农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤

烟草农杆菌转化实验步骤1

烟草农杆菌转化实验实验配方：1LRMOP: 20×大量元素50ml200×微量元素5ml200×有机5ml200×铁盐5ml3%蔗糖30g0.8%琼脂（国产）4g/500ml灭菌后，每500ml培养基加入:0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μLYEB:液体培养基：1L酵母提取物1g牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4•7H2O 0.5gpH7.0 高压灭菌。

固体培养基：每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。

卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml利福平（Rif）储液：50mg/mlYEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。

一．农杆菌感受态细胞的制备（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。

二．质粒DNA导入农杆菌①电转法：1.取农杆菌感受态在冰上冻融；2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击；4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天；6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。

农杆菌侵染烟草原理

农杆菌侵染烟草原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种常见的细菌，它引起了许多植物疾病，并广泛应用于植物基因转化和构建转基因植物。

农杆菌感染的方式分为两个主要步骤：附着和转化。

首先，农杆菌通过其特殊的附着鞭毛附着在植物细胞的表面。

这些附着鞭毛具有与植物表面组织相互作用的能力，帮助菌体在细胞壁上定位。

然后，农杆菌进一步通过组成细菌群体的多聚糖特异性识别植物细胞并贴附在其表面。

这个过程涉及的多聚糖是菌体外表面中的一种多糖物质，称为Beta-1,2-葡聚糖。

该多糖与植物细胞表面的特定受体结合，使细菌固定在植物细胞表面。

接下来，农杆菌通过化学信号释放细菌表面小分子信号物质，称为诱导物质。

这些诱导物质与植物细胞的感受器相互作用，诱导植物细胞启动反响。

在感染过程中，农杆菌释放的Ti质粒在接触植物表面后激活，融入植物细胞胞质。

这个过程主要涉及到Ti质粒上的一些基因区域，称为过渡区，它负责将外源基因转移到植物细胞中。

接下来，T DNA被运送到植物细胞的细胞核中。

T DNA的传输过程主要受T基因（vir基因）的操控，这些基因编码用于T DNA传输的蛋白质。

一旦T DNA被引入细胞核，它会被整合到植物细胞的基因组中，并在细胞分裂过程中通过传代进行稳定遗传。

这个过程涉及到转座酶（T nase）等蛋白质的参与，它们帮助将T DNA插入植物基因组的特定区域。

总之，农杆菌侵染烟草的原理涉及一系列复杂的分子交互作用和基因调控过程。

通过附着、感染、引入TDNA以及其整合到植物基因组中，农杆菌成功地将外源基因引入烟草细胞，并构建转基因烟草。

这为基因工程研究和转基因植物生产提供了重要的工具和方法。

农杆菌转化实验步骤

农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化是一种常用的基因转移技术，可以将外源DNA导入植物细胞。

下面是农杆菌转化实验的基本步骤：
1. 制备农杆菌：首先，选择适合的农杆菌株，常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens。

接种农杆菌于适宜的培养基中，培养至合适的生长期。

2. 构建质粒：在进行转化实验前，需要构建包含目标基因的质粒。

质粒可以通过常规的分子生物学技术，如PCR扩增、限制性酶切和连接等方法来获得。

3. 准备细菌：将构建好的质粒转化到农杆菌中。

通常采用电穿孔或热激方法，使质粒能够进入农杆菌内。

4. 感染植物：选择适当的植物愈伤组织或幼苗作为接受体，将其暴露在含有农杆菌的培养基中。

农杆菌会侵入植物细胞，并将质粒转移
到植物基因组中。

5. 抗生素筛选：转化后的细菌通常在培养基中含有特定抗生素。

将被转化的植物细胞接种于含有抗生素的选择培养基中，该抗生素能够选择出已转化的细胞。

只有具备目标基因的细胞能够生长并形成抗性。

6. 再生植物：选定抗生素抗性的植物细胞，进一步培养和处理以促进其发育和增殖。

通过激素处理和适当的培养条件，可以使其分化成完整的植株。

7. 验证转化：最后，通过分子生物学技术，如PCR和Southern blot 分析，来确认转化的植物是否成功地获得了外源基因，以及其在植物细胞中的表达。

农杆菌转化实验是一种常用且有效的方法，可用于植物基因工程及改良研究。

通过以上步骤，可以成功将目标基因导入植物细胞中，以获得具有所需性状的转基因植物。

农杆菌注射烟草转化

农杆菌注射烟草实验步骤
农杆菌转化
1. 取1µl 质粒加入50µl 刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB 培养液，1.5ml 灭菌管，电击杯，移液枪，枪尖等）。

★感受态易失效，准备工作须充分
2. 吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡），放入电击仪（调manal 至1.6-1.7）。

3. 电击完立即加入1mlLB 培养基，混匀，并吸至新的离心管中。

4. 28℃，摇2h （过程中可以准备抗性板子，或提前准备）。

5. 涂板，（使用kan+rif 双抗板）28℃培养36h 。

6. 可做菌落PCR 检测是否转化成功，同时做菌种保藏（根据实验需要）。

接菌注射
1. 挑菌转接
3ml 双抗培养基，27℃摇菌过夜。

★玻璃试管摇菌效果要好些
2. 取20µl 菌液到20 mlLB 培养基中，（20mlLB + 100ml/L MES + 20µmol/L AS +500µlkana/L ）摇菌过夜至OD 值为1.0-1.5。

●不加Rif ★准备两份，最后调OD 值会用到。

3. 3560r/min ,10min 弃上清。

4. 配缓冲液MMA （H 2O+MES 10ml +MgCl 2 10ml +AS 1ml ）,现配现用。

用等量缓冲液重悬菌液。

一份等量，一份少量
5. 调菌液OD 值至1.0，室温放置1h 。

将需要混合的菌液等体积混合，可注射。

实验十八(1)农杆菌感染烟草叶片与共培养

4、 W5稀释液：125mmol/L CaCl2，155mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，5mmol/L葡萄糖，pH5.6。各组（4人）50ml 5、其他需要高压灭菌的用具同本实验。
其他需要高压灭菌的用具：
过滤器（2），注射筒（1），不锈钢网筛（=54m）（1），漏斗（1），三角瓶（5），滴管（10支），10ml刻度离心管（2支）。
四、步骤
1、农杆菌培养
（1）取新鲜菌落（液）于2ml YEB培养基（含50mg/L Rif、30mg/L Str 和50mg/L Kan）中，28 ℃下，180rpm震荡培养过夜。
（2）将2ml菌液转入20ml培养基（含50mg/L Rif、30mg/L Str 和50mg/L Kan）中，培养5~6 小时左右。
（3）菌液达到OD600＝0.2～0.5时用于转化。
2、感染
（1）取烟草幼叶，表面消毒（方法同上次实验），剪切成0.5~1.0cm-2大小。（2）将叶片放入菌液中，在80r/min摇床上旋转浸染5～10分钟。
3、共培养
（1）将叶片置于无菌滤纸上吸去多余的菌液。
（2）接种在MS培养基上（0.02mg／L NAA＋ 0.2mg／L BA），在25~28℃黑暗条件下共培养2~3天。每组接种20瓶。
（2）每3天更换一次培养基。培养条件同前。
下次实验准备（均高压灭菌）
1、CPW培养基+0.4mol/L甘露醇，pH 5.4，各组（4人）60ml，分装成10ml、10ml和20ml、20ml。 2、20％PEG600，0.06mol/L CaCl2，0.3mol/L甘露醇。各组（4人）20ml 3、1mol/L 甘氨酸-NaOH，pH10.0 。各组（4人） 10ml。

[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法

[植物科学领域]利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法Method for transient expression in vivo by infecting tobacco with Agrobacterium一、原理（Principle）烟草叶片的瞬时表达系统常用来进行基因的亚细胞定位监测，监测蛋白在细胞中分布的位置，从而对其功能进行预测。

通过基因翻译的蛋白与绿色荧光蛋白构成融合蛋白，在激光共聚焦仪器下观测绿色荧光的分布，判断蛋白表达的部位。

同时，还可根据荧光的光强度检测蛋白的表达量。

该过程是经根癌农杆菌介导的，进而将目的基因整合到到烟草的细胞内的。

Tobacco leaf transient expression systems are often used to monitor the subcellular localization of genes, monitor the distribution of proteins in cells, and predict their function. The gene translated protein and green fluorescent protein constitute a fusion protein. The distribution of green fluorescence is observed under a laser confocal instrument to determine the protein expression site. At the same time, the expression level of the protein can also be detected based on the light intensity of the fluorescence. This process is mediated by Agrobacterium tumefaciens, which integrates the gene of interest into tobacco cells.二、材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. MES: 2-(N-吗啉代)乙磺酸6. 抗生素7. 注射器Materials and reagents1. Agrobacterium strain carrying an expression vector (usually the expression vector is driven by the 35S promoter)2. Tobacco plants for 2-4 weeks3.LB medium4.Acetosyringone5.MES: 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid6.Antibiotics7. syringe三、仪器1. 50 ml 离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜Third, the instrument1. 50 ml centrifuge tube2. spectrometer3. UV lamp4. fluorescence microscope四、步骤1. 挑取单克隆于5 ml LB液体培养中，28~30°C震荡培养。

农杆菌侵染烟草原理

农杆菌侵染烟草原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种特殊的细菌，它能够侵染许多植物，将其基因组改变为自己的目的基因组，导致植物产生肿瘤和其他异常表型。

这种现象被称为植物农杆菌病（Agrobacterium tumefaciens），这种病在园艺学中非常重要，因为它是研究植物基因工程的基石之一。

在农杆菌侵染烟草的过程中，第一步是农杆菌识别和攀附植物细胞。

这是由于农杆菌的一个称为T介导的转移蛋白，该蛋白帮助农杆菌在植物细胞表面形成一个特殊的结构，称为T长度发生器（T-pilus）。

这个结构能够锚定农杆菌在植物表面并促进接触和进一步的识别。

接下来，农杆菌产生特殊的类EB（virulence）素，它是一种特殊的分子信使，这种信使能够刺激植物细胞对农杆菌的进一步感知。

类EB素结合到细胞表面的接收器上，这是植物生长激素的一个重要接受者。

一旦类EB素与植物细胞膜上的接受器结合，它会导致激活一系列的蛋白酶和磷酸酶，这些蛋白酶和磷酸酶控制细胞基因表达和突变。

类EB素还有能力诱导细胞分裂和增殖，这是导致肿瘤形成的关键步骤。

农杆菌还会在细胞表面释放和合成许多其它信使，例如放屈酸等酚酸类化合物。

当植物细胞对类EB素信号的响应被激活后，农杆菌便通过它的第二种转移蛋白，称为T-DNA转移蛋白，将它的DNA片段传入植物细胞中。

T-DNA片段是农杆菌基因组中的一个片段，包含一些促进肿瘤形成或生物合成其它类型激素的基因，也可以包含一些抗生素或草甘膦抗性基因。

这个T-DNA片段被农杆菌员工特殊的切割酶切割成几个区域，第一个区域包含向植物细胞转座所需要的转座酶和反转座酶基因，另外一个区域包含转录的启动子，可以在细胞中启动其它T-DNA区域的基因表达，一个区域包含蛋白合成序列，以及一个主要的T-DNA区域，它编码产生激素，激发植物细胞分裂和生长，产生肿瘤。

同时，农杆菌会生成一个称为细胞外多聚糖（EPS）的多糖复合物，它可以隐藏T-DNA 分子并保护它不被宿主植物细胞发现和破坏。

利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因

利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因一、实验目的蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。

可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。

二、实验原理烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。

但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。

用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。

为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。

三、实验试剂和仪器1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)3. MES / KOH(pH=5.6)4. 氯化镁5. 乙酰丁香酮6. 相应抗性的LB培养基四、实验步骤1、准备激活缓冲液配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。

使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。

2、挑克隆挑取重组农杆菌单斑接种于含有Kan (50 mg/l) 和Rif (50 mg/l) 抗性的LB 培养基中28℃过夜振荡培养；然后1:100转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期(OD600值约为0.6-0.8)，经6000 rpm离心5 min收集菌体3、制备菌液用含终浓度为10 mM MgCl2，10 mM MES (pH=5.6)，200 μM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.5或者根据需要调整；在室温下放置3 h以上。

烟草基因相互作用实验步骤

瞬时表达本实验室一般采用瞬时表达的方法研究两个基因是否有相互作用（如转录因子是否能够诱导相应基因的表达）。

1.培养室中种植小叶烟草（Nicotiana Ben？，俗称本氏烟草？），一般约一周后萌发，约一个半月后可以用于瞬时表达实验。

注意：小叶烟草的生长状态非常重要，直接决定了烟草瞬时表达实验的效果。

需要选取浓绿、厚实的叶片进行实验。

2.将需要检测的质粒分别转化农杆菌GV3101（庆大霉素抗性，50ug/ml；菌株不同，所对应的抗性也不同），在双抗板上生长两天后可以看到农杆菌菌落。

挑选单克隆，转接至0.5-2ml加有合适浓度双抗的LB液体培养基（离心管或者试管），28℃培养过夜，菌液PCR鉴定；转接生长良好的菌液至新的双抗LB液体培养基（试管或者锥形瓶），培养至OD600约0.6-0.8左右。

3.配制烟草瞬时表达的注射缓冲液，配方如下：0.5M MES 1ml20mM Na3PO4 1mlD-葡萄糖50mg1M 乙酰丁香酮1ul水（一般情况下最先加入）补齐至10ml注意：MES与Na3PO4溶液容易染菌，染菌后需要重新配制母液。

乙酰丁香酮需要用N-N-二甲基甲酰胺溶解后分装，尽可能避免反复冻融。

注射缓冲液需要现配现用。

4.将农杆菌菌液用EP管分装后3000rpm离心10分钟（4℃或者室温均可），去上清（尽可能清除干净）；利用注射缓冲液重悬后3000rpm离心10分钟，去上清，重复共两次。

注射缓冲液重悬。

5.利用步骤4中的农杆菌重悬液，配制不同的农杆菌组合，使农杆菌菌液的最终浓度达到OD600 0.1-0.5之间。

利用一次性注射器，将农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉，吸水纸吸去叶片表面多余的菌液，做好标记。

注意：（1）若需要观测蛋白的亚细胞定位，农杆菌菌液的浓度OD600在0.1左右会更好，浓度过高会导致背景信号强或者假象；检测样本与对照间的浓度要保持统一，比如35S::TF-A+ProB::GUS组合与ProB::GUS进行比较，两种注射液中ProB::GUS的浓度要相同；农杆菌OD600过高会导致叶片萎蔫死亡；（2）由于农杆菌菌液对叶片造成伤害，所以注射后一天内，叶片会较为萎蔫，再经过一段时间后会逐渐恢复正常。

农杆菌瞬时转化法

农杆菌瞬时转化法:一、本氏烟草的种植⑴配制基质中各成分比例如下,花卉营养土:蛭石:沙土=2:1:1，22℃16h/8h （光/暗）70%湿度（扣透明白盒2周保湿）⑵将基质浇透水后,烟草种子采用移液器点播在基质中,每盆播1，2粒种子,2-3天浇一次水。

二、农杆菌注射烟草叶片1、3周烟草(4 leaves stage)，选取生长状态良好，健壮的烟草叶片植株（年轻的、完全展开的4周大小）进行农杆菌侵染。

转化前将浇透水，转化后要控制浇水2、农杆菌准备:预培养：接种克隆至5ml LB+Antibiotics培养：用1mL预培养液接种至50ml LB+abtibiotics +Acetosyringon(final 20 µM)含Rif (100 mg/mL)、Str (100 mg/mL)和Kan (50mg/mL)三种抗生素的YEB液体培养基活化农杆菌（(GV3130)）。

检测菌液生长到指数后期 OD600=0.6，4000rpm，室温离心10min收获菌液3、配悬浊液:混匀后于4°C保存;4、重悬液（经常15ml）（10 mM MES-KOH，pH 5.6, 10 mM MgCl2, 100 μM acetosyringone乙酰丁香酮）重悬至OD600=1，（可以洗涤2次）5、同时也将同样培养的含有P19的农杆菌同样悬浮并调整悬浮液的浓度为OD600=16、根据实验设计,将以上三类农杆菌0.7:0.7:1.0体积混合,室温下静置3-4h，7、注射前烟草放在白色日光灯下1h，让气孔充分张开8、Agroinfiltration 注射：重悬菌体，用1 mL注射器（去针头）吸取菌液；避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，左手抵住叶片正面，右手轻轻将注射管口垂直压在叶片反面，右手拇指缓慢均匀用力推压，观察菌液在叶片表皮下缓慢移动，直至侵染整个叶片。

（一个植株可以注射2个叶片，不要用子叶）塑料薄膜覆盖，22℃、3天后撕取叶片下表皮于激光共聚焦显微镜下观察。

20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)

1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。

转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。

1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。

◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。

◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。

◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。

1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。

植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。

原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。

多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。

农杆菌转化的实验报告

一、实验目的1. 掌握农杆菌转化法的基本原理和操作步骤。

2. 将抗虫基因导入植物细胞，观察转化效果。

二、实验原理农杆菌转化法是一种将目的基因导入植物细胞的方法。

该方法利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）将目的基因转移到植物细胞中，并整合到植物细胞染色体DNA上，从而实现目的基因的遗传表达。

三、实验材料1. 植物材料：拟南芥种子、生长培养基、诱导培养基、选择培养基。

2. 农杆菌：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。

3. 抗虫基因：Bt基因。

4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶。

5. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素、CaCl2、DNA标记染料等。

四、实验步骤1. 目的基因克隆（1）设计引物：根据Bt基因序列设计一对引物，用于扩增Bt基因。

（2）PCR扩增：以Bt基因的DNA为模板，进行PCR扩增。

（3）克隆：将PCR产物连接到载体上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。

2. 农杆菌工程（1）制备感受态农杆菌：将根癌农杆菌接种于LB液体培养基，37℃培养过夜，按1:100的比例接种于新鲜的LB液体培养基，37℃培养3小时，加入IPTG和CaCl2，使农杆菌进入感受态。

（2）目的基因转化：将克隆有Bt基因的载体与感受态农杆菌混合，在冰浴中孵育30分钟，然后将混合液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

3. 植物转化（1）种子处理：将拟南芥种子用70%酒精消毒后，用无菌水冲洗干净。

（2）农杆菌感染：将处理好的种子接种于含有农杆菌的培养基上，28℃恒温培养3天。

（3）筛选转化植株：将感染后的种子接种于选择培养基上，筛选出转化植株。

4. 抗虫鉴定（1）PCR检测：提取转化植株的DNA，进行Bt基因的PCR检测。

（2）生物测定：将转化植株与抗虫性差的拟南芥进行抗虫性比较，观察转化植株的抗虫效果。

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。

2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。

1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。

3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。

28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。

用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。

转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。

4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。

（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。

2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。

3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。

4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。

5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。

花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。

农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤

农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤整理人：早熟组赵凤利一、准备试剂：1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na3PO4·12H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH2O至50ml。

1). 500 mM MES (Sigma)：4.88 g溶于50ml dH2O，保存于4℃2). 20 mM Na3PO4·12H2O (BDH)：0.38 g 溶于50ml dH2O，保存于4℃3). 1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于 -20℃。

二、实验步骤：1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD600值；注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。

6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0ml，OD600为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。

7.在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；11.侵染前，用记号笔标记待转区域；12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；14.将侵染后的烟草放回培养室15.2-3天后：1). 亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；2). 启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。

农杆菌污染问题经验之谈：来自丁香园,小木虫论坛[整理]

00农杆菌污染问题经验之谈：来自丁香园，小木虫论坛1.与农杆菌共培养后的愈伤组织最好用含头孢霉素500～700mg/L 的无菌水冲洗两三遍，然后用无菌吸水纸将洗液充分吸干（重要），再转到选择和除菌培养基上。

0002.在共培养时在愈伤与培养基之间垫上一层滤纸，这样可以减少菌的营养来源。

对抑菌起到一定的作用.003.用0.1M的灭菌甘露醇洗菌效果也可以4.我觉得以上的建议不大可行，我做过这样的实验，用抗生素的水溶液给他们洗澡，但是这种方法会严重刺激破坏幼嫩脆弱的愈伤组织，菌虽然抑制了，但是过一段时间愈伤表面会褐华接着枯黄死掉，建议就是不要让菌长起来，共培养的时候常观察，如有培养既有一点混浊，立即更换含抗生素的培养基，初始浓度要大一点。

一般在做转化实验之前应做一个正常叶片对卡纳和头孢的抗性实验，确定正常叶片的抗性临界值，然后再确定你要的浓度，繁琐的活，慢慢做吧。

另外转基因是个反复多次的过程，不要等上一次失败以后做坐下一批，应该是前仆后继的。

0005.1 一般共培养温度设置在20度，2 培养时间的问题，不能说限制在2天或者3天，而是要根据农杆菌感染的情况及时洗，换培养基感染状态，只要出现小的菌台，即可进行去除农杆菌处理，不能让它继续感染，不然菌台太大了0006.1.共培养温度有关系：依据经验，培养温度超过26度时，三天时间能够使农杆菌长出可见量；用20-23度即可。

2.共培养后入筛选培养时，用250--500mg/L的头孢是完全可以抑制住农杆菌的；如果用PPT作为筛选剂，头孢浓度宜高些。

3.共培养三天后，多洗几次。

00007.侵染前灭过菌的1.0M甘露醇洗愈伤,因为甘露醇是一种对细胞无害的渗透调节物质, 共培养完成后会有很多菌吸附在细胞表面,而这种浓度的甘露醇渗透压略大于细胞的胞内渗透压,使得胞内水分有外渗的趋势,有利于洗脱菌,就我的经验来说,等到明显看到菌长出来时,基本上可以放弃这一批材料了,另外,在我做草的转化时,浸染液的OD最好不超过0.3,不过不同的材料可能不同,因为不同的材料耐受抑菌抗生素的浓度不同,象我的草愈伤梭卞和头孢不能超过300,而有的材料可以用500,500的话肯定可以把浸染液的浓度提高点,这些你做多了自己可以慢满摸索出来一个适合你的材料的方法测一下菌的OD值，在0.4至0.6之间,用于侵染比较好0008.我们这（作物遗传改良国家重点实验室分子分室)技术很成熟，很少有农杆菌污染长起来的1.侵染时，悬浮培养基里不要接太多的农杆菌，2、愈伤在农杆菌悬浮培养基里放置时间最好为15-30分钟，不要太长，特别是对于粳稻，更是没有必要时间太长。

农杆菌介导的烟草转化

农杆菌介导的烟草转化农杆菌介导的烟草转基因技术一、实验目的了解转基因的基本原理及操作方法。

二、基本原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。

野生型农杆菌的Ti 质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。

农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。

我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

三、材料1、植物材料：烟草无菌苗2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121四、方法步骤1、试剂的配制（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂8g/L。

（2）液体MS/MT培养基PH：5.8-6.0 （3）烟草共培养培养基：固体MS培养基（4）烟草筛选培养基：MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖+ （400mg/L）头孢霉素+ （50mg/L）卡那霉素+ （7.5g/L）琼脂PH：5.8-6.0（5）烟草生根培养基：固体MS培养基2、农杆菌侵染菌液的制备方法：（1）超净工作台紫外灯灭菌15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用（2）铺皿：LB（50mg/L卡那霉素+25mg/L利福平）（3）划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字（4）封皿，做标记（5）28℃恒温培养1d-2d（6）用无菌刀刮取适量菌体于50mL液体MS培养基中，28℃，180r/min震荡培养1-2h至均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600值，用液体MS调整浓度至OD600值约为0.8-1.0为宜，备用。

烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用

烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用刘敏;顾志敏【摘要】[目的]获得高产量的烟草叶片原生质体.[方法]在前人的基础上,在酶浓度和酶解时间上,对简易大量制备本氏烟叶原生质体的条件进行了进一步的探索;并以此为基础,通过双分子荧光互补试验进一步研究了其在蛋白互作研究中的应用.[结果]在纤维素酶浓度为1.3％,离析酶浓度为0.4％,果胶酶浓度为0.3％,酶解4h,酶解温度28℃,并在简易纯化的条件下制备原生质体,所得到的完整原生质体产量最高,并且细胞碎片和杂质均最少.[结论]该方法为瞬时表达于本氏烟叶中的荧光蛋白研究提供了重要的技术参考.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)016【总页数】5页(P5002-5006)【关键词】烟草(Nicotiana benthamiana);原生质体制备;双分子荧光互补试验;蛋白互作【作者】刘敏;顾志敏【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004【正文语种】中文【中图分类】S572植物原生质体(protoplast)一词始自Hanstein，即指通过质壁分离，脱去细胞壁的细胞[1]。

细胞壁是植物细胞的围墙，用其相对坚固的结构包围着其内部的原生质体，保护和支撑着植物细胞，其主要成分为纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。

在原生质体的所有分离方法中，酶解法效果最佳[2]。

随着植物生物学的发展，原生质体已经越来越广泛应用于植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等研究领域[1]，是生理生化研究、基因表达调控研究、基因定位研究、细胞器制备、细胞融合和新品种培育等研究的理想材料[3]。

目前，原生质体在植物分子生物学领域应用非常广泛，其中就包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用研究。

亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。

例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。

GFP是绿色荧光蛋白，将所研究蛋白与GFP融合构建到一个同框阅读框内，然后转化到植物中，提取原生质体，在扫描共聚集显微镜的激光照射下观察绿色荧光信号，从而可以精确地定位蛋白质在细胞中的位置。

农杆菌侵染烟草原理

农杆菌侵染烟草原理
农杆菌是一种重要的植物病原菌，对烟草等植物的侵染具有很强的病原性。

其侵染烟草的原理主要有以下几个方面：
1. 构建T-DNA
农杆菌通过水平转移(plasmid)方式，将其含有的T-DNA转移到宿主细胞内。

T-DNA包含了多个基因，这些基因能够通过改变植物细胞的代谢和生长，从而使农杆菌得以侵染宿主细胞。

2. 激活植物细胞
T-DNA进入植物细胞后，由于其带有一个转录起始子，可以激活植物细胞的转录和翻译系统。

T-DNA序列会在宿主植物的基因组中插入，并产生一些蛋白质，例如植物生长激素和生长素，这些蛋白质会改变宿主植物的生长，从而使其更易受到农杆菌的侵染。

3. 抵抗机制
为了抵御农杆菌的侵染，植物细胞会产生一些反应，包括抗生素和抗菌蛋白，来抵抗农杆菌的入侵。

然而，农杆菌也会产生一些抗性基因，能够逃避植物细胞的抵抗，并使其成功侵染植物细胞。

总之，农杆菌通过构建T-DNA和激活植物细胞的生长和代谢，以及逃避植物细胞的抵抗机制，成功侵染了烟草等植物。

对于农业生产来说，防治农杆菌侵染十分重要，需要采取科学的防治措施。

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农杆菌瞬时转化法

农杆菌瞬时转化法:一、本氏烟草的种植⑴配制基质中各成分比例如下,花卉营养土:蛭石:沙土=2:1:1，22℃16h/8h （光/暗）70%湿度（扣透明白盒2周保湿）⑵将基质浇透水后,烟草种子采用移液器点播在基质中,每盆播1，2粒种子,2-3天浇一次水。

二、农杆菌注射烟草叶片1、3周烟草(4 leaves stage)，选取生长状态良好，健壮的烟草叶片植株（年轻的、完全展开的4周大小）进行农杆菌侵染。

转化前将浇透水，转化后要控制浇水2、农杆菌准备:预培养：接种克隆至5ml LB+Antibiotics培养：用1mL预培养液接种至50ml LB+abtibiotics +Acetosyringon(final 20 µM)含Rif (100 mg/mL)、Str (100 mg/mL)和Kan (50mg/mL)三种抗生素的YEB液体培养基活化农杆菌（(GV3130)）。

检测菌液生长到指数后期 OD600=0.6，4000rpm，室温离心10min收获菌液3、配悬浊液:混匀后于4°C保存;4、重悬液（经常15ml）（10 mM MES-KOH，pH 5.6, 10 mM MgCl2, 100 μM acetosyringone乙酰丁香酮）重悬至OD600=1，（可以洗涤2次）5、同时也将同样培养的含有P19的农杆菌同样悬浮并调整悬浮液的浓度为OD600=16、根据实验设计,将以上三类农杆菌0.7:0.7:1.0体积混合,室温下静置3-4h，7、注射前烟草放在白色日光灯下1h，让气孔充分张开8、Agroinfiltration 注射：重悬菌体，用1 mL注射器（去针头）吸取菌液；避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，左手抵住叶片正面，右手轻轻将注射管口垂直压在叶片反面，右手拇指缓慢均匀用力推压，观察菌液在叶片表皮下缓慢移动，直至侵染整个叶片。

（一个植株可以注射2个叶片，不要用子叶）塑料薄膜覆盖，22℃、3天后撕取叶片下表皮于激光共聚焦显微镜下观察。