农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
亚细胞定位之烟草转化方法
本氏烟草N. benthamian瞬时表达及相关实验方法：
一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：
A、实验步骤：
1、根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌;
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃,200rpm过夜;
估算时间,防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率;
3、当菌液OD值介于~之间时,1000g,5min离心收集农杆菌;
4、用2ml Induction medium without AS轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液;
5、重复步骤4;
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬;
7、室温放置1~4小时
8、测OD值,根据实验需要,配置侵染液组合详见下文;
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中;
使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染;
B、试剂：
Induction medium：
MES-KOH PH 10mM
MgCl210mM
AS 200uM
推荐提前配制母液
1M MES-KOH 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;
1M MgCl2 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;
AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌,分装避免反复冻融,-20℃;
用高压灭菌的超纯水稀释;
C、关于表达时间：
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射24小时之后到一周之内都会有表达;严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过;
烟草瞬时转化实验步骤
烟草叶片瞬时转化实验
试验方法
一、实验材料及药品
pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等
二、载体构建及农杆菌转化
烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备
1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株
2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）
3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）
4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：
0.5M MES 200ul 0.976g
1M MgCl2100ul 2.03g
100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）
灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）
四、操作步骤
1、农杆菌转化
2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）
3、确定不同农杆菌所加菌液的量：
计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600
OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。
烟草农杆菌转化实验步骤1
烟草农杆菌转化实验
实验配方：1L
RMOP: 20×大量元素50ml
200×微量元素5ml
200×有机5ml
200×铁盐5ml
3%蔗糖30g
0.8%琼脂（国产）4g/500ml
灭菌后，每500ml培养基加入:
0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL
1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μL
YEB:
液体培养基：1L
酵母提取物1g
牛肉膏5g
蛋白胨5g
蔗糖5g
MgSO4•7H2O 0.5g
pH7.0 高压灭菌。
固体培养基：
每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml
利福平（Rif）储液：50mg/ml
YEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
一．农杆菌感受态细胞的制备
（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；
（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；
（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；
（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；
（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。二．质粒DNA导入农杆菌
烟草农杆菌转化实验步骤1
烟草农杆菌转化实验
实验配方：1L
RMOP: 20×大量元素50ml
200×微量元素5ml
200×有机5ml
200×铁盐5ml
3%蔗糖30g
0.8%琼脂（国产）4g/500ml
灭菌后，每500ml培养基加入:
0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL
1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μL
YEB:
液体培养基：1L
酵母提取物1g
牛肉膏5g
蛋白胨5g
蔗糖5g
MgSO4•7H2O 0.5g
pH7.0 高压灭菌。
固体培养基：
每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml
利福平（Rif）储液：50mg/ml
YEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
一．农杆菌感受态细胞的制备
（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；
（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；
（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；
（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；
（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。二．质粒DNA导入农杆菌
烟草瞬时表达实验原理
烟草瞬时表达实验原理
利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。在荧光蛋白(YFP、GFP、Luciferase 等)的两个β 片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插
入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。
试剂：500 mM MES (pH5.6)、100 mM MgCl2、100 mM 乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、LB 培养基、50 mg/mL Kana (母液)、25 mg/mL Rif (母液)、100 mg/mL Amp (母液)。
仪器：一次性注射器、恒温摇床、分光光度计、普通离心机、激光共聚焦显微镜。
配方：500 mM MES (pH 5.6)：称取9.75 g无水MES，用去离子水溶解，经NaOH调pH至5.6，定容至100 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，于4 °C保存。100 mM 乙酰丁香酮：
称取0.196 g乙酰丁香酮，用5 mL DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再用去离子水定容至 10 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。50 mg/mL Kana (母液)：称取1 g的Kana粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。100 mg/mL Amp (母液)：称取2 g的Amp粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。25 mg/mL Rif (母液)：称取0.5 g的利福平粉末，用DMSO溶解并定容至20 mL，不需要过滤除菌，直接分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。100 mM MgCl2：称取1.0165 g的氯化镁六水（BBI: A610328），用去离子水溶解并定容至50 mL，于4 °C保存。100 mL浸染液：2 mL的500 mM MES + 0.15 mL 的100 mM AS + 10 mL 100 mM MgCl2，用去离子水溶解定容至100 mL即可。1 L的LB 培养基：5 g酵母提取物 + 10 g胰蛋白胨 + 10 g NaCl，相应的抗生素工作浓度为50 mg/L Kana、100 mg/L Amp和25 mg/L Rif (母液)。
烟草瞬时表达步骤 电子版
亚细胞定位准备(用烟草ck)
MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）
1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇
床20h至第四天早上；
2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床
培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；
4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，
室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；
5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析
所用试剂：
1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）
1M Na2PO4 11.54ml
1M NaH2PO4 8.46ml
Add ddH2O TO 200ml
2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)
0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml
10% SDS 2ml
0.5M EDTA(Ph8.0) 4ml
Tritonx-100 200ul
β-巯基乙醇 200ul
add ddH2O TO 200ml
121℃灭菌室温保存
3、gus蛋白分析buffer
烟草瞬时表达
MES溶液10 mmol MES, 10 mmol MgCl2，调整PH值到5.8
乙酰丁香酮0.1mmol/l 取0.018g用DMSO溶解
1.准备好12-15天的烟草（本生烟），
2.培养农杆菌200rpm 28c 12-16h
3.离心收集菌块2ml 3000g 3min
4.加500ul MES 重悬菌块避光室温（25C)静置3-4h
5.取20ul+180ul MES 测OD600值
6.加MES 稀释到OD600浓度为1（加1‰乙酰丁香酮）
7.利用注射器将稀释液注射到嫩叶内，使叶体浸润整块叶片
8.浸润后48h-72h用激光共聚焦显微镜观察
9.如需要DAPi染色细胞核，用10nm的dapi稀释1000倍，注射到烟草细胞内，避光培养3-4小时后用激光共聚焦显微镜观察
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种常见的细菌，它引起
了许多植物疾病，并广泛应用于植物基因转化和构建转基因植物。
农杆菌感染的方式分为两个主要步骤：附着和转化。
首先，农杆菌通过其特殊的附着鞭毛附着在植物细胞的表面。这些附
着鞭毛具有与植物表面组织相互作用的能力，帮助菌体在细胞壁上定位。
然后，农杆菌进一步通过组成细菌群体的多聚糖特异性识别植物细胞
并贴附在其表面。这个过程涉及的多聚糖是菌体外表面中的一种多糖物质，称为Beta-1,2-葡聚糖。该多糖与植物细胞表面的特定受体结合，使细菌
固定在植物细胞表面。
接下来，农杆菌通过化学信号释放细菌表面小分子信号物质，称为诱
导物质。这些诱导物质与植物细胞的感受器相互作用，诱导植物细胞启动
反响。
在感染过程中，农杆菌释放的Ti质粒在接触植物表面后激活，融入
植物细胞胞质。这个过程主要涉及到Ti质粒上的一些基因区域，称为过
渡区，它负责将外源基因转移到植物细胞中。
接下来，T DNA被运送到植物细胞的细胞核中。T DNA的传输过程主
要受T基因（vir基因）的操控，这些基因编码用于T DNA传输的蛋白质。
一旦T DNA被引入细胞核，它会被整合到植物细胞的基因组中，并在
细胞分裂过程中通过传代进行稳定遗传。这个过程涉及到转座酶（T nase）等蛋白质的参与，它们帮助将T DNA插入植物基因组的特定区域。
总之，农杆菌侵染烟草的原理涉及一系列复杂的分子交互作用和基因调控过程。通过附着、感染、引入TDNA以及其整合到植物基因组中，农杆菌成功地将外源基因引入烟草细胞，并构建转基因烟草。这为基因工程研究和转基因植物生产提供了重要的工具和方法。
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
整理人：早熟组赵凤利
一、准备试剂：
1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；
2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na
3PO
4
·12H
2
O 原液，5ul 1M 乙
酰丁香酮原液，加dH
2
O至50ml。
1). 500 mM MES (Sigma)：4.88 g溶于50ml dH
2
O，保存于4℃
2). 20 mM Na
3PO
4
·12H
2
O (BDH)：0.38 g 溶于50ml dH
2
O，保存于4℃
3). 1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于 -20℃。
二、实验步骤：
1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；
2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；
3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；
4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；
5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD
600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD
600
值；
注：如果悬浮菌液的OD
600
值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。
6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0
ml，OD
600
为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；
如：需要OD
600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD
600
=0.4，则最终悬浮
农杆菌注射烟草转化
农杆菌注射烟草转化
编辑整理：
尊敬的读者朋友们：
这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（农杆菌注射烟草转化）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为农杆菌注射烟草转化的全部内容。
农杆菌注射烟草实验步骤
农杆菌转化
1. 取1µl 质粒加入50µl 刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB 培养液，1.5ml 灭菌管,电击杯，移液枪，枪尖等）.★感受态易失效，准备工作须充分
2.
吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡)，放入电击仪（调manal 至1。6—1。7）。 3.
电击完立即加入1mlLB 培养基，混匀，并吸至新的离心管中。 4.
28℃,摇2h （过程中可以准备抗性板子，或提前准备)。 5.
涂板，(使用kan+rif 双抗板）28℃培养36h 。 6. 可做菌落PCR 检测是否转化成功,同时做菌种保藏（根据实验需要）.
接菌注射
1. 挑菌转接3ml 双抗培养基，27℃摇菌过夜。★玻璃试管摇菌效果要好些
2. 取20µl 菌液到20 mlLB 培养基中，(20mlLB + 100ml/L MES + 20µmol/L AS
+500µlkana/L ）摇菌过夜至OD 值为1.0-1.5.●不加Rif ★准备两份，最后调OD 值会用到。
3. 3560r/min ，10min 弃上清.
实验七 农杆菌介导法转化烟草
实验七 农杆菌介导法转化烟草
一、实验目的
（1）了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤。
（2）掌握遗传转化的基本操作技术。
二、实验原理
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
三、材料、器材与药品
1、材料
烟草、LBA4404菌株质粒载体为pBi121
2、器材
摇床、超净工作台、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、打孔器、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。
3、药品
MS培养基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、琼脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、6-BA、IAA。
四、实验步骤
1、根癌农杆菌质粒的保存：
构建好的根癌农杆菌质粒接种在 YEP 固体培养基上，YEP 固体培养基的成分为每100ml含NaCl 0.5g、酵母 1g、水解酪蛋白 1g、琼脂 1．5g、pH7．0。在冰箱中冷藏，一个月换一次培养基，保证菌种正常生长。
烟草瞬时表达
烟草瞬时表达
（1）挑起单个农杆菌菌落，接种到3ml LB液体培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜。
（2）将上述过夜培养菌液在常温，4000r下离心2min，收集菌体。
（3）用渗透培养液( 10 mmol MgCl2 )重新悬浮沉淀的农杆菌细胞（一般需要1~1.5mL渗透培养液）。调节浓度OD600至0.5~1.0 (可大概估计)。
（4）烟草植株无一定大小要求，一般4~5叶期，已经生长一个月左右的本氏烟比较合适，注射前要充分吸水30min使其气孔张开，然后用1mL的无针头的注射器吸取悬浮有农杆菌的渗透培养液从烟叶背面注入叶片内。
（5）将处理过的烟草放回培养室，照常管理。
（6）制片，观察叶背面荧光表达情况。
[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法
![[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法](https://img.taocdn.com/s3/m/e8c47eb56f1aff00bfd51e41.png)
[植物科学领域]利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法
Method for transient expression in vivo by infecting tobacco with Agrobacterium
一、原理（Principle）
烟草叶片的瞬时表达系统常用来进行基因的亚细胞定位监测，监测蛋白在细胞中分布的位置，从而对其功能进行预测。通过基因翻译的蛋白与绿色荧光蛋白构成融合蛋白，在激光共聚焦仪器下观测绿色荧光的分布，判断蛋白表达的部位。同时，还可根据荧光的光强度检测蛋白的表达量。该过程是经根癌农杆菌介导的，进而将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
Tobacco leaf transient expression systems are often used to monitor the subcellular localization of genes, monitor the distribution of proteins in cells, and predict their function. The gene translated protein and green fluorescent protein constitute a fusion protein. The distribution of green fluorescence is observed under a laser confocal instrument to determine the protein expression site. At the same time, the expression level of the protein can also be detected based on the light intensity of the fluorescence. This process is mediated by Agrobacterium tumefaciens, which integrates the gene of interest into tobacco cells.
实验十八(1)农杆菌感染烟草叶片与共培养
下次实验准备（均高压灭菌）
1、CPW培养基+0.4mol/L甘露醇，pH 5.4，各组 （4人）60ml，分装成10ml、10ml和20ml、20ml。 2、20％PEG600，0.06mol/L CaCl2，0.3mol/L甘 露醇。各组（4人）20ml 3、1mol/L 甘氨酸-NaOH，pH10.0 。各组（4人） 10ml。
国庆节期间进入实验室安排： 10月1日，10月3日，10月5日上午9： 00~11：00李老师在实验室，其他时间 来实验室找同学开门。
祝同学们： 节日快乐！
四、步骤
1、农杆菌培养
（1）取新鲜菌落（液）于2ml YEB培养 基（含50mg/L Rif、30mg/L Str 和50mg/L Kan） 中，28 ℃下，180rpm震荡培养过夜。
（2）将2ml菌液转入20ml培养基（含50mg/L Rif、30mg/L Str 和50mg/L Kan）中，培养5~6 小时左右。
（3）菌液达到OD600＝0.2～0.5时用于转化。
2、感染
（1）取烟草幼叶，表面消毒（方法同上次实 验），剪切成0.5~1.0cm-2大小。 （2）将叶片放入菌液中，在80r/min摇床上旋 转浸染5～10分钟。
3、共培养
（1）将百度文库片置于无菌滤纸上吸去多余的菌液。
（2）接种在MS培养基上（0.02mg／L NAA＋ 0.2mg／L BA），在25~28℃黑暗条件下共培 养2~3天。每组接种20瓶。
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种特殊的细菌，它能够侵染许多植物，将其基因组改变为自己的目的基因组，导致植物产生肿瘤和其他异常表型。这种现象被称为植物农杆菌病（Agrobacterium tumefaciens），这种病在园艺学中非常重要，因为它是研究植物基因工程的基石之一。
在农杆菌侵染烟草的过程中，第一步是农杆菌识别和攀附植物细胞。这是由于农杆菌的一个称为T介导的转移蛋白，该蛋白帮助农杆菌在植物细胞表面形成一个特殊的结构，称为T长度发生器（T-pilus）。这个结构能够锚定农杆菌在植物表面并促进接触和进一步的识别。
接下来，农杆菌产生特殊的类EB（virulence）素，它是一种特殊的分子信使，这种信使能够刺激植物细胞对农杆菌的进一步感知。类EB素结合到细胞表面的接收器上，这是植物生长激素的一个重要接受者。
一旦类EB素与植物细胞膜上的接受器结合，它会导致激活一系列的蛋白酶和磷酸酶，这些蛋白酶和磷酸酶控制细胞基因表达和突变。类EB素还有能力诱导细胞分裂和增殖，这是导致肿瘤形成的关键步骤。农杆菌还会在细胞表面释放和合成许多其它信使，例如放屈酸等酚酸类化合物。
当植物细胞对类EB素信号的响应被激活后，农杆菌便通过它的第二种转移蛋白，称为T-DNA转移蛋白，将它的DNA片段传入植物细胞中。T-DNA片段是农杆菌基因组中的一个片段，包含一些促进肿瘤形成或生物合成其它类型激素的基因，也可以包含一些抗生素或草甘膦抗性基因。这个T-DNA片段被农杆菌员工特殊的切割酶切割成几个区域，第一个区域包含向植物细胞转座所需要的转座酶和反转座酶基因，另外一个区域包含转录的启动子，可以在细胞中启动其它T-DNA区域的基因表达，一个区域包含蛋白合成序列，以及一个主要的T-DNA区域，它编码产生激素，激发植物细胞分裂和生长，产生肿瘤。
利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因
利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因
一、实验目的
蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。
二、实验原理
烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌
T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到
p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。
三、实验试剂和仪器
1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)
2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)
3. MES / KOH(pH=5.6)
4. 氯化镁
5. 乙酰丁香酮
6. 相应抗性的LB培养基
四、实验步骤
1、准备激活缓冲液
配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。
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农杆菌侵染烟草叶片表皮
细胞实验步骤
This manuscript was revised on November 28, 2020
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
整理人：早熟组赵凤利
一、准备试剂：
1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；
2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na
3PO
4
·12H
2
O 原
液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH
2
O至50ml。
1). 500 mM MES (Sigma)：4.88 g溶于50ml dH
2
O，保存于4℃
2). 20 mM Na
3PO
4
·12H
2
O (BDH)：0.38 g 溶于50ml dH
2
O，保存于4℃
3). 1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于 -20℃。
二、实验步骤：
1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；
2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；
3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；
4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；
5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD
600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD
600
值；
注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。
6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0 ml，OD
600
为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；
如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。
7.在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；
8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；
9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；
10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；
11.侵染前，用记号笔标记待转区域；
12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中
13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；
14.将侵染后的烟草放回培养室
15.2-3天后：
1). 亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；
2). 启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。
参考文献：Nature Protocols, 2006: 2019-2025.