释液，再依次分别从各稀释度试管中各吸取0.2ml 稀释液，加到相应的培养皿内，用涂棒涂匀。
每个稀释梯度做两个平行试验，3 7 ℃培养箱倒置培养48h。
土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化
土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【摘要】从海南土壤中筛选得到一株高产蛋白酶的菌株,并对其进行菌种鉴定、产蛋白酶发酵条件优化及蛋白酶分子质量测定.经筛选,得到一株高产蛋白酶的菌株,编号为CAUH83,蛋白酶活力达到126 U/mL.通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,鉴定菌株CAUH83为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens).通过单因素试验优化,确定该菌株产蛋白酶的最优发酵条件:大豆粉3.0％、蔗糖3.0％、初始pH 6.0、培养温度30 ℃、培养时间48 h.在此优化发酵条件下,该菌株产蛋白酶酶活力达到1 932.3 U/mL,较优化前提高15.3倍.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酶谱分析表明该蛋白酶分子质量约51 kDa.%A strain with high yield protease was isolated from soil sample of Hainan. The identification, fermentation conditions optimization and molecular mass of the strain were determined. After screening, a strain CAUH83 with high yield protease was obtained and the enzyme activity was 126 U/ml. Through morphological observation, physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis, strain CAUH83 was identified asSerratia marcescens. The optimal fermentation conditions were optimized by single factor experiments as follows: soybean flour 3.0％, sucrose 3.0％, initial pH 6.0, culture temperature 30 ℃ and time 48 h. Under the optimal conditions, the highest protease activity of the strain was 1 932.3 U/ml, which increased 15.3 times higher than that of before optimization. The molecular mass of the protease was about 51 kDa by SDS-PAGE and protease zymogram analysis.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】6页(P66-71)【关键词】粘质沙雷氏菌;筛选鉴定;蛋白酶;发酵条件优化【作者】耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学工学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083【正文语种】中文【中图分类】TS201.3蛋白酶(protelytic enzymes,EC 3.4)是催化肽键水解的一类酶,在食品、饲料、医药、化工等行业有着广泛的应用［1］。
产中性蛋白酶菌株的筛选及其发酵条件的优化
响，PB=0.33，PB=0.27 均大于 0.05，说明 B （发酵温 度）在 31~35℃范围内，C（麸皮含量）提取时间在
1.5％ ～2.5％ 内 ， 对 产 蛋 白 酶 无 显 著 影 响 。 由 于
பைடு நூலகம்
A2B3C3 不在正交试验安排之例，需对其验证，验证 结果表明，其提取率达 1 428.3 U/ml。
LIU Ting1，2，ZHANG Tian-bin2，LIN Yuan-shan2
（1. College of Oriental & Technology, HNAU, Changsha 410128, PRC; 2. College of Bioscience & Biotechnology, HNAU, Changsha 410128, PRC）
摘 要：从土壤样品中分离筛选出产一株中性蛋白酶产生菌 ZH-6。经单因子试验、正交试验表明，该菌株摇瓶发酵产酶的最佳
发酵周期 48 h，发酵温度 33℃，摇床转速为 180 rpm。最佳发酵培养基为玉米淀粉 2.0%，麸皮 3.0%，Na2HPO4·12H2O 0.4%，
KH2PO4 0.03%，ZnCl2 0.1%。起始 pH 6.5 的条件下，其酶活力为 1 428.3 U/ml。
1（31）
3（2.5）
8
3（56）
2（33）
1（1.5）
9
3（56）
3（35）
2（2.0）
k1
2 750.7
3 189.8
3 172.2
799.6 922.5 1 028.6 1 201.8 1 248.3 1 258.9 1 188.4 1 113.7 1 155.6 9 917.4
产弹性蛋白酶菌种的筛选及发酵条件优化研究
１２ ５ 基础发酵培养基 （ ） 于酪 素 ２５ ， ．． ％ ． ％ 葡萄糖
０５ ， 母 膏 ０２％ ， Ｐ ．％ ， ｇＯ ７ ２ ．％ 酵 ． Ｋ Ｈ Ｏ０ ２ Ｍ Ｓ ‘ Ｈ ０
００％ ｐ 、１ Ｈ值 ６ ０。 ．
产 ， 目前国内在这 方面 的研究 尚处于起 步 阶段 。微 但 生物发酵 生产 弹性蛋 白酶成本低 ， 产量大 ， 设备 利用率 高， 不受原料来源 的限制 。故筛 选 出一 种产 弹性 蛋 白
１２ ２ 初 筛 弹性 蛋 白平 板 （ ） 弹 性 蛋 白 ０ ８ ， ．． ％ ． 酵母
膏 ０ １ 葡萄糖 ０ １Ｋ Ｏ ，．５ １
ｐ Ｈ值 ７ ０ 琼 脂 ２ ０ ．， ．。 １２ ３ 斜 面培 养 基 及 分 离 平 板 （ ） 牛 肉膏 ０ ４ 蛋 ．． ％ ．，
１２ 培 养 基 和 培 养 方 法 ．
其在人们生活 中的应用 也越来 越广泛 。多年 的药理 、 临床证据表 明， 该酶对治疗 高血脂症 、 防治动脉粥样硬 化症疗效甚佳 。另外 ， 由于该酶 能够高 度专一 性地 水解结缔组织 中的胶原和弹性硬蛋 白而不 破坏其他成 分 ， 到 肉类软化 而不失 其 口味 的 目的而成 为一种理 达 想 的肉类嫩化剂 Ｊ因此 ， ， 在食 品工业 中也 有着广泛 的
应用前景 。
１２ １ 富 集 培 养 基 （ ） 弹 性 蛋 白 ０ ５ 酵 母 膏 ．． ％ ．，
０ ０ ， 萄 糖 ０ １ Ｋ Ｈ Ｏ０ １ Ｋ ２Ｏ ０ ０ ， ｇＯ ・ ．１葡 ． ， ２ Ｐ ． ， Ｈ Ｐ ４． ５ Ｍ Ｓ ４ ７
Ｈ， ． １ ｐ 值 ７ ０。 ０ ０ ０ ，Ｈ ．
维普资讯
第２ ４卷第 ６期 ２０ ０ ７年 １ ２月
产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化
产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【摘要】This research isolated protease-producing strain from cattle rumen,16 strains were selected by the casein hydrolysis bined HE value and protease activity,a strain(named A18)with the mighest activity of proteinase(415.82 U/mL)as the test strain.And it was identified as Aspergillusoryzae by morphological observation and 18S rDNA sequence analysis.We got the inoculation amount 4%,the optimum temperature 30 ℃,time 60 h through the single factor test.By th e response surface analysis(RSA)methods and repeated experiments,the optimal fermentation conditions were determined as follows:inoculation quantity 4%,temperature 29 ℃, time 55 h.The highest enzyme activity reached 527.57 U/mL,which increased by 22.6% than before optimization.%本试验菌源取自肉牛瘤胃液,首先用酪蛋白水解圈法初选出16株产蛋白酶菌株,综合HE值和蛋白酶活性,选出一株蛋白酶活性最高A18作为后续试验菌株,该菌株蛋白酶活为415.82 U/mL,通过形态和分子鉴定确定此菌株为米曲霉菌.单因素试验确定接种量为4%、培养温度为30℃、培养时间为60 h,通过响应面分析法及多次重复试验,得出接种量4%、温度29℃、时间55 h为其最佳产酶条件,最高酶活达527.57U/mL,比优化之前提高了22.6%.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2018(000)007【总页数】6页(P14-19)【关键词】蛋白酶;米曲霉;优化;响应面法【作者】王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;成都大帝汉克生物科技有限公司,四川成都611130;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S816.3蛋白酶存在于动物、植物、微生物中，属于水解酶类，约占世界酶制剂销量的60%（马俊阳等，2014）。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选背景蛋白酶是一种具有很广泛的应用价值的酶类。
由于其在消化道营养吸收、生物反应器中的转化作用等方面均有重要的作用，因此蛋白酶的产生与筛选已成为当今生物技术领域中的研究热点之一。
尤其是在食品加工、污水处理、纤维素生物降解等领域，蛋白酶都有着非常广泛的应用前景。
因此，本实验拟通过对产蛋白酶的菌株进行筛选，找到高产蛋白酶的优良菌株。
材料与方法菌株的采集菌株采集方法：在集中饮水供应点，选择自然生长的水上植物为采样点，如睡莲、菖蒲、兰草等，具体点位由实验组决定。
采用无菌削皮刀在水上植物上擦拭，将擦拭物用无菌三角板置于室温营养物培养基上慢慢离心直至血清澄清。
取尽可能大的好的菌落转入入液氮甘油管中，经深冷保存。
后选取筛选菌落接种于琼脂板上。
菌株的鉴定先用生化方法进行初步鉴定，包括观察菌落形态、氧化酶试验和嗜酸性染色，确定分离菌株的生物学特性。
然后利用API系统和Biolog系统对鉴定的菌株进行进一步的鉴定，最终确定其菌种身份。
菌株的扩增将选出的菌株接种到含有碳源和氮源的液体培养基中进行预培养。
在预培养的基础上，将菌株接种到不同浓度的含有特定碳源和氮源的液体培养基中进行再培养，测定培养基中蛋白酶活性及菌株生长情况。
选择生长良好、活性高的优良菌株进行扩大培养。
菌株蛋白酶活性的检测制备含有特定底物的琼脂板进行蛋白酶活性的检测，通过观察菌落周围的荧光带，判断菌株产生的蛋白酶活性。
结果与分析通过菌株采集、鉴定、扩增和蛋白酶活性的检测，找到了多个高产蛋白酶的优良菌株。
本实验通过对菌株的筛选，找到了高产蛋白酶的优良菌株，为蛋白酶的产生与研究提供了重要的参考。
产低温蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件
１ 材 料和 方 法
１１ 样 品采集 ．
２０ ０９年 １ ０月上旬于渤海秦皇岛海域东经 １９６ 北纬 ３ 。３附近 ， １。０ ， ９９ 采集海水样品共 ２ 份。 ０
１２ 培养基 ．
１２１ 营养琼脂培养基 牛肉膏 ５ ／ ， ．． Ｌ蛋白胨 １ ／ ， ２ ／ ， ｇ ０ｇＬ琼脂 ０ｇＬ作为菌体初筛和斜面菌种保藏用 。 １２２ 筛选培养基 葡萄糖 ０５ Ｌ Ｋ ２Ｏ ０５ｓＬ Ｋ Ｈ Ｏ ０５ｓＬ 酪蛋 白 １ ／ ， ．． ． ， Ｈ Ｐ ４ ． ／ ， ２ Ｐ ４ ． ／ ， ０ｇＬ 琼脂 ２ ／ ， ＯｇＬ 用于筛选蛋白酶产生菌。 １２ ３ 种子培养基 葡萄糖 ５ Ｌ蛋 白胨 １ Ｌ 。． ， Ｏ 。 １２ ４ 基础发酵培养基 葡萄糖 ０５ｇ Ｌ Ｋ Ｈ ０ ． ／ ， Ｈ Ｐ ４ ． ／ ， ．． ． ／ ， ２ Ｐ ４ ５ｓＬ Ｋ ２０ ５ｇＬ 蛋白胨 １ Ｌ ０ ０ Ｏ 。以上培 养基 ｐ ． ７４均用陈海水代替蒸馏水配制 ， １ Ｈ７２— ．， １ ℃灭菌 ３ ｉ。 ２ ０ｍｎ
１５ １ 培养时间对菌株产酶的影响 挑 １ ．． 环菌株接入种子培养基 ，８ ｍｎ 震荡培养 １ ， １０ ／ ｉ， ｒ ２ 以体积分 ｈ 数为 ００ 的菌液转接发酵培养基 ， ０ｒ ｉ， ．１ １ ｒｎ ２ ８ ／ ａ ５℃震荡培养 ， 分别培养 １ ，４３ ，８ ６ ， ， ２２ ，６ ４ ，０７ ｈ测定发 ２ 酵液中蛋白酶活力 。
株 Ｈ Ｍ．６ 初步鉴定 为黄 色杆菌属 ， Ｙ １， 设计单 因素和正交试 验 ， 确定该菌 的最 佳发 酵条 件。结果表 明， 在装液
量 ５ Ｌ ０ｍ 液体培养基 的 ２０ Ｌ三角瓶 中， ５ ｍ 以体积分数 ００ 的接种量、 ．１ 摇床转速 １０ｒ ｉ 条件下 ， ８ ｒｎ ／ ａ ２ ５℃培养
酸性蛋白酶菌株筛选及发酵条件优化
与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白.近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。李永泉等，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究.戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等，采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。2008年王云等，通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究，国内仅仅集中于凝乳酶和胃蛋白酶方面，有关真菌酸性蛋白酶的分子生物学研究报道很少。
1.研究意义
酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5〜5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000〜40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。细菌中尚未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。
2.方法
2.1原材料的获得
2.2土样处理：称取5g土样放入250mL三角瓶中加入葡萄糖5g,无菌水45mL, 150r/ min摇瓶培养24h。稀释平板:高氏一号合成培养基中放入重铬酸做抑菌剂,使其浓度为0. 005%,培养液用无菌水稀释至10- 3、10- 4、10- 5，做倾注培养,每份样品2个平皿,放入电热恒温培养箱,培养5-7 d。挑出单菌落,再接种到平板中进行划线分离,定期镜检观察,直至菌落特征和菌体特征均一,得到单一的菌落,从而进行下一步的鉴定。
环境中产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的优化
生物化工 Biological Chemical Engineering
文章编号：2096-0387（2019）06-0036-04
Vol.5 No.6 Dec. 2019
环境中产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的优化
刘静，刘张虎，张雨霏
（湖北大学知行学院，湖北武汉 430011）
1 实验材料
1.1 土壤样本及菌种 本实验所使用土壤样本采集自湖北大学知行学
作者简介：刘静（1980—），女，湖北鄂州人，硕士，讲师，研究方向：生物工程教育研究。
第2期
刘静等：环境中产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的优化
·37·
院周边，取样地主要为食堂排水渠污泥、餐馆垃圾处 2 实验方法
理处和学生公寓垃圾堆放处附近土壤。
司；胰蛋白胨（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限
将初筛所得菌株点样接种于酪素平板上，于 37℃
公司；酵母提取物 ( 分析纯 )：OXOID；葡萄糖、乳糖、 恒温培养箱中培养 24h 后挑选出 5 个透明圈与菌落
蔗糖（均为分析纯）：上海展云化工有限公司；果糖（生 直径比比值较大的菌株，接种于 50 mLLB 液体培养基
2.1 菌株富集与初筛
土壤样品中筛选得到并优化培养的菌株为一株
每 份 土 壤 样 品 加 入 无 菌 水 稀 释，取 稀 释 液 各
短杆细菌。 1.2 试剂
0.1 mL 均匀涂布于 LB 平板中，置于 37℃恒温培养箱 中培养 24 ～ 36h 后观察菌落生长状况，并挑选出清
干酪素、氯化钠（均为分析纯）：国药集团化学试 晰的单菌落在斜面培养基进行划线培养。将分离出
应用于环保行业中 [3]。 土壤中的微生物种类繁多，易于从中筛选出产蛋
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选组别：第*组班级：生工** 班组员：***指导老师：***一、实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌二、实验内容蛋白酶产生菌的分离三、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。
将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。
也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
四、实验材料和用具1.材料：土壤样品2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
五、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g ，蛋白胨 1g ，NaCl 0.5g ，琼脂 1.5 ～2.0g ，水 100ml ，pH 7.2配制 200mL奶粉培养基：牛肉膏0.5g ，蛋白胨 1g ，NaCl 0.5g ，琼脂 2.0g ，水 100ml ，pH 7.0 ～7.2脱脂奶粉 3g ，配制 200mL（二）分离1.采集土壤样品，用无菌水植被 1:10 土壤悬液。
2.取 1:10 土壤悬液 5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入 75～80℃水浴中热处理 10min 以杀死非芽孢细菌。
3.取加热处理过的土壤悬液 100～200μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～ 32℃下培养24～48h.4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺的研究_冯秀萍
SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺的研究_冯秀萍SUMO蛋白酶是一种重要的酶类，广泛应用于生物医学和生物工程领域。
因此，研究SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺对于提高SUMO蛋白酶的产量和纯度具有重要意义。
本文将结合已有的文献，对SUMO蛋白酶的生产和纯化工艺进行综述。
SUMO（Small Ubiquitin-like Modifier）蛋白酶是一类参与蛋白质修饰的酶，它通过与底物蛋白结合并结合底物蛋白，参与了调控多种细胞生物学过程，如DNA复制、DNA修复、染色质结构等。
因此，SUMO蛋白酶的产量和纯度直接关系到其功能的发挥和应用的效果。
SUMO蛋白酶的发酵工艺主要包括发酵条件的优化和基因工程菌的构建。
发酵条件的优化主要涉及培养基的优化、发酵温度和pH的调控以及酶基因表达的调控。
培养基的优化包括碳源、氮源、微量元素等营养物质的调配，以及添加适量的表达诱导剂。
发酵温度和pH的调控对于细胞的生长和酶的活性具有重要影响。
另外，酶基因的表达调控也是提高SUMO 蛋白酶产量的关键。
研究者可以通过构建高效的表达载体，包括选择适合的启动子、优化信号序列等方式来提高酶基因的表达水平。
SUMO蛋白酶的纯化工艺主要包括细胞破碎、蛋白质提取和纯化、SUMO酶的活性检测和纯化后的鉴定。
细胞破碎可以选择机械破碎、超声波破碎和动物细胞基因工程等方法。
蛋白质提取和纯化可以通过溶解、清除杂质、浓缩等步骤实现。
SUMO酶的活性检测可以采用多种色谱技术，如酶联免疫吸附测定、酶活性测定等。
纯化后的鉴定主要利用SDS-和质谱分析等方法。
研究SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺需要综合考虑多种因素，例如工艺参数的选择和调控，以及酶活性的检测和鉴定等。
此外，在研究过程中还要注意保护环境和提高产品质量。
因此，有关SUMO蛋白酶的发酵和纯化工艺的研究仍然具有重要意义。
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关 键词 ：蛋白酶；筛选；枯草芽孢杆菌；优化
中图分 类 号 ：Ｑ ９ ３ ９ ． ９ ７
文 献标 志 码 ：Ａ
文 章编 号 ：１ ０ ０ １ — ９ ６ ７ ７ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ７ — ０ ０ ６ ７ — ０ ４
Ｏｐ ｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ｏ ｆ Ｐｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ Ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ Ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｆｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｃｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ
第４ ２卷第 ７期 ２ ０ １ ４年 ４月
广
州
化
工
Ｖｏ １ ． ４ ２ Ｎｏ ． ７ Ａｐ ｒ ． ２ ０ １ ４
Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｃｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ Ｉ ｎ ｄ ｕ ｓ ｔ ｒ ｙ
蛋 白酶 产 生 菌 的 筛 选 及 发 酵 条 件 的 优 化
７ ５ ％为水解 酶类 ，蛋 白酶 为工业生产 酶三 大类 之一 ，其 市值 约 占总市值 ６ ５ ％＿ ４ Ｊ 。蛋 白酶存 在于所有生活有机休 中，因此 可从
１ ． １ 材
料
１ ． １ ． １ 菌种 来 源 本公 司分离鉴定保存 。
１ ． １ ． ２ 主要 试 剂
酵母 膏（ Ｂ Ｒ） ：英 国 Ｏ Ｘ Ｏ Ｉ Ｄ公司 ，胰蛋 白胨 （ Ｂ Ｒ） ：国药集 团化学试 剂 有 限公 司 ，脱 脂 奶粉 ：国药集 团 化学 试 剂有 限公
ｐｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｔ ｏ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕｃ ｅ ｐ ｏ ｌ ｙ—ｐ ｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ ． Ｂｙ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ ｅ ｄ ｓ ｉ ｆ ｔ ｉ ｎ ｇ ｓ ｏ ｆ ｂ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ，ａ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉａ ｒ ｌ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄｓ：ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ；ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎｉ ｎｇ；Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ；ｏ ｐ ｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
蛋 白酶是催化肤键水 解的一类 酶 ，广 泛存 在于动 物 ！植 物 和微生 物中 ，执行许 多不 同 的生 理功 能… 。蛋 白酶种类 的 多样 性 和水 解活性 的专一 性 ，使其在洗 涤剂 、食 品、皮 革 等工业 生 产领域 ，成为具有重要 商业价值 的工业用 酶 ；此 外 ，蛋 白酶在 基础研 究 中也有重要 地位 ，如可在肤 链合 成 Ｊ 、蛋 白质测序 中 运用 Ｊ 。据估 计 当 前 世 界 工 业 生 产 酶 市 值 １ ０亿 美 元 ，其 中
陈显玲
（ 燕京 啤 酒 （ 玉林 ） 有 限公 司 ，广 西 玉林 ５ ３ ７ ０ ０ ０ ）
摘 要 ：筛选 了植物蛋白加工用蛋白酶产生菌 ，为酶的分子改造和植物蛋 白加工提供材料基础。通过不同菌株筛选，获得
了一株蛋 白酶的高产菌株枯草芽孢 杆菌 Ｘ １ ２ 。经过 单 因子实 验 ，确 立 了产酶 的最适 培养 基配方 ：蔗糖 ７ ． ５ Ｌ，黄 豆粉 ６ ． ０ ｇ ／ Ｌ ，
Ｃ ＨＥＮ Ｘｉ ａ ｎ— — ｌ ｉ ｎ ｇ
（ Ｙ ａ ｎ Ｊ ｉ ｎ ｇ Ｂ ｅ ｅ ｒ（ Ｙ ｕ ｌ ｉ ｎ ）Ｃ ｏ ． ， Ｌ ｔ ｄ ． ， Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ Ｙ ｕ ｌ ｉ ｎ ５ ３ ７ ０ ０ ０， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｔ ｏ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｈ ｉ ｇ ｈ ａ ｎ ｄ ｗ ｅ ｌ ｌ ｄ ｅ ｉ ｆ ｎ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ—ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ，ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｃ ａ ａ ｎ ｔ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ
Ｍｎ Ｓ Ｏ ０ ． ０ ４ ｇ ／ Ｌ ，初始 ｐ Ｈ＝７ ． ０ ，装液量 ７ ５ ｍ Ｌ ／ ２ ５ ０ ｍ Ｌ 。结 论 ：按照所优 化的产酶条件 于 ３ ７℃ ，１ ８ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ ，经 ６ ０ ｈ 培养 ，发酵液 最终酶活达 １ ８ ６ ８ ． ４ ｕ ／ ｍＬ 。
ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ Ｘ１ ２ ｗａ ｓ ｆ ｏ ｕ ｎ ｄ ．Ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇ ｈ ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ—ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｔ ｅ ｓ ｔ ，ｔ ｈ ｅ ｂ ｅ ｓ ｔ ｆ ｏ ｒ ｍｕ ｌ ａ ｆ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ｓ ｕ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｔ ｕ ｍ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ ｗａ ｓ ｓ ｕ ｃ ｒ ｏ ｓ ｅ ７ ． ５ ｇ ／ Ｌ， ｓ ｏ ｙ ｂ ｅ ａ ｎ ｍｅ ａ ｌ ６ ． ０ ｇ ／ Ｌ，Ｍｎ Ｓ Ｏ４ ０ ． ０ ４ ｇ ／ Ｌ，ｐ Ｈ ７ ． ０，ｆ ｌ ｕ ｉ ｄ ｖ ｏ ｌ ｕ ｍｅ ７ ５ ｍＬ ａ ｎ ｄ ２ ５ ０ ｍＬ ．Ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ３ ７ ℃ ，１ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ａ ｎ ｄ ６ ０ ｈ，ｔ ｈ ｅ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍａ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｉ ｆ ｎ ａ ｌ ｆ ｅ ｍ ｅ ｒ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ ｒ ｅ ａ ｃ ｈ ｅ ｄ １ ８ ６ ８ ． ４ ｕ ／ ｍＬ ．