2010CB530100-重要病毒的入侵机制研究

项目名称：重要病毒的入侵机制研究

首席科学家：胡勤学中国科学院武汉病毒研究所起止年限：2010年1月-2014年8月

依托部门：中国科学院

一、研究内容

【拟解决的关键科学问题】

以冠状病毒科、黄病毒科和疱疹病毒科中的代表病毒HCoV-HKU、JEV和HSV为主要研究对象，通过对I、II、III型病毒入侵机制的比较研究，发现其共性或规律，为设计相对广谱的抗病毒入侵药物提供新思路，是病毒病防治的重大需求。本项目将集中解决如下关键科学问题：

（1）病毒包膜蛋白-细胞受体相互作用的分子机制。

（2）病毒包膜蛋白变构诱导病毒-细胞膜融合的机理及其抑制。

其学术内涵包括：

1、HCoV-HKU、JEV等的入侵受体尚未确定

冠状病毒HCoV-HKU的入侵受体尚未确定；黄病毒JEV、疱疹病毒HSV在不同细胞上可以与不同细胞表面分子结合，但有些只是吸附因子而不是入侵受体。发现HCoV-HKU、JEV的细胞受体及研究受体的分子识别机制对于研究病毒包膜蛋白与细胞受体相互作用、病毒内化及病毒膜-细胞膜融合的分子机制等具有重要意义。而且，阐明这些科学问题将有助于揭示HCoV-HKU、JEV、HSV为代表的I、II、III型包膜病毒的入侵机制及规律，并为药物设计和新型疫苗研制提供科学依据和突破口。

2、HCoV-HKU、JEV、HSV病毒内化和病毒-细胞膜融合的机制仍不清楚

HCoV-HKU、JEV和HSV病毒内化、病毒膜与细胞膜融合等过程的分子机制均不清楚。除以上共性问题外，有待回答的问题还包括：（1）HCoV-HKU：尚无HCoV-HKU敏感细胞系；HCoV-HKU S 蛋白的激活方式及介导病毒入侵途径不明确；HCoV-HKU S 蛋白的抗原特性及病毒中和抗体表位尚有待研究。（2）JEV：对包膜蛋白中决定细胞、组织嗜性和毒力的相关位点不明确；对JEV入侵初始靶细胞、入侵抗原提呈细胞及入侵血脑屏障的分子机制均不清楚。（3）HSV：其入侵是通过4个病毒包膜蛋白gB、gD、gH、gL与细胞膜或内体膜蛋白相互有序的协同作用实现的。gD 是主要的受体结合蛋白，是HSV入侵的重要决

定因素。尽管其胞外结构域晶体结构已经解析，但对受体选择使用的机制仍然了解甚少；gB 有可能在融合中起关键作用，但仅有gB是不能完成HSV膜融合的；gH、gL在所有疱疹病毒中高度保守，并且对病毒的入侵与膜融合是必需的；目前对病毒入侵过程中gB、gD、gH、gL如何协同作用还不清楚。

3、HCoV-HKU、JEV、HSV包膜蛋白与受体互作的结构基础和入侵抑制仍是未知领域

HCoV-HKU S 蛋白、JEV E 蛋白和HSV gB、gD、gH、gL蛋白是病毒入侵的关键蛋白，除对gD、gB胞外结构域晶体结构进行了解析外，对HCoV-HKU S 蛋白、JEV E 蛋白和HSV gH、gL蛋白的结构仍不了解，也尚无针对HCoV-HKU、JEV、HSV的入侵抑制剂。揭示以上包膜蛋白与受体互作的结构基础将为药物和疫苗设计提供理想的靶位点。

【研究内容】

1、病毒的细胞受体及受体介导的内化

1.1、HCoV-HKU入侵受体、靶细胞入侵途径的研究

由于缺少细胞培养模型，HCoV-HKU侵染和致病机制的研究受到很大的局限。我们将通过建立多种假病毒系统，结合膜蛋白荧光差异2D技术分析A549、NIH-3T3等细胞膜蛋白的差异点，用标记及磁珠免疫共沉淀的方法，寻找与冠状病毒S蛋白和/或与其粘附相关的分子（如HLA-Cw0702）相互作用的病毒细胞受体或辅助因子，并确认这些蛋白的功能及与S蛋白相互作用方式。

包膜病毒结合相应受体后，可以直接和细胞膜融合（如HIV），也可以经内化后与胞内体进行膜融合（如流感病毒，HIV）。有些冠状病毒采用直接膜融合途径，而有些冠状病毒采用胞内体膜融合途径。本课题将对HCoV-HKU的膜融合途径进行详尽的研究。

1.2、JEV病毒受体分子的发现与确定

JEV能够感染多种细胞系，我们将综合采用生物化学和病毒学方法，针对不同的细胞模型，采用亲和纯化、cDNA文库或表型缺失文库来进行选择性的筛选。同时，将通过受体重建等多种途径和方式来确定所发现的病毒受体分子的功能特征。

1.3、JEV 入侵中枢神经系统的分子机制

JEV是具有代表性的脑炎病毒，且有成熟的细胞和动物模型，我们拟以已有的JEV 强、弱毒株为模式病毒，在动物模型上，从体内层面研究病毒内化途径和诱导神经损伤的信号传递机制，以期揭示JEV的致病机理，为解析其它脑炎病毒如西尼罗河病毒等类似科学问题提供参考。

1.4、PI3K信号在HSV入侵中的作用

PI3K信号通路能影响多种细胞内的转运过程，包括物质分选、小泡形成（包括自噬体形成）和运送、膜融合等，在埃博拉病毒、流感病毒等的内化及复制过程中起重要作用。我们将研究PI3K-Akt信号通路在HSV感染早期的作用及病毒感染对PI3K信号通路的影响；确定PI3K-Akt信号通路在HSV膜融合及入侵过程起作用的主要下游效应蛋白，最终阐明HSV所利用的完整的PI3K信号通路及其作用。

2、病毒包膜蛋白及其介导的膜融合机制

2.1、HCoV-HKU S蛋白酶解激活机制研究

I型包膜病毒的融合蛋白前体一般需要酶解切割才能被激活而发挥膜融合功能。一些病毒包膜蛋白的酶解激活发生在向细胞表面的转运过程中，比如流感病毒HA和逆转录病毒的Env；而另外一些病毒膜蛋白的酶解激活则发生在病毒入侵靶细胞的过程中，比如埃博拉病毒和SARS-CoV。SARS-CoV S蛋白在病毒颗粒表面为未切割的三聚体，结合细胞受体后S蛋白可能发生构象改变，可以被组织蛋白酶L（cathepsin L）切割而被激活。HCoV-HKU S 蛋白包含前体蛋白转化酶Furin切割位点，成熟的HCoV-HKU S蛋白可能在分泌途径中被Furin样宿主蛋白酶裂解。进一步深入研究HCoV-HKU S蛋白酶解激活途径是探讨病毒入侵机制的关键环节之一。

2.2、JEV膜融合过程中E蛋白的结构与功能、E蛋白毒力相关位点的研究

利用膜融合细胞模型和定点突变技术，研究和发现JEV E蛋白介导膜融合的关键位点或决定因子，同时以制备的构型依赖的E蛋白单克隆抗体，研究E蛋白在病毒融合过程中的构象变化；在利用生物信息学预测的基础上，利用假病毒和人工突变技术，构建JEV E 蛋白突变子，并在不同组织、细胞上验证其细胞和组织嗜性，初步确定与病毒组织、细胞嗜性相关的功能位点；利用反向遗传学，构建JEV不同突变株，在细胞和动物活体水平上进